Name: ホールマウントの胎児神経系の可視化ショウジョウバエ胚 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-11T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 8 s
Description: 学ぶショウジョウバエ胚のホールマウント神経系可視化法。胚収集、漂白処理、ヘプタン・メタノールによるビテリン膜除去、抗体染色、蛍光顕微鏡観察の手順を解説。発生神経科学の研究に有用です。

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SGは、ニューヨーク州立大学バッファロー校からとJohn R. Oishei財団からの資金によってサポートされています。

1。試薬の調製<ol><li> 100mMのパイプ、2mMのEGTA、1 mMのMgSO 4を用いてPEMFAバッファを準備します。 7.0バッファーのpHを調整する。 PEMFAバッファがフィルター滅菌し、4℃で保存されています</li><li>トリトンX - 100〜100ミリリットルの1X PBS（リン酸緩衝生理食塩水）液（pH7.0）の1mlを添加することによりPBTを準備します。 4℃で保存します。 </li><li> 1 × PBS（pH7.0）中0.01％NaAcideで5％BSA（ウシ血清アルブミン）を用意。 </li><li> 0.7パーセントのNaCl及び0.03％脱イオン水のトリトンX - 100を使用して食塩水を準備します。 </li><li> 1部37％ホルムアルデヒドで4つの部分PEMFAバッファを組み合わせることにより、固定剤を準備します。 </li></ol> 2。胚のコレクション<ol><li>寒天栄養プレートとアダプタを含むプラスチック製のボトルに&gt; 100ハエを配置することによって、関心のショウジョウバエのひずみのためにケージを準備します。 </li><li>ハエがケージに順応さと彼らの卵を保持しないように、プレート毎に8-12時間を変更し、72時間室温で暗所でハエのケージにしておきます。 </li><li>実験では12時間胚を収集する。コンテナからペトリ皿を取り外し、それを交換してください。削除されたペトリ皿を取り、生理食塩水ときれいなペイントブラシを使って皿から胚を洗浄する。 </li><li>目の細かいふるいで胚を収集する。余分な酵母を除去するために生理食塩水ですすいでください。 </li><li>スパチュラを使用すると、静かに胚をピックアップし、キャップ付きの小さなガラス瓶の中に置いてください。生理食塩水1mlの程度を追加。 </li></ol> 3。絨毛膜と卵黄膜の除去および固定<ol><li>胚のコレクションに続いて、50％ヘプタンと50％の固定剤の組み合わせにより、ヘプタン、修正溶液を調製。ソリューションは、上部と下部の固定液にヘプタンで取り入れようとしている。 </li><li>ガラス製バイアルに5分間塩水にそれらをインキュベートすることにより、胚を洗浄する。パスツールピペットを用いて過剰な生理食塩水を削除します。 </li><li>脱イオン水で胚を洗浄します。 </li><li> 3分間、50％の漂白剤でそれらをインキュベートすることにより、胚をDechorionate。 </li><li>脱イオン水で十分に胚を洗浄します。 </li><li>穏やかに振盪しながらヘプタン修正溶液中で30分間、それらをインキュベートすることにより、胚を修正。 </li><li>パスツールピペットを使用すると、チューブにヘプタンを残して、メタノールで固定剤（底層）を交換してください。卵黄膜を除去するために積極的に振る。 devitellinized胚は、チューブの底に沈むだろう。 </li><li>パスツールピペットを使用して、新しいガラス製バイアルに胚を収集する。メタノールで胚を5回リンス、それぞれの時間は5分間胚をインキュベートする。 </li></ol> 4。抗体染色、マウント、および可視化<ol><li> 50パーセントPBT溶液を、5分間50％メタノールの混合液に胚を再水和。その後5分間に100％のPBT溶液で再水和する。 </li><li> 4℃で1時間0.01％NaAcideのソリューション℃で5％BSAでそれらをインキュベートすることにより、胚をブロック</li><li>胚は、現在抗体染色のための準備が整いました。 0.01％NaAcide液で5％BSAを使用して適切な濃度に希釈して一次抗体を準備する。我々は、システインの文字列の蛋白質（CSP）、小胞のシナプス蛋白質と表面の糖タンパク質と、ラベルのすべてのニューロンに存在する神経細胞の特定の炭水化物部分を認識する抗- HRPまたは馬ラディッシュペルオキシダーゼ抗体、に対する抗体を使用してください。 </li><li>一晩4胚をインキュベートします一次抗体溶液にCを。 </li><li>次の日、時間かけPBTで胚を10回洗浄する。 </li><li>適切な濃度に希釈して二次抗体溶液を準備します。我々は、1:200の濃度でアレクサ二次抗体を使用してください。 </li><li> 4で2時間の胚をインキュベート° C二次抗体溶液インチ</li><li>時間かけPBTで胚を10回洗浄する。 </li><li> Vectashieldマウンティング培地で一晩胚をインキュベートする。 </li><li>ガラススライド上胚をマウントし、マニキュア液でカバースリップをシール。蛍光顕微鏡を用いて胚を視覚化する。 </li></ol> 5。代表的な結果<img src="/files/ftp_upload/2150/2150fig1a.jpg" alt="図1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図1"> CSP <img src="/files/ftp_upload/2150/2150fig1b.jpg" alt="図1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図1"> HRP - FITC <img src="/files/ftp_upload/2150/2150fig1c.jpg" alt="図1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図1"> マージ 図1：CSP（赤）とHRP（緑）に対する抗体を使用して、ステージ16から17で胚中枢神経系を示す代表的な画像。交連の異なる染色に注意してください。 <img src="/files/ftp_upload/2150/2150fig2a.jpg" alt="図2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図2"> CSP <img src="/files/ftp_upload/2150/2150fig2b.jpg" alt="図2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図2"> HRP - FITC "/&gt; マージ 図2：CSP（赤）とHRP（緑）に対する抗体を使用してステージ16から17で胚PNSを示す代表的な画像。末梢ニューロンの繰り返しパターンに注目してください。

