Name: 3の幼虫分節神経の可視化 RD齢ショウジョウバエ幼虫準備 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-09-29T17:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 18 s
Description: 学ぶショウジョウバエ3齢幼虫の分節神経可視化法。免疫蛍光顕微鏡を用いて軸索輸送メカニズムを解析し、野生型と変異体の比較を通じて神経機能の理解を深めます。

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SGは、ニューヨーク州立大学バッファロー校からとJohn R. Oishei財団からの資金によってサポートされています。

1。試薬の調製<ol><li> 、4MMのCaCl 2、4mmののMgCl 2、2mMの塩化カリウム、5mMのHEPESおよび36mmのスクロース、128 mMのNaClを用いて1 ×解離バッファーを準備します。 7.2〜ソリューションと殺菌フィルターPH。 </li><li> 16％ホルムアルデヒドおよび1x解離バッファーの1:1希釈を使用して固定液を準備します。 </li><li> 1Xリン酸を用いて1 × PBTを準備する生理食塩水（PBS）は1:100の比率では7.2とトリトンX - 100のPHでバッファ。 </li><li> 1X PBSでアジ化Naは0.01％（BSA）牛血清アルブミン5％を準備します。 </li></ol> 2。解剖のための準備<ol><li> Sylgardの料理は、解剖のために使用されます。シャーレにSylgard 184シリコーンエラストマーベースと硬化剤の混合物を注ぐことで料理を準備します。混合物が完全に使用する前に固化し、乾燥することができます。 </li><li>解剖する前に、第5位鉗子、ストレートブレードのvannasのはさみのクリーンペア、およびピンのきれいなペアを集める。 </li></ol> 3。第3齢幼虫の解剖<ol><li>ペトリ皿の上に特定の遺伝子型の第3齢幼虫をさまよう収集する。 </li><li>食べ物を取り除くために脱イオン水に幼虫を洗ってください。 </li><li>背側の上で、sylgard皿上に幼虫を置きます。その前部と後部両端の幼虫をピン。 </li><li>ピン幼虫で1 ×解離バッファのドロップを置きます。細かいハサミのニップの後端に近い背側正中線上に幼虫を使用した。はさみを使用して、後端から前端まで幼虫のクチクラをカット。 </li><li>解剖幼虫の上に新たな1 ×解離緩衝液のドロップを置きます。ピンを使用して、幼虫の中央付近にキューティクルの一側縁部を選択し、キューティクルをピン。図に示すように、別のピンを使用して、キューティクルの第二の側縁部を固定。 2本のピンをそれぞれの側面で使用されています。下の図を参照してください。 </li><li>慎重に接続されている分節の神経を持つ2つの光のローブと腹側神経節だけで脳を残して、腸、脂肪体、および気管を取り外します。手順の残りの部分はsylgard皿上で行われます。 </li></ol> 4。ディテールに秘められた幼虫の固定<ol><li> 15分ごとに修正を置き換えることで、30分の修正で切除した幼虫をインキュベートする。 </li><li>固定後、10分ごとにバッファを置き換えることにより、30分間× 1 PBTの幼虫をすすいでください。幼虫は、常にバッファ内でなければならないことに注意することは重要です。 </li></ol> 5。ディテールに秘められた幼虫の抗体染色<ol><li> 1X PBTのNaアジドと、5％BSAで適切な濃度に希釈して一次抗体を準備する。最適な濃度は、種々の抗体に異なります。 </li><li>最後の1X PBTは、準備一次抗体溶液で洗浄し、4℃で一晩湿気チャンバー内でインキュベート交換してください。湿気の多い室は水に浸した金 - ワイプとプラスチック皿を並べることによって構築されています。 </li><li>翌日、10分ごとにバッファを置き換えることにより、30分間× 1 PBTで切除した幼虫をすすいでください。 </li><li> 1X PBTのNaアジドと、5％BSAで適切な濃度に希釈することにより、二次抗体を準備し、時間25℃で二次抗体溶液との幼虫をインキュベートする。二次抗体が敏感な光であるため、光を防止するために箔で湿度の高い室を包みます。 </li><li>インキュベーション後、10分ごとにバッファを置き換えることにより、30分間× 1 PBTの幼虫をすすいでください。 </li></ol> 6。マウントとディテールに秘められた幼虫の可視化<ol><li>スライド上に幼虫をマウントする前に、（図を参照）上に座るためにカバースリップのための十分なスペースと、途中でマニキュアの縦の二重線を分散することでスライドを準備。完全に爪がマニキュア乾かします。 </li><li>スライド上の縦のマニキュアの線（図を参照）との間のスペースに取付バッファのドロップを置きます。スライドは、現在マウントするための準備ができています。 <img src="/files/ftp_upload/2128/2128.6.2.1.jpg" alt="図1 ステップ6.2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図1ステップ6.2"> <img src="/files/ftp_upload/2128/2128.6.2.2.jpg" alt="図2 ステップ6.2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図2ステップ6.2"></li><li>最後の1X PBTはリンスした後、静かに横方向のピンをはなします。キューティクルを引き裂くしないように注意してください。 </li><li>慎重に残りの2つのピンを削除し、ピンセットで幼虫をピックアップし、プレパラート上に水平に幼虫を置く。幼虫が裏返しと指向腹側が上されていないことを確認します。 </li><li>ゆっくりと上にカバースリップを置き、マニキュア液（図を参照）でエッジを封印。幼虫は蛍光顕微鏡下で可視化するための準備ができています。 <img src="/files/ftp_upload/2128/2128.6.5.jpg" alt="図1 ステップ6.5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図1ステップ6.5"></li></ol> 7。代表的な結果<img src="/files/ftp_upload/2128/2128fig1.jpg" alt="図1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図1"> 図1：野生型larvから幼虫の分節神経の代表画像（CSP、Zinsmaier ら、1994）シナプス小胞のタンパク質のシステインの文字列の蛋白質に対する抗体を用いた。分節性神経がスムーズに染色されることに注意してください。バー=20μmの<img src="/files/ftp_upload/2128/2128fig2.jpg" alt="図2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図2"> 図2：シナプス小胞のタンパク質のシステインの文字列の蛋白質 （CSP） に対する抗体を用いたモータータンパク質変異体の幼虫から幼虫の分節神経の代表的な画像 。分節性神経は、CSP（矢印）のために明るく染色大規模な集積を示すことに注意してください。

