Name: 培養一次マウス胚線維芽細胞におけるシグナル伝達分子のアデノウイルス媒介遺伝子除去 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-09-09T17:00:00.000+00:00
Duration: 11 min
Description: 学ぶアデノウイルスを用いた一次マウス胚線維芽細胞におけるRac1遺伝子除去法。Creロキシーゼによる効率的な遺伝子発現制御とアクチン動態の解析に応用可能です。

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著者らは、プライマリRac1のFLOX / FLOXマウス胚線維芽細胞の彼の贈り物のためにトロント、オンタリオ州マウントサイナイ病院のDr。Rizaldyスコットに感謝します。この作品は、健康研究（CIHR、MOP 2009から93526）と自然科学とカナダの工学研究審議会（NSERC、RG 327372〜06）のカナダの協会からニュージャージー州まで営業の補助金によって支えられている。 SHとMWは、それぞれ、CIHRとNSERCからCGSMAとCGS - Mの賞でサポートされています。 スティーブハーレイとメラニーのウィルズは、この論文にも同様に貢献した。

融解細胞<ol><li>液体窒素から凍結マウス胚性繊維芽細胞（MEF）を（個々の胚初代培養から、以前に生成される）を取得。 </li><li> 37バイアルを浸漬し融解のセル内容が完全に融解するまで渦巻く° Cの水。 </li><li> 10cmの細胞培養プレートに10％ウシ胎児血清および1％ペニシリン - ストレプトマイシンを補充されたDMEMの9mLを追加。 </li><li>プレートに滴下融解した細胞懸濁液を追加し、37℃、5％CO 2インキュベーターで一晩細胞と場所のプレートを分散させるために軽くプレートを揺らし。プレート（約4時間後メッキ）に付着した細胞は、DMSO（凍結プロセスから）に敏感な場合、初期メディアが、細胞の後に新鮮な培地と交換できることに注意してください。また、凍結した細胞の数は、凍結後の細胞の回収率、および細胞の増殖速度に依存して解凍後の細胞のその合流点に注意してください。 </li></ol>継代細胞<ol start="5"><li>細胞がコンフルエントに本質的に100％（例：次の日）に成長しているときに、メディアをオフに吸引し、滅菌PBS 5mlの細胞を洗浄する。 </li><li> PBSを削除し、細胞がプレートからデタッチするまで、約5分間インキュベーターに10mMのEDTAと場所のプレートを含むトリプシン液1mLを加える。 </li><li>細胞がはがれるしたら、、塊を分散メディアの9mLを含む新しいプレート上に滴下この懸濁液1mLを追加し、37℃インキュベーターで一晩にこれを置くためにトリプシン処理細胞にメディアの9mLを加え、ピペット2-3回。メディアのFBSの存在が交互にトリプシンを不活性化する、細胞をトリプシンを希釈する最初の洗浄することができます。 </li></ol>カバースリップ上に細胞をカウントし、めっき<ol start="8"><li>インキュベーターから細胞を除去する、この時間を除いてバックの代わりに9mLのトリプシン処理細胞に5 - 6mLメディアを追加し、以前と同様に洗浄し、トリプシン処理。 </li><li>ピペットは、細胞の単一細胞の懸濁液中に完全な解離を確実に、そして別のマイクロチューブにトリパンブルーの15μLと組み合わせること15μL削除する。 </li><li>数回上下にピペッティングして、このセル/トリパンブルーサスペンションを混合し、血球計算盤に15μL加える。 </li><li>顕微鏡下で、死細胞は青色表示されます。血球計算板で4X4のグリッドのいずれかで、明確な/無色（生きた）細胞の数を数えます。他の3つの4X4のグリッド（A、B、CとDと表される）で、​​このカウントを繰り返して、サスペンションのμLあたりのセル数を求めるには、以下の計算式を使用します。 <img src="/files/ftp_upload/2160/2160eq0.jpg" alt="式1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="式（1）"></li><li>プロトコルの最適化を通じ、我々は、実験の終了時に可視化のために適切な細胞密度に30,000細胞の結果をメッキすることを決定した。 </li><li> 30,000細胞に必要な細胞懸濁液の体積を計算するには、次の式を使用します。 <img src="/files/ftp_upload/2160/2160eq1.jpg" alt="式2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="式（2）"></li><li>現在6つのウェルディッシュの各ウェルに滅菌ガラスカバースリップを配置し、各ウェルにメディアの2mLのを追加して、細胞懸濁液30,000細胞に必要な量から各ウェルに滴下追加。我々は、後の時点で蛍光顕微鏡を用いて細胞を可視化されるようにガラスのカバースリップがこの実験のために使用されることに注意してくださいではないすべてのアプリケーションは、必ずしも顕微鏡を必要とし、したがって、伝票が必要とされていない可能性がありますカバーします。 </li></ol>ウイルスの形質導入<ol start="15"><li>数時間または一晩（細胞はカバースリップに従っていることを保証するために十分な時間）の後、メディアを取り出し、無血清DMEM 1mLの細胞を洗浄する。 </li><li>ウイルスの追加のために各ウェルに無血清培地1mLのを追加。この実験では、アデノウイルスのCreはベクトルBiolabs社から商業的に入手した。 </li><li>以前のプロトコルの最適化は、500の感染多重度が（MOI）細胞の生存にほとんど、あるいはまったく効果が主のMEFに非常に効率的な遺伝子導入を提供することが示されている。 MOIは次のように計算することができます。 <img src="/files/ftp_upload/2160/2160eq2.jpg" alt="式3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="式（3）"> <img src="/files/ftp_upload/2160/2160eq3.jpg" alt="式4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="式（4）"></li><li>感染している各ウェルに直接ウイルスの計算量を追加して、ゆっくりと一晩37℃のインキュベーター中にウイルスや場所の細胞を分散させるためにプレートを揺らし。 </li><li>翌朝は、ウイルスを含む細胞から培地を除去し、1mLの滅菌PBSで細胞を洗浄し、各ウェルに定期的なメディアの2mLの追加。 </li><li>この実験において例示Rac1の細胞の場合には、形態学的変化は、約72時間後に伝達における細胞内で発生した。 </li></ol>代表的な結果視覚化された細胞アクチン染料ファロイジン（イメージングのためだけに）で染色し、ゲルフ大学の高度な分析センターでライカTCS - SP5多光子共焦点レーザー走査型顕微鏡を用いて画像によるd。図1は、ウイルスにさらされていない同じ細胞と比較して、アデノのCreのウイルスにさらされたRac1のFLOX / FLOX細胞の収縮と伸長形態を示しています。 <img src="/files/ftp_upload/2160/2160fig1.jpg" alt="図1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図1"> 図1と同じソース（右）から非感染細胞と比較してアデノウイルスのCre（左）に感染してRac1のFLOX / FLOXセル間の比較。