<ol><li>Bodmer, R., Barbel, S., Sheperd, S., Jack, J. W., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+of+sensory+organs+by+mutations+of+the+cut+locus+of+D.+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Transformation of sensory organs by mutations of the cut locus of D. melanogaster.</a> Cell. 51, 293-307 (1987).</li>
<li>Bodmer, R., Carretto, R., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurogenesis+of+the+peripheral+nervous+system+in+Drosophila+embryos%3A+DNA+replication+patterns+and+cell+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Neurogenesis of the peripheral nervous system in Drosophila embryos: DNA replication patterns and cell lineages.</a> Neuron. 3, 21-32 (1989).</li>
<li>Campos-Ortega, J. A., Hartenstein, V. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCampos-Ortega%2C+JA+%22The+Embryonic+Development+of+Drosophila+melanogaster%22">The Embryonic Development of Drosophila melanogaster</a>. , Springer-Verlag. New York. (1985).</li>
<li>Carroll, S. B., Scott, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+the+fushi+tarazu+protein+during+Drosophila+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Localization of the fushi tarazu protein during Drosophila embryogenesis.</a> Cell. 43, 47-57 (1985).</li>
<li>Dambly-Chaudière, C., Ghysen, A., Jan, Y. N., Jan, L. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle+connections+between+imaginal+discs+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Muscle connections between imaginal discs in Drosophila.</a> Developmental Biology. 113, 288-294 (1986).</li>
</ol>

利害の衝突は宣言されません。

ショウジョウバエの胚では神経細胞の開発中に、細胞と分子の変化を調査するための強力なシステムです。このプロトコルでは、免疫組織化学のために全体のマウント胚を準備する方法を示している。私たちは、キャロルとスコット、1985年に記述されたプロトコルからこのプロトコルを適応している。このプロトコルはまた、他の神経細胞の抗体をテストするために適応させることができますが、抗体の最適化が行われる必要があります。さらに、胚PNSやCNSの発達障害は、別の突然変異系統から胚を比較することによって簡単に可視化することができる。私たちは正常にモータータンパク質の変異体を運ぶ胚におけるPNSとCNSを視覚化するためにこのプロトコルを使用している。高倍率下で我々はまた、胚PNSやCNS内に軸索のトラックを評価した。