<ol><li>Gunawardena, S., Goldstein, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+Axonal+Transport+and+Neuronal+Viability+by+Amyoid+Precursor+Protein+Mutations+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Disruption of Axonal Transport and Neuronal Viability by Amyoid Precursor Protein Mutations in Drosophila.</a> Neuron. 32 (2), 389-401 (2001).</li>
<li>Gunawardena, S., Her, L. S., Brusch, R. G., Laymon, R. A., Niesman, I. R., Gordesky-Gold, B., Sintasath, L., Bonini, N. M., Goldstein, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+axonal+transport+by+loss+of+huntingtin+or+expression+of+pathogenic+polyQ+proteins+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Disruption of axonal transport by loss of huntingtin or expression of pathogenic polyQ proteins in Drosophila.</a> Neuron. 40 (1), 1-2 (2003).</li>
<li>Hurd, D. D., Saxton, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinesin+mutations+cause+motor+neuron+disease+phenotypes+by+disrupting+fast+axonal+transport+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Kinesin mutations cause motor neuron disease phenotypes by disrupting fast axonal transport in Drosophila.</a> Genetics. 144 (3), 1075-1085 (1996).</li>
<li>Zinsmaier, K. E., Eberle, K. K., Buchner, E., Walter, N., Benzer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paralysis+and+early+death+in+cysteine+string+protein+mutants+of+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Paralysis and early death in cysteine string protein mutants of Drosophila.</a> Science. 263, 977-980 (1994).</li>
</ol>

利害の衝突は宣言されません。

ショウジョウバエ幼虫の分節の神経は軸索輸送のメカニズムを研究する強力なシステムです。第3齢幼虫の解剖が正しく行われている場合、このような筋肉やNMJsなどのCNS、PNS、および関連組織のすべてのコンポーネントは、単一の幼虫の中で調べることができます。我々はハードとサクストン（1996）によって発行されたものから、このプロトコルを適応している。このプロトコルはまた、他の神経細胞の抗体をテストするために適応させることができますが、抗体の最適化が行われる必要があります。一次および二次抗体のインキュベーション時間が変更されたり、ブロッキングのステップを追加することができます。私たちは正常アミロイド前駆体タンパク質1と軸索輸送のハンチンチン2の役割を調べるためにこのプロトコルを使用している。

<table><tbody><tr><td>Dumont #5 ピンセット</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-20</td><td></td></tr><tr><td>Minutien ピン、ステンレス製</td><td>Fine Science Tools</td><td>26002-10</td><td></td></tr><tr><td>Mcpherson-Vannas ストレートブレード 8cm 鋏</td><td>Fisher Scientific</td><td>50822236</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield封入剤</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184 シリコンエラストマー</td><td>Dow Corning</td><td>4026148</td><td></td></tr><tr><td>formaldehyde, 16%</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>dCSP3</td><td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568 ヤギ抗マウス IgG</td><td>Invitrogen</td><td>A-11004</td><td></td></tr></tbody></table>

