Name: に関与する宿主因子のためのRNAiスクリーニングワクウイルス感染ショウジョウバエセル (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-08-25T17:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 20 s
Description: 学ぶRNAiスクリーニング法を用いて、ショウジョウバエ細胞でワクチニアウイルス感染に関与する宿主因子を同定する方法。蛍光顕微鏡による自動画像解析で感染率を定量化し、ウイルス宿主相互作用の研究に応用できます。

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この作品は、NIAID（R01AI074951、U54AI057168）とSCにペンゲノムフロンティア研究所からの補助金によって支えられて、NIH T32HG000046からTSMに、NIH T32GM07229とT32AI007324からLRSに。

パート1：384ウェルプレートでのRNAi <ol><li>スクリーニングに用いる試薬の標準化が不可欠です。我々はシュナイダーのメディアの個々のたくさんの、ウシ胎児血清、および染色試薬をテストします。その後、我々は、分注して、画面全体のための同一ロットを使用してください。 </li><li>任意のアッセイの場合、それは、読み出して生物学的に最も適しているかを判断するためにいくつかの異なる細胞株をテストするのが最適です。我々は通常、S2 - DRSCラインを使用してください。 </li><li> 25℃で完全なシュナイダーのメディアでショウジョウバエの細胞を成長する。 <ol class="lalpha"><li>シュナイダーのメディア</li><li> 10％の熱不活化FBS </li><li> 1X L -グルタミン</li><li> 1Xのペン/連鎖球菌抗生物質</li></ol></li><li> ショウジョウバエの細胞は半接着性であり、フラスコから細胞をピペッティングし、新鮮なフラスコに1時10分、細胞を希釈して4日ごとにトリプシン処理することなく継代されています。細胞は実験の対数増殖期にある必要があります。 </li><li>プレート間のプレートと日々の変動は、マルチウェルプレートにすべての液体の追加のための自動液体ハンドリングを使用することによって最小限に抑えられています。我々はWellMate（マトリックス）を使用してください。 </li><li> WellMateチューブを準備します。 <ol class="lalpha"><li> 70％エタノールでスプレーフードとWellMate。 </li><li> 70％エタノールで包装し、スプレーのチューブを取り外します。 </li><li> WellMate上の位置を調剤にチューブカセットを挿入します。 </li><li> 70％エタノール25mLの素チューブ。 </li><li>エタノールの別の25 mLのその後素数15分、のためのエタノールのチューブを滅菌する。 </li><li>滅菌PBS 50 mLでプライミングによってチューブを洗浄します。 </li></ol></li><li>フラスコとカウントから細胞を取り除きます。細胞をペレット化するために必要なよりも25％以上を持つように（300xg、5分）。ウェルあたり播種する細胞の数は、アッセイの長さに応じて最適化する必要があります。自動画像解析を行う際に、無細胞の凝集を持つ単一の単層は、画像のセグメンテーションに最適です。 </li><li> 1.7 × 10 6細胞/ mLで無血清シュナイダーのメディアでペレット化した細胞を再懸濁します。 </li><li>我々は、384ウェルプレート250ng/wellの濃度でdsRNAの市販のライブラリーが事前に小分けに画面を実行します。各プレートのいくつかのウェルを手動で追加されたコントロール、のために空のままにされています。我々は、ネガティブコントロールとしてルシフェラーゼにdsRNAを使用。我々は、堅牢なRNAi実験のコントロールとして（dIAP）スレッドに対するdsRNAを使用してください。劇的な細胞死でこの抗アポトーシス因子の結果のノックダウンとダウンノックの品質を評価するために迅速に視覚的な方法です。最後に、我々は我々のアッセイを読んでアウトを使用してウイルス感染を阻害することができることを検証するためにポジティブコントロールとして、この場合はβ- galacosidaseで、ウイルスのレポーターに対してdsRNAを使用してください。一定分量1μlのdsRNAが簡単に可視化を可能にするためにものコーナーに、細胞播種の時にプレートにdsRNAをスポッティングした場合は、セルを追加する前に、井戸の底（300xg、1分）にdsRNAを遠心してください。 </li><li>各ウェルに上記で調製した10μLの細胞を追加するWellMateを使用してください。 </li><li> 300xg、1分を遠心分離することによってプレート上に細胞を回転させる。 </li><li> 45分間25℃インキュベーターでインキュベートする。 </li><li> 20μLの完全シュナイダーのメディアを追加し、300xg、1分遠心してください。 </li><li>加湿タッパーウェアの容器に入れプレートは水浸状のペーパータオルを敷いた。 384の量は十分小さく、したがって、蒸発は順番に、エッジの井戸のリードアウトの人為的な変化につながることができる生物学、大きな影響を持つことができます。これを克服するために、プレートは、高湿度下で維持されるべきである。 </li><li>堅牢なノックダウンを可能にするために三日間インキュベートする。この期間中にメディアまたはオープン加湿容器を変更する必要はありません。 </li></ol>パート2： ワクシニアウイルスで感染する<ol><li> 15分間Quatricideでマルチチャンネルの吸引器を殺菌し、70％エタノールでリンス。 </li><li>上記のようにWellMateを準備します。 </li><li>無血清培地での完全なメディア1:5に希釈して感染を2％FBSとシュナイダーのメディアを準備します。 </li><li>細胞残渣を除去または精製されたウイルスを使用するフィルタ0.8 UMシリンジを介してフィルタ原油ウイルスストック。 </li><li> 2の感染の多重度（MOI）を取得するには、2％血清シュナイダーのメディアにワクシニアウイルスを希釈する。 </li><li> WellMateチューブからPBSを外し、チューブが気泡の自由になるまで希釈したウイルスと素数。 </li><li>静かにdsRNAを処理したショウジョウバエの細胞のプレートから培地を除去する滅菌マルチチャンネルアスピレーターと吸引マニホールドを使用してください。 </li><li> WellMateを使用してプレートにウェルあたり30μLのウイルスを分注する。 </li><li> 300xgでプレート1分間遠心します。 </li><li> WellMateチューブを滅菌する。 10％のブリー25mLの素チャンネル、10分待ってから別の25 mLの10％の漂白剤と素数。 </li><li> 50mLの70％エタノール、続い50mLの水素チューブ。その包装にチューブを返します。 </li><li>加湿タッパーウェアの容器にプレートを返します。 48時間25℃でインキュベートする。 </li></ol>パート3：染色プレート<ol><li> 10分15μLを4％ホルムアルデヒド/ PBSでプレートを固定してください。液体は、各ステップでマルチチャンネルの吸引器と吸引マニホールドを使用して削除されます。