<table><tbody><tr><td>37% ホルムアルデヒド</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP531-25</td><td></td></tr><tr><td>CSP</td><td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HRP-FITC</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>323-095-021</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568 Goat Anti-Mouse IgG</td><td>Invitrogen</td><td>A-11004</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield封入剤</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1000</td><td></td></tr></tbody></table>

ホールマウントの胎児神経系の可視化ショウジョウバエ胚

Visualization of the Embryonic Nervous System in Whole-mount Drosophila Embryos

ショウジョウバエの胚では神経発達の細胞および分子的基礎を調査するための魅力的なモデルシステムです。ここでは、ニューロンタンパク質に対する抗体を用いてショウジョウバエ胚神経系の視覚化のための手順を説明します。全体の胚性末梢神経および中枢神経系は、個々の細胞のレベル（。。; Bodmer ら、1987;。Dambly -オタワら 、1986 Bodmer ら 、1989）で特徴づけられるので、これらのシステムへの異常できます簡単に別のニューロンタンパク質に対する抗体を使用して識別される。胚は、胚が可視化するための適切な発達段階にあることを確認するために特定の時間に収集されます。収集した後、胚の外側の層、絨毛膜と胚を囲む卵黄のエンベロープは、固定前に削除されます。胚はその後、神経細胞の抗体とインキュベートし、蛍光標識二次抗体を用いて可視化されています。段階での胚は、12月17日胚の神経系へのアクセスを可視化されています。ステージ12で、中枢神経系胚帯は短縮を開始し、段階15で交連の決定的なパターンを実現しています。ステージ17によってCNS契約とPNSは、完全に（カンポス-オルテガら 1985）開発されています。したがって、PNSやCNSのパターンの変化は容易にこれらの発達段階で観察することができます。

