マウスB細胞を精製における誘導とクラススイッチ組み換えの評価
August 13th, 2010
抗原曝露後、活性化B細胞の亜集団は、異なるエフェクター機能を有する抗体のアイソタイプを生成するためにクラススイッチ組み換え（CSR）として知られているプロセスを経る。このレポートに記載されているプロトコルは、CSRを誘導して分析できる方法について説明します。 in vitroで B細胞機能を研究の目的のために。
体液性免疫応答では、抗原によって活性化されたB細胞が増殖し、応答が進行するにつれて抗体を分泌します。デフォルトのI GM抗体ISOTYPEは、増殖とクラススイッチングを評価するために、より多様なIgG、iga、またはIgEアイソタイプに置き換えられます。In vitro脾臓B細胞は、磁気細胞分離を使用して実験マウスから単離されます。
細胞は、細菌L-P-S-L-P-S刺激による処理によって刺激される増殖を監視するために蛍光色素CFSEで染色され、また、増殖とともに、フローサイトメトリーによって監視することができるアイソタイプIgG 3へのクラス切り替えを誘導します。今日は、純粋な脾臓B細胞の単離と活性化の技術を紹介します。この手法は、in vitroでのクラススイッチ組換えと増殖を調べるために使用でき、デアミナーゼの活性化誘発引用の機能と調節など、B細胞免疫の分野における重要な質問に答えるためにも使用できます。
安楽死させたマウスを70%エタノールに浸すことから始めます。マウスは8〜12週齢である必要があります免疫システムの完全な成熟を確実にするために、滅菌ハサミを使用して、腹部の左心気症の皮膚と筋肉を切開します。はさみまたは鉗子を使用して、隣接する組織から脾臓を取り出します。
次に、PBSで3つの大きな部分に切ります。次に、1ミリリットルのシリンジプランジャーのゴム端を使用して、70ミクロンのセルストレーナーを介して脾臓をPBSに優しくつぶします。研削動作ではなく、押す動作を使用してください。
粉砕は、より大きな増殖細胞の破裂につながる可能性があるためです。細胞を350G以下で5分間スピンダウンします。次に、ペレットをPBSに再懸濁します。
滅菌済みの5ミリリットルポリスチレンチューブ内のヘモサイトメーターを使用して、再懸濁した細胞をカウントします。PBS中に1ミリリットルあたり10〜8番目の細胞の懸濁液を5%正常ラット血清で調製します。各チューブに最大2ミリリットルを追加できます。
次に、50マイクロリットルのEPネガティブセレクションで。マウスB細胞濃縮カクテルは、細胞のミリリットルごとに。次に、チューブにキャップをして、冷蔵庫に15分間置きます。
細胞のミリリットルごとに100マイクロリットルのEPビオチン選択カクテルを追加します。チューブにキャップをして、ビオチン選択カクテルとインキュベートした後、15分間冷蔵庫に入れ、EP磁性ナノ粒子を混合し、細胞のミリリットルごとに100マイクロリットルを追加します。混合物をピペットで動かし、チューブに蓋をして冷蔵庫に5分間置きます。
溶液をPBSで2.5ミリリットルにトッピングし、セプト磁石に入れます5分間、チューブ内の磁石を反転させ、新しいポリスチレンチューブにすばやく注ぎます。負に選択された細胞はチューブ壁に磁気的に結合するため、チューブを振らないでください。細胞懸濁液の純度をさらに高めるには、新しい細胞のチューブを磁石に5分間入れてから、新しいチューブに再度注ぎます。
このステップにより、細胞全体の回収率が低下する可能性があります。B細胞の純度は、B細胞表面マーカーのフローサイトメトリー解析によって評価できます。濃縮後、細胞の95%以上がB two 20陽性であるべきです。
再は、滅菌ジメチルスルフ酸化物で希釈したCFSE色素の5ミリモルストック溶液から、0.1%BSAを添加した温かいPBSに最終濃度100万細胞/ミリリットルで懸濁した。チューブ内の細胞のミリリットルごとに2マイクロリットルを追加します。CFSEは、刺激された細胞の細胞分裂を監視するために使用されます。
アイソタイプの切り替えに不可欠なプロセス。最終濃度10マイクロモルは、初代B細胞の染色に最適です。暗所で摂氏37度で10分間インキュベートした。
CFSEは光に敏感であるため、可能な限り暗闇に保管する必要があることに注意してください。インキュベーション後、等量のウシウシ血清を細胞に加え、氷上でインキュベートして、汚れを消します。細胞を洗浄するために5分間、少なくとも5倍の容量相当の培地をチューブに補充し、ウシウシの血清の粘度を打ち消し、細胞がペレットを生成し、その後350 Gで遠心分離し、培養培地で細胞をさらに2回洗浄します。 これで、細胞を刺激する準備が整いました。
RPMI 1640に10%ウシ胎児血清と50マイクロモルのベト・ミー・キャピタ・エタノールを添加して、in vitro B細胞培養培地を調製します。次に、最終濃度50マイクログラム/ミリリットルでLPSを添加することにより、刺激媒体を調製します。125マイクロリットルの刺激培地を平底96ウェル組織培養プレートの各ウェルに分注する。
CFS E染色B細胞をLPSを含まない培養液中で、最終濃度が10の3.2倍から10mgリットルあたり6細胞になるように調製します。125マイクロリットルの細胞懸濁液を刺激培地を含むウェルに加え、ピペッティングで穏やかに混合します。各ウェルには現在、400,000個の細胞が最終LPS濃度25マイクログラム/ミリリットルで含まれています。
これにより、最適なレベルの細胞増殖とクラススイッチングが実現します。これらの値に必要に応じて変更を加えることができますが、細胞を摂氏37度、二酸化炭素5%で72〜96時間インキュベートします。48時間後、増殖する大きなB細胞のクラスターが顕微鏡ではっきりと見え、クラスの切り替えが見られます。
