マウスB細胞を精製における誘導とクラススイッチ組み換えの評価

液性免疫応答において、抗原によって活性化されたB細胞は、応答の進行に伴い増殖し、抗体を分泌します。増殖およびクラススイッチを評価するため、デフォルトのIgM抗体アイソタイプは、より多様なIgG、IgA、またはIgEアイソタイプに置換されます。磁気細胞分離法を用いて、実験用マウスからin vitro用の脾臓B細胞を単離します。

細胞は蛍光染料CFSEで染色し、細菌性L-P-Sによる刺激で誘導される増殖をモニターします。L-P-S刺激はアイソタイプIgG3へのクラススイッチも誘導し、増殖とともにフローサイトメトリーで解析可能です。本日は、純粋な脾細胞B細胞の単離および活性化の手法を解説します。この手法は、in vitroでのクラススイッチ組換えおよび増殖の観察に利用できるほか、活性化誘導シチジン脱アミノ酵素の機能や制御を含む、B細胞免疫分野における重要な疑問を解決するためにも活用できます。

まず、安楽死させたマウスを70% ethanolに浸します。免疫系が十分に成熟していることを確実にするため、マウスの週齢は8～12週とします。滅菌したハサミを用いて、腹部左季肋部の皮膚と筋肉を切開します。ハサミまたはピンセットを使用して、周囲の組織から脾臓を取り出します。

次に、PBS中でそれを3つの大きな断片に切断します。その後、1 mLシリンジプランジャーのゴム端を用いて、脾臓を70 µmのセルストレーナーを通してPBS中に緩やかに押し出します。このとき、すり潰すのではなく、押し出すように操作してください。

研磨を行うと、増殖中の大きな細胞が破裂する可能性があるため、細胞を350 G以下で5分間遠心分離します。その後、沈殿物をPBSで再懸濁します。

滅菌済みの5 mLポリスチレンチューブ内で、ヘモサイトメーターを用いて再懸濁した細胞数をカウントします。5%正常ラット血清を含むPBSを用いて、1×10⁸ cells/mLの細胞懸濁液を調製します。各チューブに添加できる最大量は2 mLです。

次に、細胞1mLあたり50 µLのEP negative selection Mouse B-cell enrichment cocktailを添加します。その後、チューブにキャップをして、冷蔵庫に15分間置きます。

細胞1mLあたり100 µLのEPビオチン選択カクテルを加えます。チューブに蓋をし、冷蔵庫に15分間置きます。ビオチン選択カクテルでインキュベートした後、EP磁性ナノ粒子を細胞1mLあたり100 µL加えます。混合物をピペッティングし、チューブに蓋をして冷蔵庫に5分間置きます。

PBSを加えて溶液を2.5 millilitersにし、ceptマグネットに設置します。5分後、チューブが入ったマグネットを反転させ、新しいポリスチレンチューブに素早く注ぎます。負に選択された細胞は磁性によりチューブ壁に結合しているため、チューブを振らないでください。細胞懸濁液の純度をさらに高めるには、新しい細胞入りチューブを再びマグネットに5分間設置し、さらに別の新しいチューブへ注ぎます。

このステップにより、全体の細胞回収率が低下する可能性があります。B細胞の純度は、B細胞表面マーカーのフローサイトメトリー解析によって評価できます。濃縮後、95%以上の細胞がB two 20陽性である必要があります。

滅菌ジメチルスルホキシドで希釈した5 mMのCFSE染料ストック溶液を用い、0.1% BSAを添加した温かいPBSで、最終細胞濃度が10^6 cells/mLとなるように単離細胞を再懸濁します。チューブ内の細胞懸濁液1 mLあたり2 µLを添加します。CFSEは、刺激された細胞の細胞分裂をモニターするために使用されます。

アイソタイプスイッチングに不可欠なプロセスです。一次B細胞の染色は、最終濃度10 micromolarが最適です。暗所にて37 degrees Celsiusで10分間インキュベートします。

CFSEは光に敏感であるため、可能な限り遮光して保存してください。インキュベーション後、細胞に等量のウシ胎児血清を加えて氷上でインキュベートし、染色を停止させます。細胞を洗浄するため、チューブに培養液を満たします。この際、ウシ胎児血清の粘性を打ち消し、細胞がペレットを形成できるように、元の液量の少なくとも5倍以上の培養液を加えてください。その後、350 Gで遠心分離します。さらに2回、培養液で細胞を洗浄します。これで細胞は刺激準備完了です。

RPMI 1640に10%胎児牛血清と50 micromolarのβ-メルカプトエタノールを添加し、in vitro B細胞培養培地を調製します。次に、LPSを最終濃度50 micrograms per milliliterになるように添加して、刺激培地を調製します。刺激培地125 microlitersを、平底96ウェル組織培養プレートの各ウェルに分注します。

LPSを含まない培地を用いて、最終濃度が3.2 × 10⁶ cells/mLとなるようにCFS E染色B細胞を調製します。この細胞懸濁液125 µLを、刺激培地が入ったウェルに加えて、ピペッティングで穏やかに混合します。これにより、各ウェルには400,000個の細胞が含まれ、最終的なLPS濃度は25 µg/mLとなります。

これにより、細胞増殖とクラススイッチの最適なレベルが得られます。必要に応じてこれらの値を変更しても構いませんが、細胞を37°C、5% carbon dioxideで72〜96時間培養してください。48時間後には、クラススイッチを確認するために顕微鏡で観察すると、増殖した大型B細胞のクラスターが明確に確認できます。

インキュベーターから細胞を取り出し、非特異的な抗体染色を防ぐため、1 mLの染色バッファーで2回洗浄します。350 Gで遠心分離して細胞をペレット化します。次に、5%正常マウス血清と10^6細胞あたり1 µgのFCブロックを含む100 µLの染色バッファーに細胞を再懸濁し、洗浄せずに氷上で15分間インキュベートします。10^6細胞あたり1 µgの蛍光標識抗US IgG3抗体を加え、氷上で30分間インキュベートした後、細胞を2回洗浄し、200〜300 µLの染色バッファーに再懸濁します。

これで細胞をフローサイトメトリーで評価する準備が整いました。CFSEは、アルゴンイオンレーザーによる492 nmで最適に励起され、517 nmで発光します。IgG三抗体の励起および蛍光スペクトルは、結合している蛍光色素によって異なります。

磁気濃縮後、細胞懸濁液は、区別がつかない小さな円形細胞の均質な集団として観察されるはずです。刺激後48〜72時間で、増殖して肥大化した細胞の孤立したクラスターが明確に確認できるようになります。非増殖細胞の大部分は、アポトーシスを起こすため、小さく顆粒状に見えます。

CSRは通常、刺激後72時間から96時間の間で、ほとんどの細胞が死滅し始める前の最高レベルで検出されます。この段階で、細胞は数回の細胞分裂を経験しているはずであり、後の娘細胞集団にスイッチした細胞が現れます。これらのプロトコルに従い、RNAiによる遺伝子ノックダウンなどの他の手法を用いて、特定の遺伝子がAIDの機能およびクラススイッチ組換えのプロセスに及ぼす影響を研究することができます。