培養細胞におけるミトコンドリアカルシウム取り込みを測定するためのカルシウム注入アッセイ

内膜ミトコンドリアユニポーター複合体を介したサイトゾルカルシウムイオンのミトコンドリア取り込みは、その機能にとって重要です。

ミトコンドリアカルシウム流入を測定するには、ウェルの底にECMコーティングされたカバーガラスを含むマルチウェルプレートから始めます。線維芽細胞懸濁液をカバーガラスにプレートし、細胞をECMに接着させます。

不活性なエステル化赤色蛍光カルシウム感受性色素と緑色蛍光ミトコンドリア選択性色素を含む色素混合物を追加します。色素分子が細胞性質ゾルに入るようにインキュベートします。

ミトコンドリア感受性色素は、その膜を通して選択的に拡散し、ミトコンドリアマトリックスに局在します。カルシウム感受性色素は、ミトコンドリアとミトコンドリア外の空間全体に広がります。ミトコンドリア内腔内では、内因性エステラーゼが赤色色素からエステル部分を切断し、ミトコンドリア内に閉じ込められたままの膜不透過性の赤色蛍光色素を放出します。

界面活性剤を含む透過処理溶液を加えます。低濃度では、界面活性剤分子は細胞の原形質膜コレステロールを制限的に溶解し、ミトコンドリアを無傷のままにし、カルシウム感受性色素分子が細胞質から漏れる空間を作り出します。これにより、カルシウム感受性の赤色蛍光色素とミトコンドリア特異的緑色蛍光色素がミトコンドリアに選択的に保持されます。

カバーガラスを共焦点顕微鏡に固定されたイメージングチャンバーに移し、カルシウム含有バッファーを加えます。透過処理された細胞内で、ミトコンドリアに局在するカルシウムを示す、共局在した赤と緑の蛍光を示す領域を見つけます。赤色蛍光は徐々に増大し、進行性のミトコンドリアカルシウム取り込みを示しています。

20マイクロリットルのRhod-2 / AM、0.2マイクロリットルのMitoTracker Green、2.5マイクロリットルの20%プルロニックF-127、および1ミリリットルのTyrode溶液を混合して、Rhod-2 / AM-MitoTracker Green作業溶液を調製します。NIH 3T3細胞をプレーティングした事前に調製したカバーガラスに、Rhod-2 / AM-MitoTracker Green溶液を覆うまで滴下添加します。細胞に色素をロードするには、カバーガラスを室温で30分間光から保護してインキュベートします。

Rhod-2/AMを脱エステル化するには、Rhod-2/AM-MitoTracker Green溶液をそっと取り除き、約300マイクロリットルの新鮮なTyrode溶液と交換して細胞を覆います。光から保護したカバーガラスを室温で30分間インキュベートします。

次に、カバーガラスを顕微鏡イメージングチャンバーに移し、チャンバーに洗浄液を入れます。焦点を調整して、細胞と位相差を40倍の倍率で観察します。