インキュベーターから細胞を取り出し、1ミリリットルの染色バッファーで2回洗浄して、非特異的抗体の染色を防ぎます。細胞を350 Gでスピンダウンしてペレット化し、次に、細胞を5%正常マウス血清と100万個あたり1マイクログラムのFCブロックを含む染色緩衝液100マイクロリットルに再懸濁し、洗浄せずに氷上で15分間インキュベートします。蛍光標識付き抗US IgG 3抗体を100万細胞あたり1μgで添加し、氷上で30分間インキュベートし、細胞を2回洗浄し、2〜300μLの染色バッファーに再懸濁します。
これで、細胞はフローサイトメトリーによる評価の準備が整いました。CFSEは、アルゴンイオンレーザーによって492ナノメートルで最適に励起され、517ナノメートルで放出されます。IgG 3抗体の励起スペクトルと発光スペクトルは、そのコンジュゲート蛍光色素に依存しています。
磁気濃縮後、細胞懸濁液は、区別のつかない小さな円形細胞の均質な集団のように見えるはずです。48時間から72時間の刺激後、拡大した増殖細胞の孤立したクラスターがはっきりと見えるようになります。非増殖細胞の大部分は、アポトーシスを受けると小さく顆粒状に見えます。
CSRは通常、刺激後72時間から96時間の間に最高レベルで検出され、その後、ほとんどの細胞が死滅し始めます。この段階では、細胞は多数の細胞分裂を経ており、スイッチされた細胞が後の娘細胞集団に現れるはずです。これらのプロトコルに続いて、rna、AI媒介遺伝子ノックダウンなどの他の技術を使用して、IDの機能およびクラススイッチ組換えのプロセスに対する任意の遺伝子の影響を研究することができます。
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概要
この記事では、抗原暴露後のB細胞におけるクラススイッチ組換え（CSR）のプロセスについて説明します。B細胞機能を研究するために、in vitroでCSRを誘導し分析するためのプロトコルを概説します。
主要な研究構成要素
科学の分野
- 免疫学
- B細胞生物学
- 抗体生産
背景
- B細胞は体液性免疫応答に不可欠です。
- 活性化されたB細胞はCSRを経て異なる抗体アイソタイプを産生します。
- CSRを理解することは、B細胞機能と調節に関する洞察を得るために重要です。
- この研究では、B細胞の挙動を分析するためにin vitro法を使用しています。
研究目的
- 脾臓B細胞を単離し活性化するための技術を示すこと。
- in vitroでクラススイッチ組換えと増殖を調査すること。
- 活性化誘導シチジンデアミナーゼの機能と調節を探ること。
使用した方法
- 磁気細胞分離を用いて実験用マウスから脾臓B細胞を単離すること。
- 増殖をモニタリングするために細胞をCFSEで染色すること。
- クラススイッチを誘導するために細胞を細菌性LPSで刺激すること。
- フローサイトメトリーを用いて増殖とクラススイッチをモニタリングすること。
主な結果
- 純粋な脾臓B細胞の成功的な単離と活性化。
- IgG3アイソタイプへのクラススイッチ組換えの誘導。
- B細胞の増殖が効果的にモニタリングされました。
- この研究を通じてB細胞免疫に関する洞察が得られました。
結論
- このプロトコルはB細胞機能を研究するための信頼性の高い方法を提供します。
- 結果はCSRのメカニズムを理解することに貢献します。
- この研究はB細胞免疫における重要な質問への答えを提供する可能性があります。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Class switch recombination (CSR) in murine B cells is a pivotal process for understanding antibody diversification and functional immune responses, directly impacting early-stage immunology drug discovery. Reliable in vitro induction and assessment of CSR enables mechanistic de-risking and target validation for therapeutic programs focused on humoral immunity. This workflow supports predictive confidence in antibody function studies and informs portfolio decisions in immunology and inflammation pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of B cell activation pathways and antibody isotype switching mechanisms.
- Supports functional validation of activation-induced cytidine deaminase (AID) as a target in immune modulation.
- Facilitates mechanistic de-risking by isolating gene-specific effects using knockout or gene-modified mouse models.
- Provides a platform for evaluating the impact of gene knockdown or transgene expression on CSR outcomes.