<ol><li>Guo, F., Debidda, M., Yang, L., Williams, D. A., Zheng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+Deletion+of+Rac1+GTPase+Reveals+Its+Critical+Role+in+Actin+Stress+Fiber+Formation+and+Focal+Adhesion+Complex+Assembly%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Genetic Deletion of Rac1 GTPase Reveals Its Critical Role in Actin Stress Fiber Formation and Focal Adhesion Complex Assembly.</a> J. Biol. Chem. 281, 18652-18659 (2006).</li>
<li>Glogauer, M., Marchal, C. C., Zhu, F., Worku, A., Clausen, B. E., Foerster, I., Marks, P., GP, D. owney, Dinauer, M., Kwiatkowski, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rac1+deletion+in+mouse+neutrophils+has+selective+effects+on+neutrophil+functions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Rac1 deletion in mouse neutrophils has selective effects on neutrophil functions.</a> J. Immunol. 170, 5652-5657 (2003).</li>
<li>Prost, S., Sheahan, S., Rannie, D., Harrison, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenovirus-mediated+Cre+deletion+of+floxed+sequences+in+primary+mouse+cells+is+an+efficient+alternative+for+studies+of+gene+deletion%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Adenovirus-mediated Cre deletion of floxed sequences in primary mouse cells is an efficient alternative for studies of gene deletion.</a> Nucleic Acids Res. 29, E80-E80 (2001).</li>
<li>Rijnkels, M., Rosen, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenovirus-Cre-mediated+recombination+in+mammary+epithelial+early+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Sci%22%5BJournal%5D)">Adenovirus-Cre-mediated recombination in mammary epithelial early progenitor cells.</a> J. Cell. Sci. 114, 3147-3153 (2001).</li>
<li>Vidali, L., Chen, F., Cicchetti, G., Ohta, Y., Kwiatkowski, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rac1-null+mouse+embryonic+fibroblasts+are+motile+and+respond+to+platelet-derived+growth+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Rac1-null mouse embryonic fibroblasts are motile and respond to platelet-derived growth factor.</a> Mol. Biol. Cell. 17, 2377-2390 (2006).</li>
<li>Wang, H., Xie, H., Zhang, H., Das, S. K., Dey, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditional+gene+recombination+by+adenovirus-driven+Cre+in+the+mouse+uterus%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Conditional gene recombination by adenovirus-driven Cre in the mouse uterus.</a> Genesis. 44, 51-56 (2006).</li>
</ol>

