ノーザンブロットは、植物組織の全RNA抽出物中の特定のマイクロRNAを検出し、定量します。

マイクロRNA(miRNA)は、小さな一本鎖ノンコーディングRNAです。miRNAは多タンパク質複合体に組み込まれ、さらに相補的な標的mRNA配列に結合して遺伝子発現を負に制御します。

植物組織由来の全RNAから特定のmiRNAを検出するには、トラッキング色素とホルムアミド(RNA変性剤)を含むゲルローディング色素を添加します。サンプルを加熱してRNAを変性させ、電気泳動の前に二次構造の形成を防ぎます。

サンプルと標準RNAマーカーを、事前に組み立てた変性ポリアクリルアミドゲルのウェルにロードします。電気泳動を実行すると、RNAフラグメントのサイズベースの分離が容易になります。

ゲルをエレクトロブロッティングカセット上のプレウェットフィルターペーパーに移します。緩衝液に浸したナイロンブロッティングメンブレンをゲル上に整列させます。次に、事前に濡らした濾紙を積み重ねます。エレクトロブロッティングを行います。

電流により、miRNAを含む負に帯電したRNAがゲルから正に帯電したナイロン膜表面に移動します。メンブレンを紫外線にさらします。これにより、RNAがメンブレンに架橋され、RNAの損失が防止されます。

非特異的結合部位を占めるブロッキング剤を含むハイブリダイゼーションバッファーでメンブレンをインキュベートし、バックグラウンドノイズを低減します。

標的miRNAに相補的な放射性標識RNAオリゴヌクレオチドプローブを添加して、特異的に結合します。メンブレンをバッファーで洗浄し、結合していないプローブを取り除きます。

蛍光体イメージングシステムを使用して、放射性ハイブリダイゼーション信号強度を検出および定量化します。高分解能シグナルは、植物組織における特異的なmiRNA発現を示しています。