一度プレートが固定されている、滅菌された器具や試薬が不要になります。 </li><li>削除修正して30μLPBST（PBS + 0.1％トリトン- X）を追加するWellMateを使用してください。 10分とリピートをインキュベートする。チューブは滅菌する必要がない場合を除き、上記のようWellMate動作する。 </li><li> ワクシニア感染を検出するために我々は、初期/後期ワクシニアプロモーターによって駆動されるβ-ガラクトシダーゼのレポーターを使用してください。 </li><li> 10分間ブロック（2％BSAを含むPBST）で液体とインキュベートセルを削除します。 </li><li>ブロック内で一次抗体を希釈して、液体を除去し、各ウェルのマルチチャネルを用いた繰り返しピペッター（マトリックス）に15μLの抗体を加える。 </li><li>プレート（300xg、1分）スピンダウン、明確なステッカーでカバーし、4℃で一晩インキュベートする。 </li><li>一次抗体を削除し、PBSTで3回、10分ごとに井戸を洗浄するWellMateを使用してください。 </li><li>蛍光標識二次抗体（FITC）と核ブロックで染色、およびマルチチャンネルのリピートピペッターを使用してウェルに15μLを追加して希釈する。 </li><li>プレートを、室温で1時間は、光から保護。 </li><li> WellMateを使用してPBSTで3回、10分ごとに井戸を洗浄する。 </li><li> 4で明確なステッカー、カバー、およびストアでプレートをシール° Cまで3週間。 </li></ol>パート4：イメージングと画像解析<ol><li>イメージングプレートに20倍の倍率で自動化された顕微鏡を使用してください。 </li><li>合計核（DAPI）と感染細胞（FITC）の画像をキャプチャ。ダイナミックレンジを最大化するために、個別に各チャネルごとに露光時間を最適化する。 </li><li>焦点の予想される平面の上下面にまたがる画像を、間隔をあけ1um、のZスタックを取ることによってオートフォーカス機能を微調整します。最適な焦点面が配置されると、それに応じてオートフォーカスの設定を調整します。 </li><li>画像全体のプレート、ヘキストチャンネル（DAPI）とウイルスのチャンネル（FITC）の両方に1ウェルあたり、少なくとも3つの画像をキャプチャする。全体として十分に表すイメージをキャプチャするためにも一つの中にいくつかの異なる地域からのサイトを選択してください。 </li><li>セグメントにイメージをジャーナルを書き、それぞれのプレートのための核染色（総細胞）や感染（FITC）のための陽性細胞の合計数を計算するには、Countの核のモジュールを使用するソフトウェアをMetaXpress使用。 </li><li>パーセントの感染症（100 * FITC陽性/総細胞）を計算し、変換ログオンします。 </li><li>候補者を識別するために我々は、各プレートの中央値と四分位範囲に基づいて、堅牢なZスコアを使用してください。このメソッドは、外れ値や非対称データに鈍感であり、そのためにも弱または中程度のヒット10を特定するのに大きな力を提供します。各プレートについて、中央値は、対数変換したデータから減算されます。次に、得られた値は、0.74倍の四分位範囲（75パーセンタイルの値と25 パーセンタイルの間の差）によって分けられています。 0.74係数が近似標準正規分布に使用されます。 </li><li>堅牢なZスコアは、プレートの中央値から標準偏差の距離の尺度です。たとえば、2の堅牢なZ -スコアは、井戸の％の感染がプレートの中央値またはp &lt;0.05から〜2標準偏差であることを示します。 </li><li>細胞毒性の候補を識別するために、細胞数を分析する。核カウントの堅牢なZスコアを計算する。重複画面で堅牢なZ &lt;-2を持つ候補者は細胞毒性とみなされます。 </li><li>細胞毒性なし、重複画面で&gt; 2または&lt;-2（P &lt;0.0025）のパーセント感染の堅牢なZスコアを持っている井戸は、一次画面からの潜在的候補と見なされます。 </li><li>肯定的な候補者は、独立した試薬を用いて検証されます。 dsRNAはmRNAの別の領域から興味のある遺伝子に対して生成され、上記のように試験されています。 </li><li>二つの独立したdsRNAは、同じ表現型を所持している遺伝子は、さらなる研究のために考えることができる。 </li></ol>パート5：代表画像と感染率の解釈<img src="/files/ftp_upload/2137/2137fig1.jpg" alt="図1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図1"> よく感染の代表がのような免疫蛍光顕微鏡で測定したワクシニア発現するβ-ガラクトシダーゼ（βgal）蛋白質、のために陽性染色細胞を含んでいるときに、 図1。非感染の井戸は、 ワクシニアウイルスのタンパク質のいずれかの染色を示していない。ウイルス=緑、核=青。 <img src="/files/ftp_upload/2137/2137fig2.jpg" alt="図2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図2"> 図2自動画像解析ソフトウェアは、ユーザが設定したパラメータを用いて各画像に感染を定量化する。代表的なイメージでは、細胞核やウイルス抗原を発現する細胞の数の合計数は、サイズおよびローカルバックグラウンド染色の上に染色の強度に基づいてカウントされます。 <img src="/files/ftp_upload/2137/2137fig3.jpg" alt="図3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図3"> 図3。スレッド（dIAP）のノックダウンは、標的遺伝子の堅牢なRNAiの枯渇のためのポジティブコントロールとして機能します。この抗アポトーシス因子のノックダウンは、劇的な細胞死につながる。核=青。 <img src="/files/ftp_upload/2137/2137fig4.jpg" alt="図4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図4"> 図4。ルシフェラーゼのノックダウンは、感染に対する二本鎖RNAの治療の効果のためのネガティブコントロールとして機能します。ルシフェラーゼの枯渇は、放置細胞への相対的な感染には影響しません。ウイルス=緑、核=青。 <img src="/files/ftp_upload/2137/2137fig5.jpg" alt="図5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図5"> 感染から読み出さとしてアッセイはβgalタンパク質レベルを使用するので、 図5。βgalタンパク質のノックダウンは、感染症の減少のためのポジティブコントロールとして機能します。感染細胞の割合の減少にβgal結果の枯渇。ウイルス=緑、核=青。 <img src="/files/ftp_upload/2137/2137fig6.jpg" alt="図6" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図6"> 図6。細胞因子のノックダウン感染細胞の割合の減少のRab5の結果。 Rab5のエンドサイトーシスに関与することが知られているので、この要因は、おそらくワクシニアウイルスのエントリーに貢献しています。これは、画面から例の外れ値を表します。ウイルス=緑、核=青。