3の幼虫分節神経の可視化 rd齢ショウジョウバエ幼虫準備

Visualization of Larval Segmental Nerves in 3rd Instar Drosophila Larval Preparations

キイロショウジョウバエのため、特に便利な遺伝学と完全に配列ゲノムの神経系の発達と機能を研究するための強力なモデル系として浮上している。さらに、幼虫の神経系は、幼虫の体節神経が体の長さに沿って終点の脳とその神経終末内にあるそれらの細胞体と軸索の束が含まれているように軸索輸送のメカニズムを研究する理想的なモデルシステムです。ここでは、幼虫の分節神経内シナプス小胞タンパク質の可視化のための手順を説明します。正しく行えば、神経系のすべてのコンポーネントは、そのような筋肉やNMJsなどの関連組織と一緒に、、そのまま無傷、および可視化する準備が残ります。様々な変異を有する第3齢幼虫は、解剖固定、シナプス小胞の抗体と共にインキュベートし、可視化と野生型の幼虫と比較されます。この手順は、簡単に幼虫分節神経内で観察することができる様々なタンパク質の分布にいくつかの異なるシナプスや神経細胞の抗体と変化に適応することができます。

キイロショウジョウバエの幼虫は、幼虫の分節神経内軸索輸送のメカニズムを調べるために理想的なモデルシステムを提供しています。この手順を使用して、様々な変異を有する第3齢幼虫は、野生型の幼虫と比較することができます。

3の幼虫分節神経の可視化 RD齢ショウジョウバエ幼虫準備

キイロショウジョウバエ（*Drosophila melanogaster*）は、特に...のため、神経系の発達と機能を研究するための強力なモデルシステムとして台頭しています。

幼虫の分節神経を可視化することで、軸索輸送を研究することができます。3齢のdrosophilaを用います。まず幼虫を解剖し、視覚葉、腹側神経節、および分節神経を損傷させることなくCNSを露出させます。手順の第2ステップでは、一次抗体で一晩、次いで二次抗体で暗所で1時間インキュベートする前に、lavaをホルムアルデヒドで固定します。その後、lavaをガラススライドに封入し、軸索輸送の欠損、タンパク質の局在、およびタンパク質の分布を免疫蛍光顕微鏡で観察します。この手法は軸索輸送に関する洞察を得るのに有用ですが、シナプスや筋肉の形態などの他の系にも適用可能です。一般的に、この手法に慣れていない方は、許容される範囲内での解剖、特に脳の分節神経と筋肉を損なわずに維持することが当初は困難であるため、苦労すると思われます。本手順を開始するために、1倍の解剖用バッファー固定液、1倍のPBT、および5% BSA溶液を準備してください。解剖前に提示した表に従い、5番のピンセット1組、直線刃のファンシザーズ1組、およびピンを準備して解剖を開始します。マイクロスポーンを使用して、特定の遺伝子型を持つ3齢幼虫をペトリ皿に回収します。次に、脱イオン水を満たしたペトリ皿で幼虫をすすいで洗浄し、すべての餌を取り除きます。次に、ラバを背面にした状態でSガードディッシュ上に置きます。ラバの前端と後端をピンで固定します。最後に、細い鋏を用いて、固定したラバの上に1回使い切りの解剖バッファーを1滴滴下します。後端近くの背側正中線にある幼虫を挟みます。はさみを使用して、後端から前端にかけて幼虫の角質層を切断します。切断した幼虫の上に、1倍の解剖用バッファーを1滴滴下します。ピンを使用して、幼虫の中央付近にある角質層の側縁の一方を持ち上げ、別のピンで固定します。角質層のもう一方の側縁に対しても同様に行い、図に示すように各側縁に2本ずつピンを刺します。次に、腸、脂肪体、および気管を慎重に取り除き、2つの視葉と腹側神経節を持つ脳のみを残します。分節神経を固定した状態で、ガードディッシュに装着した幼虫を用いて固定および抗体染色を行います。解剖した幼虫を50 µLの固定液に入れ、30分間インキュベートします。固定後、15分ごとに固定液を交換し、1倍PBTで30分間洗浄します。10分ごとにバッファーを交換しますが、その際、幼虫が常にバッファーに浸っている状態を維持することが重要です。5%BSA溶液を用いて、一次抗体溶液を適切な濃度に希釈して調製します。最適な濃度は、使用する抗体によって異なります。プラスチック製ディッシュに水で浸したKimwipeを敷き、加湿チャンバーを構築します。PBTを1回行うごとに、最後の一枚を交換してください。調製した一次抗体溶液で洗浄し、加湿チャンバー内にて4 °Cで翌日まで一晩インキュベートします。解剖した幼虫を1× PBTで30分間洗浄し、その際10分ごとにバッファーを交換します。二次抗体を5%BSA溶液で適切な濃度に希釈し、調製します。一部の二次抗体は光に敏感であるため、加湿チャンバーをアルミホイルで包みます。幼虫を二次抗体溶液とともに25 °Cで1時間インキュベートします。二次抗体によるインキュベートが完了したら、1×PBTで30分間幼虫を洗浄します。この際、10分ごとにバッファーを交換してください。その後、解剖した幼虫をスライドにマウントし、可視化します。図に示すように、カバーグラスを置くのに十分な間隔を空けて、スライドの中央にネイルポリッシュで2本の垂直線を引いて準備します。ネイルポリッシュが完全に乾くまで待ちます。この画像に示すように、スライド上の垂直なネイルポリッシュの線の間のスペースに、封入バッファーを1滴滴下します。これでスライドの封入準備が整いました。最後の個体がPBTの時間を経過した後、幼虫を回収します。洗浄し、幼虫から側方ピンを慎重に取り除きます。キューティクルを破らないよう慎重に扱ってください。残りの2本のピンを抜き、ピンセットで幼虫を拾い上げ、準備したスライドガラスの上に置いてください。幼虫が反転せず、腹側を向いていることを確認してください。スライドを上に向けて、そっとカバーガラスを載せ、ここに示すように端をマニキュアで封印します。これで、蛍光顕微鏡下で幼虫を観察する準備が整いました。この代表的な画像は、シナプス小胞タンパク質であるcysteine string proteinに対する抗体で染色した野生型幼虫のものです。lava分節神経は均一に染色されています。ここでは、モータータンパク質変異体lavaをCSP抗体で染色しました。分節神経には、CSPが強く染色される大規模な蓄積が見られます。この手順を行う際は、脳に接続している分節神経を保持し、筋肉を損傷させないようにすることが重要です。このビデオを視聴することで、解剖方法について十分な理解が得られるはずです。免疫染色を固定し、蛍光顕微鏡を用いて軸索輸送を研究するために、幼虫の分節神経の作製を開始してください。