我々は段階的な準備をする手順を説明<em&gt;ショウジョウバエ</em胚発生中の胚の神経系の視覚化のための&gt;胚。

ショウジョウバエの胚は、神経発達の細胞学的および分子的な基盤を研究するための優れたモデルシステムです。本稿では、...について説明します。

この手順の全体的な目的は、神経系のホールマウント可視化に向けて、ophおよびmelanogasterの胚を調製することです。まず、目的のショウジョウバエ系統から胚を回収します。次に、漂白剤を用いて卵膜を除去します。手順の第3段階では、ヘプタンとメタノールを用いてビリン膜を除去します。手順の最終段階では、胚に抗体を適用します。最終的に、免疫蛍光顕微鏡を通じて、ショウジョウバエ胚の神経系の構造を示す結果を得ることができます。この手法は、神経系が発達する過程において変異がどのような役割を果たすかなど、神経科学分野における重要な疑問を解決するのに役立ちます。一般的に、この手法に慣れていない方は、バイアルから胚を誤って吸い出してしまうことがあるため、習得に苦労する可能性があります。まず、P-E-M-F-A、0.01%アジ化ナトリウムを含む5%BSA含有PBC緩衝液、およびホルムアルデヒド固定液を含む、必要な試薬を準備してプロトコルを開始してください。二酸化炭素でフライを昏睡させ、リンゴジュースアガー餌用プレートを備えたアダプター付きプラスチックボトルに少なくとも100匹のフライを移し、目的のショウジョウバエ系統の飼育ケージを準備します。フライのケージを室温の暗所に72時間置きます。フライがケージに慣れ、実験のために産卵を抑制することがないよう、8〜12時間ごとにリンゴジュースアガー餌用プレートを交換してください。72時間の馴化期間の後、リンゴ汁寒天餌プレートの最終交換から12時間後に胚を回収します。産卵ケージからリンゴ汁寒天餌プレートを取り出し、生理食塩水を用いて交換します。リンゴ汁寒天餌プレートを洗浄してください。胚を細かい篩で回収します。清潔な絵筆を使用して、プレートに付着して残っている胚を剥がしてください。篩の中の胚を生理食塩水で洗浄して過剰な酵母を除去し、スパチュラを用いて胚をそっとすくい上げ、小さなガラスバイアルに入れます。生理食塩水を約1 mL加えます。その後、バイアルのキャップを閉め、胚を洗浄するために5分間インキュベートします。これにより、胚の回収が完了します。50% ヘプタンと 50% 固定液を混合して、ヘプタン固定溶液を調製します。この溶液は、上層にヘプタン、下層に固定液が層をなして分離します。5分経過後、パスタピペットを使用して、胚が入ったガラスバイアルから過剰な生理食塩水を抜き取ります。胚が入ったガラスバイアルに脱イオン水を約1mL加え、胚をすすぎます。1分間静置した後、水を抜き、50%漂白液を加えます。バイアルを手で数回振り、胚をコーティングするために3分間インキュベートします。処理した胚はバイアルの底に沈みます。胚のCORは浮上します。3分間のインキュベーション後、漂白剤とCORを除去してください。デコーレーション後、胚が入ったガラスバイアルに脱イオン水を約1 mL加え、胚を十分に洗浄します。1分間静置した後、水を排します。残ったCORは浮上するため、これらを除去してください。その後、ヘプタン固定液を胚に加え、緩やかに振盪しながら30分間インキュベートして固定します。パスタピペットを使用して、下層にある固定液を除去し、チューブ内にヘプタンを残します。次に、固定液の代わりにメタノールをチューブの底部に添加し、キャップをして手で激しく振ることで、卵黄膜を除去します。この操作の後、処理された胚はチューブの底に沈降します。パスタピペットを用いて、バイアルからメタノールとヘツを除去し、脱イオン化された胚のみを残します。その後、胚をメタノールで5回洗浄し、各洗浄の間にパスタピペットでメタノールを除去します。各洗浄において、胚を5分間インキュベートしてください。胚を50% PBT溶液と50% メタノールの混合液に5分間浸し、再水和させます。続いて、100% PBT溶液に移して5分間置くことで、再水和プロセスを継続します。次に、0.01% アジ化ナトリウムを含む5% BSA溶液中で、4°Cで1時間インキュベートし、胚をブロッキングします。次に、0.01%アジ化ナトリウム含有5%BSA溶液を用いて一次抗体を適切な濃度に希釈し、胚染色のための一次抗体を調製します。ここでは、小胞性システインストリングタンパク質に対する抗体およびanti-HRP抗体を使用します。Anti-HRPは表面糖タンパク質に存在する神経特異的な糖鎖部位を認識し、すべてのニューロンを標識します。胚を一次抗体溶液中で4 °Cにて一晩インキュベートします。1時間かけて、PBTで胚を10回洗浄します。胚が入ったガラスバイアルに約1 mLのPBTを加え、6分間静置してからPBTを除去します。PBTの塗布、インキュベーション、およびPBTの除去というこの工程を10回繰り返します。二次抗体溶液は光に敏感であるため、適切な濃度に希釈して暗所で調製します。ここでは、Alexa二次抗体を1:200の濃度で使用します。胚を二次抗体溶液中で、4 °Cで2時間インキュベートします。光への曝露を避けるため、胚と二次抗体溶液が入ったガラスバイアルをアルミホイルで包みます。1時間かけて、PBTで胚を10回洗浄します。胚にVector Shield封入剤を加え、4 °Cで一晩インキュベートして封入します。パステルピペットを用いて、封入剤とともに胚を吸い上げます。胚と封入剤をガラススライドに載せます。胚の上にカバーガラスを掛け、ネイルポリッシュでカバーガラスを密封します。ここで、蛍光顕微鏡を用いて胚を観察します。ステージ16から17の胚の中枢神経系（CNS）が示されています。シスチンストリングタンパク質を赤色で、HRPニューロンを緑色で示しています。この代表的な画像において、交連部が明確に染色されていることに注目してください。胚性のPNSがステージ16から17に示されています。ここでも、cystine string proteinが赤色で、ニューロンが緑色で示されています。末梢ニューロンの反復パターンに注目してください。この手順を行う際は、胚を誤ってバイアルから取り出さないよう、十分に注意することが重要です。このビデオを視聴することで、神経系のホールマウント可視化に向けた oph fla 胚の調製方法について、十分に理解できるはずです。

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出典:Jeong, S. Visualization of the Axonal projection pattern of the Embryonic motor neurons in Drosophila.J. Vis. Exp.

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