<ol><li>Ramadan, N., Flockhart, I., Booker, M., Perrimon, N., Mathey-Prevot, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+implementation+of+high-throughput+RNAi+screens+in+cultured+Drosophila+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Design and implementation of high-throughput RNAi screens in cultured Drosophila cells.</a> Nat Protoc. 2, 2245-2264 (2007).</li>
<li>Chotkowski, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((West+Nile+virus+infection+of+Drosophila+melanogaster+induces+a+protective+RNAi+response%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">West Nile virus infection of Drosophila melanogaster induces a protective RNAi response.</a> Virology. 377, 197-206 (2008).</li>
<li>Blondel, D., Petitjean, A. M., Dezelee, S., Wyers, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vesicular+stomatitis+virus+in+Drosophila+melanogaster+cells%3A+regulation+of+viral+transcription+and+replication%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Vesicular stomatitis virus in Drosophila melanogaster cells: regulation of viral transcription and replication.</a> J Virol. 62, 277-284 (1988).</li>
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<li>Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Simple+Statistical+Parameter+for+Use+in+Evaluation+and+Validation+of+High+Throughput+Screening+Assays%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomol+Screen%22%5BJournal%5D)">A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays.</a> J Biomol Screen. 4, 67-73 (1999).</li>
<li>Echeverri, C. J., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+RNAi+screening+in+cultured+cells%3A+a+user%27s+guide%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">High-throughput RNAi screening in cultured cells: a user's guide.</a> Nat Rev Genet. 7, 373-384 (2006).</li>
</ol>