動物実験は動物のケアに関するカナダの理事会が定めるガイドラインおよび規則に従って行った。

付属のビデオでは、組換えウイルスはCreリコンビナーゼを用いた in vitro における消費税の特定の遺伝子にどのように使用できるかを例示している。このプロトコルの開発は、しかし、アドレッシング価値があるいくつかの特定の点を明らかにしました。 <ul><li>アデノウイルスを使用する際、適切な安全手順を常に使用すべきである。ウイルスでの作業中に白衣と手袋を常に着用してください。メディアとプラスチック容器は、少なくとも30分間、10％の漂白剤で治療されるべきである、とプラスチック製の食器は、その後オートクレーブしてください。 </li><li>これはウイルスの力価に影響を与えるため、導入効率を減らすことができるように繰り返されたウイルス株の凍結融解は避けてください。ウイルスストックの小さなボリュームは別々のチューブに等分されるべきである。 </li><li> 50から500に至るまでMOISは、メソッドの開発中にテストされたと効率的な伝達率は、細胞の生存に悪影響することなく、ほとんどのケースで観察された。 </li><li>アデノ- GFPは、迅速形質導入効率をスクリーニングする方法の開発中に使用されていました。このコントロール（または空のベクター）は、細胞の変化が発生しないだけで、ウイルス感染を確保するため、実験中に実施されるべきである。同様に、あなたの細胞への関心のfloxed遺伝子を切り出すことはあらゆる細胞の変化（形態や生存率、すなわち変化）が発生しない場合は、アデノ- GFPと同じ細胞型を感染させると、そのウイルスの伝達を示すために使用することが重要コントロールですです発生。 </li></ul>文化のシグナル伝達カスケードをの調査を超えて、アデノのCreのアプローチはまた、条件付きで実験動物3,4からの遺伝子を除去するため、および生物6内の細胞の特定の集団を標識するためにin vivoで採用されている。アデノウイルスシステムはまた、宿主細胞にCreリコンビナーゼ以外の遺伝子を導入するために適応させることができます。この送達ベクターを使用しての二つの主要な利点はその高い伝達と遺伝子デリバリー効率、及び宿主DNAとの統合の欠如です。しかし、新規な組換えアデノウイルスの発生は、労働集約することができます。プロトコルは、したがって、ここで説明する以前に開発されたアデノのCreのウイルスを利用する、と関心、Rac1の私​​たちのfloxed対立遺伝子とのことをカップリングさせることによりアデノウイルスシステムのパワーを利用。実験からこの条件ノックを通じ、我々はfloxed Rac1の対立遺伝子を運ぶMEFのアデノのCreのウイルスを使用して、その伝達を確認していることは確かにRac1の切除は、Rac1の欠損細胞の細胞形態の特徴2,5の変化につながる可能性がありません。

