RNAを含むオリゴヌクレオチドを​​使用して変換によるゲノムDNAのRNA / DNAハイブリッドの世代

本実験の全体的な目的は、RNA含有オリゴヌクレオチドを酵母細胞に導入することで、生きた酵母細胞の染色体レベルでRNA-DNAハイブリッドを生成することです。これは、分裂中の酵母細胞に単鎖のRNA含有オリゴヌクレオチドを導入することによって達成されます。その後、このオリゴヌクレオチドが酵母染色体上の変異マーカー遺伝子の相補的領域とアニールし、RNA-DNAハイブリッドを形成します。第2段階として、RNA含有オリゴヌクレオチドによって形質転換された細胞を選択培地でプレートします。

これにより、オリゴのRNA部分が変異したマーカー遺伝子の修復テンプレートとして機能する条件下で細胞を増殖させることができます。次に、RNA含有オリゴによる遺伝子修復頻度を確認するため、選択培地上の酵母コロニー数を計測します。その結果、オリゴのRNA鎖から酵母ゲノム内の変異マーカー遺伝子への遺伝情報の転移が明らかになります。これは、制限酵素消化分析、配列解析、およびアルカリ感受性アッセイによって実証されます。

こんにちは。ジョージア工科大学生物学部、フランチェスカ博士の研究室を代表して、本手法をご紹介します。今回は、生存している酵母細胞内の染色体レベルでRNA-DNAハイブリッドを生成する手順について説明します。当研究室ではこの手法を用いて、ゲノムDNAに組み込まれたRNAの存在が細胞にどのように許容されるかを探求し、in vivoにおけるRNA-DNAハイブリッドの安定性に影響を与える要因を特定しています。

それでは、開始しましょう。この手順を始める前に、オリゴチューブ、ピペット、ボルテックスラック、実験エリア、および研究者が着用する手袋を含め、実験に使用するすべての器具をRNA除染溶液で拭いてください。潜在的なRNA汚染を取り除くため、手順全体を通してRNAフリー水、化学試薬、チューブ、およびピペットチップを使用してください。

酵母細胞のゲノムDNAに遺伝情報を転移させるための、RNAを含むオリゴヌクレオチドを調製します。ここで使用する酵母株は、2塩基の欠失と1つのナンセンス変異を持つtrip five遺伝子の変異体を含んでいます。このような酵母株はトリプトファン要求性変異株であり、トリプトファンを含まない培地ではコロニーを形成しません。

RNA含有オリゴは、欠失変異を修正するために設計された2塩基のDNA挿入を含む65 MERです。さらに、このオリゴには、trip fiveアレル（対立遺伝子）のナンセンス変異を修正するためのリボヌクレオチドが1つ含まれています。得られたRNA含有オリゴを、書面によるプロトコルに従って250 µMのストック溶液として調製します。RNA含有オリゴを用いた形質転換の16時間前に、接種を行います。

YPD（酵母ペプトンデキストロース）リッチ液体培地5 mLにtrip5変異酵母細胞を接種し、30 °Cで一晩培養します。一晩の培養後、 overnight培養液1.5 mLを50 mLのYPD液体培地に移します。形質転換の直前に、細胞を30 °Cの振盪機を用い、225 rpmで4時間培養します。

RNA含有オリゴヌクレオチドおよび対応するDNAのみのオリゴヌクレオチドを氷上に置きます。対応するDNAのみのオリゴヌクレオチドはポジティブコントロールとして使用します。RNaseフリーチューブを用い、RNaseフリー水でオリゴヌクレオチドを50 micromolarに希釈します。

1 molの形質転換を3回分行い、かつ十分な過剰量の変性剤を含めるため、各オリゴを70 µLずつ準備します。オリゴの二次構造を除去するため、RNA含有オリゴおよびDNAのみのオリゴを100 °Cのヒートブロックで2分間加熱し、変性直後にチューブを氷上に置いて形質転換まで保持します。形質転換の直前に、RNaseフリーチューブを用いて溶液1および溶液2を調製します。細胞培養液を50 mLのRNaseフリーチューブに移し、3000 rpm（1,562 ×gに相当）で2分間遠心分離します。

