ホールマウントの胎児神経系の可視化ショウジョウバエ胚

この手順の目的は、神経系のホールマウント可視化のために、ophおよびmelanogasterの胚を調製することです。まず、目的のショウジョウバエ系統から胚を回収します。次に、漂白剤を用いて卵殻（corium）を除去します。

手順の3番目のステップは、ヘプタンとメタノールを適用してビリン膜を除去することです。手順の最終ステップは、胚に抗体を適用することです。最終的に、免疫蛍光顕微鏡法を通じて、ショウジョウバエ胚の神経系の構造を示す結果を得ることができます。

この手法は、神経系の発達において変異がどのような役割を果たすかなど、神経科学分野における重要な疑問への回答に役立ちます。一般的に、この手法に不慣れな人は、誤ってバイアルから胚を吸い出してしまうことがあるため、苦労することがあります。まず、P-E-M-F-A、0.01% sodium azideを含むPBC 5%BSA緩衝生理食塩水、およびホルムアルデヒド固定液を含む、必要となる試薬の調製からこのプロトコルを開始してください。

二酸化炭素でフライを気絶させ、リンゴジュースアガールの餌プレートを備えたアダプター付きプラスチックボトルに100匹以上のフライを移し、目的のショウジョウバエ系統のケージを準備します。フライを入れたケージを室温の暗所に72時間置きます。フライをケージに慣らし、実験のために産卵を抑制させないよう、8〜12時間ごとにリンゴジュースアガールの餌プレートを交換してください。

72時間の馴化期間後、リンゴジュース寒天餌皿の最終交換から12時間後に胚を回収します。産卵ケージからリンゴジュース寒天餌皿を取り出し、生理食塩水を用いて交換します。リンゴジュース寒天餌皿をすすいでください。

胚を細かいふるいで回収します。きれいな絵筆を使用して、プレートに残っている胚をすべてかき出します。ふるいの中の胚を生理食塩水で洗浄し、余分な酵母を取り除きます。スパチュラを使用して、胚をそっとすくい取り、小さなガラスバイアルに入れます。

生理食塩水を約1 mL加えます。その後、バイアルにキャップをして5分間インキュベートし、胚を洗浄します。これで胚の回収が完了します。

50%のヘプタンと50%の固定液を混合し、ヘプタン固定溶液を調製します。この溶液は、上層にヘプタン、下層に固定液の二層状になります。5分後、パスタピペットを用いて、胚が入ったガラスバイアルから余分な生理食塩水を回収します。

胚が含まれているガラスバイアルに脱イオン水を約1 mL加えて、胚をすすぎます。1分間静置した後、水を抜き、50%漂白剤溶液を加えます。バイアルを手で数回振り、胚をコーティングするために3分間インキュベートします。

処理された胚はバイアルの底に沈みます。胚のCORsは浮上します。3分間のインキュベーション後、漂白剤とCORsを除去します。

装飾後、胚が入ったガラスバイアルに約1 mLの脱イオン水を加え、胚を十分に洗浄します。水を捨てる前に、胚を1分間静置します。浮遊しているCORは取り除いてください。胚にヘプタン固定液を加え、緩やかに振盪しながら30分間インキュベートして固定します。

パスタピペットを使用して、下層にある固定液を除去し、チューブ内にヘプタンを残します。次に、固定液の代わりにメタノールをチューブの底部に加え、チューブに蓋をして手で激しく振ることで、卵黄膜を除去します。この操作後、処理された胚はチューブの底に沈みます。

パステールピペットを使用して、脱イオンされた胚を残し、バイアルからメタノールと不純物を除去します。次に、胚をメタノールで5回洗浄し、各洗浄の間にパステールピペットでメタノールを除去します。各洗浄において、胚を5分間インキュベートしてください。

胚を50% PBT溶液と50% メタノールの混合液に5分間浸し、再水和させます。次に、100% PBT溶液に5分間移して、再水和処理を継続します。その後、0.01% アジ化ナトリウムを含む5% BSA溶液中で、4°Cで1時間インキュベートし、胚をブロッキングします。

次に、0.01%アジ化ナトリウムを含む5%BSA溶液を用いて一次抗体を適切な濃度に希釈し、胚染色用の準備を行います。ここで使用する抗体は、小胞性システインストリンギンタンパク質に対する抗体およびanti HRP抗体です。Anti HRPは、表面糖タンパク質に存在する神経特異的な糖鎖部位を認識し、すべてのニューロンを標識します。

胚を一次抗体溶液中で4 °Cにて一晩インキュベートします。1時間かけて、PBTで胚を10回洗浄します。胚が入ったガラスバイアルに約1 mLのPBTを加え、6分間静置してからPBTを除去します。

PBTの適用、インキュベーション、およびPBTの除去というこの工程を10回繰り返します。二次抗体溶液は光感受性であるため、適切な濃度に希釈して暗所で調製してください。ここでは、1:200の濃度でAlexa二次抗体を使用します。

胚を二次抗体溶液中で4 °Cで2時間インキュベートします。光への曝露を避けるため、胚と二次抗体溶液が入ったガラスバイアルをアルミホイルで包みます。1時間かけて、PBTで胚を10回洗浄します。

胚にVector Shield封入剤を加え、4 °Cで一晩インキュベートして封入します。パステールピペットを用いて、封入剤と共に胚を吸い上げます。胚と封入剤をガラススライドに塗布します。

胚の上にカバーガラスをかけ、ネイルポリッシュでカバーガラスを封印します。ここで蛍光顕微鏡を用いて胚を観察します。胚のCNSはステージ16から17の状態で示されています。

シスチンストリングタンパク質を赤色で示しています。HRPニューロンを緑色で示しています。この代表的な画像において、交連部が明確に染色されていることに注目してください。

ステージ16から17における胚の末梢神経系（PNS）を示しています。ここでも、シスチンストリングタンパク質を赤色で、ニューロンを緑色で示しています。末梢ニューロンの繰り返されるパターンに注目してください。

本手順を実施する際は、胚を誤ってバイアルから取り出さないよう十分に注意することが重要です。このビデオを視聴することで、神経系のホールマウント可視化に向けた oph fla 胚の調製方法を十分に理解できるはずです。