利害の衝突は宣言されません。

ショウジョウバエのゲノムワイドなRNAiスクリーニングでは、ウイルス感染の細胞成分を調べるための、堅牢で効率的な方法を提供する。哺乳類のウイルスの数は、ホスト固有の免疫応答の構成要素を識別するために使用できるショウジョウバエの細胞を、感染、および新たな治療標的を表す可能性があるウイルス複製に必要なタンパク質因子を開催。画面を実行する前に、アッセイは、慎重に細胞型、細胞数、および感染のレベルに合わせて最適化しなければならない、とも正と負のウイルスおよび細胞標的11の両方を含む、制御しなければならない。アッセイのダイナミックレンジを最大にする前にスクリーニングにポジティブコントロールとネガティブコントロールとの間の十分な分離を確保することが重要です。画面が実行されたら、候補者は、ホストのメカニズムは、感染症に寄与するかを決定するために機能的なカテゴリに分けることができます。 ワクシニアなどの哺乳動物ウイルスの場合は、RNAiによる哺乳動物のホモログの寄与は、二次分析の一環として決定されるべきである。一緒に、これらの堅牢なスクリーニング法は、私たちは、ウイルスが宿主細胞と相互作用することによって、複雑なメカニズムを把握することができます。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;細胞培養&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Schneider&amp;rsquo;s media</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>11720</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX 100X</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>35050</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン (pen/strep)</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>胎児牛血清 (FBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F6178</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;スクリーニング&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ゲノムワイドdsRNAライブラリ</td><td>Ambion</td><td></td><td></td></tr><tr><td>384ウェルプレート（黒、底部透明）</td><td>Corning</td><td>3712</td><td></td></tr><tr><td>アルミシール</td><td>Corning</td><td>6569</td><td></td></tr><tr><td>透明シール</td><td>Denville Scientific</td><td>B1212-4</td><td></td></tr><tr><td>Well Mate</td><td>Matlab</td><td>201-10001</td><td></td></tr><tr><td>24ピンマニホールド</td><td>Drummond Scientific</td><td>3-000-101</td><td></td></tr><tr><td>H&amp;#8211;chst 33342</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B2261</td><td></td></tr><tr><td>蛍光標識二次抗体</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageXpressMicro 自動顕微鏡</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MetaXpress 画像解析ソフトウェア</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

に関与する宿主因子のためのrnaiスクリーニングワク</em使用して>ウイルス感染ショウジョウバエセル

RNAi Screening for Host Factors Involved in Vaccinia Virus Infection using Drosophila Cells