上清を除去し、50 mLのRNaseフリー水で細胞を洗浄します。再び3000 rpmで2分間、細胞を遠心分離します。この工程を5回繰り返し、培養液および残存する可能性のあるRNaseを除去します。

上清を除去し、細胞を5 mLの溶液で再懸濁します。1. サンプルを3000 rpmで2分間遠心分離し、上清を捨てて、細胞に溶液1を250 µL加えます。この細胞量で7～8回の形質転換が可能です。

細胞懸濁液を50 µLずつ、RNAフリーのマイクロ遠心チューブ7本に分注します。次に、3本のチューブに50 µMのRNA含有オリゴを20 µL、別の3本のチューブに50 µMのDNAのみのオリゴを20 µL、そして陰性対照としてオリゴを含まない滅菌水を1本のチューブに20 µL加えます。

次に、7つの形質転換反応それぞれに溶液2を300 µLずつ加えます。サンプルを激しくボルテックスして成分を混合します。その後、シェーカーを用いて、形質転換反応液を30 °Cで30分間インキュベートします。

サンプルを42 °Cで15分間ヒートショック処理します。次に、5,000 rpm（2,236 ×gに相当）で4分間遠心分離します。上清を除去し、3本のチューブのそれぞれに100 µLの滅菌水を加えて細胞を再懸濁します。

この細胞懸濁液のアリコートを取り、それぞれを滅菌水で100,000倍に希釈します。プレートあたり約15個の滅菌ガラスビーズを加え、100,000倍に希釈した細胞液100 µLを3枚のYPDプレートに播種します。また、各形質転換反応から再懸濁した細胞100 µLを、トリプトファン欠損合成完全固体培地のペトリ皿1枚に播種し、プレートを均一に振盪します。

次にビーズを除去します。YPDプレート上の細胞を30 °Cで2日間、トリプトファン欠損合成完全固形培地に播種した細胞を30 °Cで4〜5日間インキュベートします。選択培地およびYPD培地で生育したコロニー数をカウントして比較し、RNA含有オリゴ、DNAのみのオリゴ、およびオリゴなしコントロールにおける遺伝子矯正効率を算出します。

オリゴヌクレオチドを添加しなかった場合には、選択培地上にコロニーは形成されないことが予想されます。ランダムにピックアップした形質転換コロニーを数個、YPD培地にストリークし、単一コロニー分離株を得ます。コロニーを成長させるため、細胞を30 °Cで2日間培養します。培養後、数個の単一コロニーをピックアップし、YPD培地および選択培地上にパッチを形成させます。

1日間の培養後、トリプトファン欠損合成完全固体培地において、オリゴを形質転換した細胞では増殖が観察されますが、選択的なトリプトファン欠損合成完全固体培地上のオリゴなしコントロール株では観察されません。次に、コロニーPCRを開始するため、RNA含有オリゴによって標的となった領域を増幅させるプライマーペアを設計します。個々のパッチから採取した細胞を、1 unitのリアーゼを含む50 µLの水に再懸濁し、サンプルを室温で10分間インキュベートした後、ヒートブロックを用いて100 °Cで5分間インキュベートし、細胞を溶解させてゲノムDNAを溶液中に放出させます。

PCRチューブを用いてPCR反応液を調製し、設定した各チューブに細胞懸濁液を10 µLずつ加え、記載のプロトコルに従って増幅反応を行います。得られたサンプルを1%アガロースゲルで電気泳動し、PCR産物を確認します。本実験でoligoを含むRNAによって転移された遺伝情報は、酵母ゲノムの標的領域に新たなVAN 91 1制限酵素部位を形成するため、PCR産物をVAN 91 1制限酵素で消化することで、情報の正確な転移を検証することが可能です。

PCR産物バッファー6 µL、BSA 0.5 µL、制限酵素、および滅菌水を加えて全量を15 µLとした消化反応液を調製します。サンプルを37 °Cで1時間インキュベートします。RNA含有オリゴのRNAトラクトによって導入された遺伝子改変を確認するため、未消化サンプルと消化サンプルを同一行の2%アガロースゲルで電気泳動します。