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JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

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出典:Jeong, S. Visualization of the Axonal projection pattern of the Embryonic motor neurons in Drosophila.J. Vis. Exp.

ショウジョウバエにおける胚性運動ニューロンの軸索投影パターンの可視化

このプロトコルは、無傷の幼虫の脳のコンテキストで生細胞イメージングを行うために使用合理化された方法を説明します。ライブセルイメージングのアプローチは、一貫して、以前に見落とされたメカニズムを暴く、非対称神経幹細胞分裂の研究だけでなく、他の神経と発達過程のための非常に貴重である。...

のライブイメージング<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;幼虫の神経芽細胞

私たちは、解剖、固定、およびステロイドホルモンの生合成とその調節機構を研究するために、ショウジョウバエの幼虫と大人の女性のステロイド産生器官の免疫染色のためのプロトコルを記述します。ステロイド産生臓器に加えて、我々は、ステロイド産生器官の神経支配並びにそのような生殖細胞系列幹細胞のようなステロイド産生標的細胞を可視化します。...

フルーツフライで免疫染色でステロイド合成器官とそのインタラクティブ臓器を可視化するためのプロトコル<em&gt;キイロショウジョウバエ</em

この研究は、後期第16段階ショウジョウバエメラノガスター胚の運動ニューロン投影を視覚化するための標準的な免疫組織化学法を詳述している。 FasII抗体で染色された固定胚のフィレット調製物は、神経発達中にモーター軸索経路探索および標的認識に必要とされる遺伝子を特徴付ける強力なツールを提供する。...

胎児運動ニューロンの軸索突起パターンの視覚化<em&gt;ショウジョウバエ</em

本稿では,ショウ ジョウバエ・メラノガスター 第3齢幼虫から生きた外植片脳を作製,解剖,マウント,画像化し,生理条件下での細胞内・細胞内動態を観察するワークフローについて述べる.

ショウジョウバエメラノガスター第3齢幼虫脳の生細胞イメージング

学ぶショウジョウバエ3齢幼虫の分節神経可視化法。免疫蛍光顕微鏡を用いて軸索輸送メカニズムを解析し、野生型と変異体の比較を通じて神経機能の理解を深めます。

3の幼虫分節神経の可視化^RD齢ショウジョウバエ幼虫準備

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