だけでなく、ウイルスは、ヒトの病気の自然な流行を引き起こす可能性がありますが、バイオテロの潜在的な利用も懸念される。ウイルス性病原体は、重大な公衆衛生上の脅威を表す。衝撃の感染が待望の治療薬の開発を促進することを細胞因子の理解を深める。いくつかの生物の塩基配列の完全なゲノムとの結合RNA干渉（RNAi）技術の最近の進歩により、ゲノムワイドな、セルベースの機能喪失の画面の最適化につながっている。 ショウジョウバエの細胞ためのゲノムスケールの画面には特に敏感に反応このシステム1におけるRNAiの使いやすさと効率性。重要なのは、ウイルスの多種多様な医療や農業の大切さ2,3,4の哺乳類のウイルスの数を含む、 ショウジョウバエの細胞を、感染することができます。 ショウジョウバエの前のRNAiスクリーニングは、エントリ、翻訳とRNA複製5を含むウイルス感染におけるさまざまなステップに必要な宿主因子を同定した。また、 ショウジョウバエの細胞培養でウイルス複製に必要な細胞因子の多くは、これらのウイルス4,6,7,8、9に感染したヒトの細胞に制限されています。したがって、ウイルス感染時の共存を選んだ宿主因子の同定は、抗ウイルス治療のための新しいターゲットを示します。ここでは例として、 ワクシニアウイルスを使用して、ウイルス感染に関与する細胞因子を特定するハイスループットRNAiスクリーニングのための一般的なプロトコルを提示する。

ウイルス感染に関与する新規の宿主因子は、機能のRNAiスクリーニングの細胞ベースのゲノムワイドな損失を介して識別できます。 A<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;細胞培養モデルでは、RNAi実験の容易さと効率のためにこのアプローチに特に適している。ここでは、使用してこのテクニックを示しています<em&gt;ワク</em例として&gt;ウイルス。