PCR精製キットを用いてPCR産物を精製し、DNAシーケンシングのための準備を行います。産物の増幅に使用したものと同じプライマーを用いて、サンプルのシーケンシングを依頼してください。最後に、選択したリファレンス配列と複数の配列をアライメントできるソフトウェアを使用してDNAシーケンシング結果を解析し、各反応につき1 molのRNA含有オリゴまたはDNAのみのオリゴを1.5 milliliterチューブに入れ、RNA含有オリゴのアルカリ処理を行います。

次に、加水分解用に1 M 水酸化ナトリウムを4 µL、または陰性対照用に水を4 µL加えます。その後、サンプルをウォーターバスを用いて65 °Cで1時間インキュベートします。反応液を氷上に移します。

ネガティブコントロールには、1.2 M 塩酸 2 µL、1 M Tris-HCl 4 µL、および水 4 µL を加えて加水分解反応を中和します。さらに、水 6 µL と 1 M Tris-HCl 4 µL を添加します。サンプルは、形質転換が行えるまで氷上で保持してください。

上述の通り、オリゴヌクレオチドを導入せずに形質転換した酵母細胞は、トリプトファン欠損合成完全固体培地上でコロニーを形成しません。対照的に、RNA含有オリゴヌクレオチドを導入して形質転換した後にトリプトファン欠損合成完全固体培地で培養した細胞では、コロニーが形成されます。

1 nanomoleの対応するDNAのみのコントロールオリゴのみを形質導入した後に、トリプトファン不含の合成完全固形培地で酵母コロニーが成長します。RNA含有オリゴから酵母染色体DNAへの遺伝情報転移の検出は、図に示すように、標的ゲノム領域を増幅したPCR産物をVAN 91 1で制限酵素消化することによって明らかになります。trip. Five変異株のゲノムDNAから増幅されたtrip. Five遺伝子座のPCR産物を確認できます。

また、DNAのみのオリゴによって標的とされたtrip plusコロニー由来のゲノムDNAから増幅されたPCR産物も示されています。RNA含有オリゴによって標的とされたtrip plusコロニー由来のゲノムDNAから増幅されたPCR産物についても、同様にゲル電気泳動を行いました。これらのPCR産物をvan 91 1で制限酵素消化した結果、278 base pairの増幅PCRバンドと、van 91 1による消化産物である177 base pairsおよび101 base pairsのバンドが認められました。

DNAシーケンシングにより、RNA含有オリゴによる遺伝子矯正が明らかになります。ここでは、RNA含有オリゴの標的となったゲノム領域のDNAエレクトロフェログラムを示しています。DNA配列中のgは、RNA含有オリゴのRGに由来します。

また、DNAのみのオリゴおよびRNA含有オリゴによってターゲットとされたtrip five領域のCG塩基配列の挿入が枠で囲まれています。これらはコンセンサス配列に一致しており、オリゴによるターゲット前のtrip five変異細胞の配列と比較されています。下部の修復RNA含有オリゴには、2塩基のDNA挿入と1塩基のRNA置換があります。

青い枠線と黄色の網掛けで示された領域は、RNA含有オリゴおよびDNAのみのオリゴの両方が、テストしたすべてのサンプルにおいて欠失変異およびナンセンス変異を正確に修復したことを示しています。破線はRNA含有オリゴ配列の位置を示しています。アルカリ処理はRNA含有オリゴによる遺伝子修復を阻害します。RNA含有オリゴおよびDNAのみのオリゴによる形質転換頻度を示しています。エラーバーは、各オリゴについて3回の独立した形質転換の平均標準誤差を表しています。

DNAのみのオリゴヌクレオチドは、水酸化ナトリウム処理の有無にかかわらず同様の形質転換効率を示します。対照的に、RNAを含むオリゴヌクレオチドによる形質転換効率は、水酸化ナトリウム処理後にゼロまで低下します。したがって、RNAを含むオリゴヌクレオチドの調製物は、DNAのみのオリゴヌクレオチドによって混入されていないことがわかります。

したがって、観察された形質転換頻度は、RNAを含むオリゴヌクレオチドに特異的なものです。ここまで、染色体レベルでRNA-DNAハイブリッドを形成する方法と、酵母細胞におけるRNAからゲノムDNAへの遺伝情報の逆転写について解説しました。この手順を行う際は、RNAを含むオリゴヌクレオチドの品質を極めて高く保つこと、およびRNaseフリーの条件下で作業することを忘れないでください。

以上です。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りいたします。