3の幼虫分節神経の可視化 ^RD齢ショウジョウバエ幼虫準備

軸索輸送は、幼虫の分節神経を視覚化することで研究できます。3齢のdrosophilaを用います。まず幼虫を解剖し、視葉、腹側神経節、および分節神経を損傷しないようにしてCNSを露出させます。

手順の第2ステップは、ホルムアルデヒドでlavaを固定し、その後、一次抗体で一晩、次いで二次抗体で暗所にて1時間インキュベートすることです。その後、lavaをガラススライドに封入し、軸索輸送の欠損を確認します。タンパク質の局在および分布は、免疫蛍光顕微鏡を用いて観察できます。

この手法は軸索輸送に関する知見を提供できるだけでなく、シナプスや筋肉の形態などの他の系にも適用可能です。一般に、この手法に不慣れな方は、許容範囲内での解剖を行うこと、特に脳の分節神経や筋肉を無傷に保つことが当初は困難であるため、苦労することがあります。本手順を開始するために、1倍解剖緩衝固定液、1倍PBT、および5%BSA溶液を準備してください。

解剖前に提示した表に詳しく記載されている通り、解剖を開始するために、清潔な5番二尖鑷子（しつし）1組、直線刃のファンシザー（静脈剪刀）1組、およびピンを用意します。マイクロスポーンを使用して、特定の遺伝子型を持つ3齢幼虫をペトリ皿に回収します。その後、脱イオン水を満たしたペトリ皿の中で幼虫をすすぎ、すべての餌を除去します。

次に、幼虫を背側を上にしてSガードディッシュの上に置きます。幼虫の前端と後端をピンで固定します。ピンで固定した幼虫の上に、微細剪刀を用いて1回使い切りの解剖緩衝液を1滴滴下します。

後端近くの背側正中線にある幼虫を挟みます。ハサミを使用して、後端から前端に向かって幼虫の角質層を切開します。切開した幼虫の上に、1×解剖バッファーを1滴滴下します。

ピンを用いて、幼虫の中央付近にあるクチクラの側縁の一方を持ち上げ、別のピンでクチクラを固定します。クチクラのもう一方の側縁についても同様に行い、図に示すように各側面に2本ずつのピンを使用します。次に、腸、脂肪体、気管を慎重に取り除き、2つの視葉と腹側神経節を持つ脳のみを残します。

分節神経を固定した状態で、幼虫をガードディッシュに付着させたまま、次いで固定および抗体染色を行います。解剖した幼虫を50 µLの固定液中で30分間インキュベートします。固定後、15分ごとに固定液を交換し、1倍のPBTで30分間幼虫を洗浄します。

10分ごとに緩衝液を交換する際、幼虫が常に緩衝液に浸っている状態を維持することが重要です。一次抗体溶液は、5%BSA溶液で適切な濃度に希釈して調製します。最適濃度は抗体によって異なります。

プラスチック製のディッシュに水で濡らしたキムワイプを敷き、加湿チャンバーを作成します。PBTの1回前のタイミングで、新しいものに交換してください。

調製した一次抗体溶液で洗浄し、加湿チャンバー内にて4°Cで翌日まで一晩インキュベートします。1×PBTを用いて、10分ごとにバッファーを交換しながら、解剖した幼虫を30分間洗浄します。二次抗体を5%BSA溶液で適切な濃度に希釈し、調製します。

一部の二次抗体は光に敏感であるため、加湿チャンバーをアルミホイルで包みます。幼虫を二次抗体溶液中で25°Cで1時間インキュベートします。二次抗体によるインキュベートが完了したら、1×PBTで30分間幼虫を洗浄します。この際、10分ごとにバッファーを交換してください。その後、解剖した幼虫をスライドにマウントし、可視化します。

図に示すように、カバーガラスが載るのに十分な間隔を空けて、スライドの中央にマニキュアで2本の垂直線を引いてスライドを準備します。マニキュアが完全に乾くまで待ちます。この画像に示すように、スライド上の垂直なマニキュアの線に挟まれたスペースに、封入バッファーを1滴滴下します。

スライドを封入する準備が整いました。最後のPBTから1回分（1 time）の時間が経過した後、幼虫を回収します。洗浄し、幼虫から側方ピンを慎重に取り除きます。

キューティクルを破らないように注意しながら慎重に操作してください。残りのピン2本を取り除き、ピンセットで幼虫をすくい上げて、準備したスライドグラスの上に置きます。幼虫が反転していないことを確認し、腹側を向けて配置してください。

スライドを上向きにした状態で、そっとカバーグラスを載せ、ここに示すように爪用ポリッシュで縁を封印します。これで、蛍光顕微鏡による幼虫の観察準備が整いました。この代表的な画像は、シナプス小胞タンパク質であるシスチンストリンタンパク質に対する抗体で染色した野生型幼虫のものです。

lava節的神経は均一に染色されています。ここでは、運動タンパク質の変異体lavaをCSPに対する抗体で染色しました。節的神経には、CSPで強く染色される大規模な蓄積が見られます。

この手順を行う際は、脳に付着している分節神経を保持し、筋肉を損傷させないようにすることが重要です。このビデオを視聴することで、解剖方法について十分に理解できるはずです。免疫染色を固定した3番目の個体を用い、蛍光顕微鏡で軸索輸送を研究するために幼虫の分節神経を抽出してください。