に関与する宿主因子のためのRNAiスクリーニングワク</em使用して>ウイルス感染ショウジョウバエセル

ウイルス病原体は公衆衛生上の重大な脅威となっています。ウイルスはヒトの疾患による自然発生的な流行を引き起こすだけでなく、...への利用の可能性もあり、

本手順の全体的な目的は、ハイスループットRNAiスクリーニングを利用して、ウイルス感染に関与する宿主因子を同定することです。まず、384ウェルプレートを用いてRNAiにより目的の遺伝子をノックダウンさせます。次に、細胞に目的のウイルスを感染させ、ウイルス蛋白を染色し、免疫蛍光顕微鏡を用いてウイルス感染量を測定します。最後に、自動画像解析を行い、バリデーションおよびさらなる研究の対象となる候補遺伝子を特定します。最終的に、免疫蛍光顕微鏡を用いて感染細胞の割合を定量化することで、感染の変化を示す結果を得ることができます。これにより、ウイルス感染に関与する新規の細胞因子の発見が可能になります。この手法はウイルスと宿主の相互作用に関する知見を提供できるだけでなく、目的とする細胞プロセスを視覚的に読み取ることが有用なあらゆるシステムの研究にも適用可能です。本手法を初めて用いる方は、再現性のある感染を実現しつつばらつきを最小限に抑えるために相当な最適化が必要となるため、習得までに時間を要することを想定しておくべきです。結果の再現性を確保するためには、スクリーニング全体で使用する各試薬について、単一のロット番号のものを使用することが不可欠です。S 2D RSC ショウジョウバエ細胞を、25 °C の Schneider's medium 完備培地で、対数増殖期になるまで培養してください。層流クリーンベンチ内での実験では、激しくピペッティングしてフラスコから半接着細胞を剥離させます。ヘモサイトメーターで細胞数を算出し、実験に必要な細胞数の125%を50 mLコニカルチューブに移し、300 Gで5分間遠心してペレット化します。上清を吸引し、血清不含Schneider培地を用いて、最終濃度が1.7×10⁶ cells/mLになるようにペレットを再懸濁します。滅菌およびプライミング済みの自動液体ハンドリングシステムを使用します。ここでは、プレート間のばらつきを最小限に抑えるため、matrix well mateを使用します。384ウェルプレートの各ウェルに、250 ng/wellの二本鎖RNAで事前処理した細胞懸濁液を10 µLずつ分注します。プレートを300 ×gで1分間遠心し、細胞を固定させます。プレートを25 °Cで45分間インキュベートします。それぞれに20 µLの完全Schneider培地を加えます。蒸発の影響を最小限に抑えるため、培地を300 Gで1分間スピンダウンさせます。プレートを、水に浸したペーパータオルを敷いた加湿密閉容器に入れて保存します。BSL 2バイオセーフティキャビネット内で25 °Cで3日間インキュベートし、強力なノックダウン効果が得られるようにします。細胞に感染させる前に、ワクシニアウイルスの粗ストックを0.8 micronシリンジフィルターでろ過します。細胞残渣を除去します。ウイルスを2%血清含有Schneider培地で希釈し、感染多重度（MOI）を2にします。滅菌したウェルメイトを希釈ウイルスで満たし、チューブ内に気泡がない状態にします。真空マニホールドを備えた滅菌済みのマルチチャンネルアスピレーターを用いて、二本鎖RNA処理したショウジョウバエ細胞のプレートから培地を静かに取り除きます。各プレートに30 µLの希釈ウイルスを分注します。プレートを300 Gで1分間遠心分離します。プレートを加湿容器に戻し、25 °Cで48時間インキュベートします。BSL 2バイオセーフティキャビネット内で、プレートから培地を吸引します。次に、マルチチャンネルピペットを使用して、各プレートに4% formaldehyde固定液を15 µLずつ加えます。室温で15分間インキュベートします。その後、マルチチャンネルアスピレーターで液体を除去します。WELLMADEを使用して、各ウェルにPBSTを30 microliters加えます。室温で10分間インキュベートします。同様の手順で、2回目のPBSTによる10分間の洗浄を行います。インキュベーションブロック後の液体を除去し、2% VSA ブロッキング溶液を含む 30 µL の PBST を加えます。室温で 10 分間インキュベートします。マルチチャンネルリピートピペッターを使用して、ブロッキング溶液で希釈した一次抗体 15 µL をそれぞれに加えます。プレートを 300 G で 1 分間遠心分離します。各プレートを透明なシーリングフィルムで密封し、4 °C で一晩インキュベートします。ウェルメイトとマルチチャンネルアスピレーターを使用して、PBST で細胞を 10 分間ずつ 3 回洗浄します。マルチチャンネルピペッターを用いて、核染色剤を含む蛍光標識二次抗体を各ウェルに15 µLずつ分注します。光を遮断するため、プレートをアルミホイルで覆い、室温で1時間インキュベートします。以前と同様に、PBSTで細胞を3回洗浄し、1回の洗浄につき10分間行います。30 µLのPBSTを細胞に添加し、クリアシールで密封します。フィルムで覆い、アルミホイルで遮光します。密封したプレートを4 °Cで保存し、自動顕微鏡で撮像するまで最大3週間保存可能です。非感染のウェルではワクシニアウイルス蛋白の染色は認められませんが、代表的な感染ウェルには細胞が含まれています。免疫蛍光顕微鏡による測定で、ワクシニア発現beta GCSEs蛋白に対して陽性の染色が示されています。自動画像解析ソフトウェアが、ユーザーによって設定されたパラメータを用いて、各画像内の感染量を定量化します。代表的な画像において、細胞核の総数およびウイルス抗原を発現している細胞数を、局所的な背景以上の染色強度とサイズに基づいてカウントします。threadのノックダウン染色は、標的遺伝子の強力なRNAi枯渇の陽性対照として機能します。この抗アポトーシス因子のノックダウンは、劇的な細胞死を誘導します。ルシフェラーゼのノックダウンは、二本鎖RNA処理が感染に及ぼす影響に対する陰性対照として機能します。ルシフェラーゼの枯渇は、未処理の細胞と比較して感染に影響を与えません。β-ガラクトプロテインのノックダウンは、感染減少の陽性対照として機能します。本アッセイではbeta galactoタンパク質レベルを感染の指標として使用するため、beta galactoの枯渇は感染細胞率の低下をもたらします。細胞因子RAB fiveのノックダウンは、感染細胞率の低下をもたらします。RAB fiveはエンドサイトーシスに関与することが知られているため、この因子はワクシニアウイルスの侵入に寄与していると考えられます。このビデオを視聴することで、RNAiの実施、ワクシニアウイルスによる感染、染色のイメージング、および384ウェルプレートの解析を含め、ウイルス感染に寄与する宿主因子を特定するためのショウジョウバエにおけるRNAiスクリーニングの使用方法について十分に理解できるはずです。ウイルスを扱うことは非常に危険であるため、本手順の実施中は、常に白衣や保護メガネの着用などの予防措置を講じることを忘れないでください。生ウイルスはBSL-2バイオセーフティキャビネット内でのみ開封し、生ウイルスに接触したものはすべて、廃棄前に10%次亜塩素酸ナトリウムで滅菌してください。

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

RNA干渉は、遺伝子の機能を解析することは非常に効果的であることが証明されています...

dsRNAをインジェクションによるRNAiの干渉にショウジョウバエ胚

我々は、タンパク質の発現と局在の後胚レギュレータを識別するための増感方法について説明します。...