Screening & Assay Development
- Delivers standardized, reproducible in vitro assays for B cell proliferation and class switching.
- Enables quantitative measurement of isotype switching and cell division via flow cytometry and CFSE staining.
- Prepares validated biological systems for downstream compound screening or genetic perturbation studies.
- Supports assay scalability and platform reuse across multiple gene targets or immune pathways.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro CSR assays with disease-relevant immune mechanisms for translational biomarker exploration.
- Provides continuity from discovery-stage mechanistic studies to preclinical validation of immune interventions.
- Enables risk-adjusted advancement of immune-modulating candidates based on functional B cell readouts.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling hypothesis testing, mechanistic validation, and quantitative immune function assessment in murine models.
- Discovery Biology: Supports hypothesis-driven interrogation of B cell function and antibody diversification mechanisms.
- Screening: Provides reproducible, quantitative outputs for proliferation and isotype switching readiness.
- Analytics: Delivers flow cytometry-based measurements for comparing gene or compound effects on CSR.
- Translational Research: Bridges mechanistic findings to preclinical immune modulation strategies when aligned with disease models.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable assay platform for diverse genetic and pharmacological studies in humoral immunity.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in immune target validation and mechanistic de-risking.
- Operational Value: Standardizes B cell functional assays for reproducibility and scalability across programs.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and reduces late-stage biological risk in immunology portfolios.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of immune-modulating assets based on robust functional data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in murine immunology and flow cytometry analysis.
- Demands access to cell isolation, magnetic separation, and cytometry instrumentation.
- Necessitates cross-team standardization of assay conditions and readouts for reproducibility.
- May require adaptation for different mouse strains or genetic backgrounds.
- Dependent on viability and purity of isolated B cells for optimal assay performance.