の後胚表現型を識別するためのRNAiスクリーニング C.エレガンス</em

このビデオでは、ポジティブセンスの一本鎖RNAウイルスを成体の雄のショウジョウバエにナノインジェクションする手順を説明し、その後、感染によって開始される抗ウイルス反応を研究します。ポリメラーゼ連鎖反応解析により、感染したハエの特定の遺伝子のアップレギュレーションが同定され、RNA干渉やJAK/STATシグナル伝達などの免疫応答経路の活性化が示唆されます。...

成虫のハエにおける宿主とウイルスの相互作用を研究するための胸腔内ウイルスナノ注射

本書の目的は、 キイロショウジョウバエの胚、細胞、および組織から抽出されたRNA上の強化されたノーザンブロットプロトコルの手術の手順を視覚化し、議論することである。このプロトコルは、小さなRNA種の効率的な検出のために特に有用である。...

低分子RNA種のノーザンブロット検出における強化キイロショウジョウバエ

ここで我々 はプロトコルを記述する腫瘍溶解性ウイルス治療を高めるために操作することができますホスト ターゲットを明らかにするハイスループット RNAi スクリーニングを採用するため特に rhabodvirus ワクシニア...

腫瘍溶解性ウイルス治療を調節するホストの要因を識別するために全ゲノム RNAi スクリーニング

このメソッドは、三次元 (3 D) モデルを昆虫細胞に病原体の侵入を視覚化する方法を示します。ショウジョウバエ幼虫から血液細胞は、細菌やウイルスの病原体、体外か体内に感染していた。感染した血球、固定され共焦点顕微鏡とそれに続く細胞三次元イメージングのステンド...

細菌感染や解析のためのキイロショウジョウバエ幼虫血球の抽出

アルボ ウイルス複製とアルボ ウイルス複製を制限する 2) 真核生物の宿主因子を促進する免疫調整物質 1) ウイルス エンコードを識別するためにプロトコルを紹介します。これら蛍光や発光を用いる方法は、急速に量的な読み出し信号対雑音比の低い単純なアッセイのアルボ...

アルボ ウイルス感染症ウイルス免疫調節剤およびホスト抗ウイルス因子の同定のためのスクリーニング ツールとして

このプロトコルでは、標準化し、蚊とハエの体液に直接核酸の特定の量を提供する数年間使用したマイクロインジェクションの方法論について説明します。このプロトコルは、最小限の注入の死亡率の結果し、多産の相関の線量測定が可能します。...

再現可能な dsRNA のインジェクションと蚊とハエの産卵生物検定

このプロトコルでは、キイロショウジョウバエナノ注入法と基本的なテクニックを使用して、ウイルスとの相互作用を分析する生体内でウイルス感染を確立する方法について説明します。...

ウイルス感染とキイロショウジョウバエのホスト ウイルスの相互作用の解析

このプロトコルでは、食細胞の認識および微生物感染症のクリアランスを定量化する大人のショウジョウバエの体内貪食アッセイについて説明します。...

ミバエショウジョウバエVivo で貪食能アッセイを使用しての細胞性免疫能を評価します。

我々は、ショウジョウバエメラノガスターで神経変性を示す変異体のスクリーニングに前方遺伝的アプローチを用いてプロトコルを提示する。登山アッセイ、血管解析、遺伝子マッピング、DNAシーケンシングを組み込み、最終的に神経保護のプロセスに関連する新しい遺伝子を同定します。...

ショウジョウバエメラノガスターの新しい神経保護遺伝子を同定する生体内前方遺伝スクリーン

学ぶRNAiスクリーニング法を用いて、ショウジョウバエ細胞でワクチニアウイルス感染に関与する宿主因子を同定する方法。蛍光顕微鏡による自動画像解析で感染率を定量化し、ウイルス宿主相互作用の研究に応用できます。

に関与する宿主因子のためのRNAiスクリーニングワクウイルス感染ショウジョウバエセル

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