<table><tbody><tr><td>Ad-CMV-Cre ウイルス</td><td>Vector Biolabs</td><td>1045</td><td></td></tr><tr><td>DME 高グルコース培地 500mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH3002201</td><td></td></tr><tr><td>FBS カナダ産 500mL</td><td>VWR international</td><td>CAA15-701</td><td></td></tr><tr><td>PEN-STREP 1X 溶液 100mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>SV30010</td><td></td></tr><tr><td>Texas Red-X ファロイジン</td><td>Invitrogen</td><td>T7471</td><td></td></tr><tr><td>トリプシン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4549</td><td></td></tr></tbody></table>

培養一次マウス胚線維芽細胞におけるシグナル伝達分子のアデノウイルス媒介遺伝子除去

Adenovirus-mediated Genetic Removal of Signaling Molecules in Cultured Primary Mouse Embryonic Fibroblasts

遺伝的に様々な細胞のシグナル伝達カスケードの特定のコンポーネントを削除する機能は、近代的なシグナル伝達の解析に不可欠なツールとなっています。この条件の削除を実現する一つの特定のメソッドでは、Cre - loxP組システムの使用を介してです。このメソッドは、Creリコンビナーゼのタンパク質に特異的な認識配列であるloxP部位、で目的の遺伝子に隣接伴います。 Creを介した組換えloxP部位でのイベント、および介在する遺伝子3のその後の切除でこの酵素の結果に、いわゆるfloxed（loxP部位によって挟まれた）DNAの露出。いくつかの異なる方法は、興味のあるサイトにCreリコンビナーゼを管理するために存在します。このビデオでは、我々はfloxed Rac1の対立遺伝子1を含む胚から得られた一次マウス胚性繊維芽細胞（MEF）を感染させるためにCreリコンビナーゼ遺伝子を含むアデノウイルスの使用を示します。私たちの実験のためにRac1のMEFのを選択するための論理的根拠は、その明確な形態学的変化が原因でアクチン細胞骨格の2,5の変化に、Rac1の削除時に見られるようです。ウイルスの形質導入とCreの発現後72時間は、細胞はアクチン染料ファロイジンを用いて染色し、共焦点レーザー走査顕微鏡を用いて画像化した。それは、アデノ- CreをウイルスにさらされていたMEFのは、非感染細胞と比較して以前の報告2,5と一致して契約し、形態に長い現われたことが観察された。 Creリコンビナーゼの配信のアデノウイルスの方法は、アデノのCreのウイルスが容易に利用できるように有利である、と細胞のほぼ100％にCreを経由して遺伝子の欠失は、最適化されたアデノウイルス感染を達成することができます。

このビデオでは、floxed Rac1の対立遺伝子を運ぶ主要なマウス胚性線維芽細胞を感染させるためにCreリコンビナーゼ遺伝子を有するアデノウイルスを使用してください。

様々な細胞シグナル伝達カスケードの特定の構成要素を遺伝学的に除去できる能力は、現代のシグナル伝達研究において不可欠なツールとなってきました。

現代の遺伝学的解析は、細胞、臓器、または個体全体から特定の遺伝子を標的として除去することを可能にする技術に大きく依存しています。これらのノックアウト実験は、細胞内コンテキストにおける遺伝子の機能を明らかにするのに役立ちます。ノックアウトによる分子形態学的および生理学的表現型は、いずれも、欠損した配列によってコードされる遺伝子産物の役割に関する手がかりを与えてくれます。マウスなどのモデル生物において、条件付き遺伝子欠損を実現するための一般的な方法は、標的となる遺伝子またはエキソンをloxPサイトで挟むことであり、これがCreリコンビナーゼ酵素の認識配列として機能します。その後、いわゆるフロックス化アレル（floxed allele）の不可逆的な除去がCreによって触媒され、ゲノムから当該配列が排除されます。系にCreリコンビナーゼを導入するには、in vivoで実施する方法や、確立された細胞に直接作用させる方法など、いくつかの異なる手法が存在します。今回のアプリケーションでは、floxアレルを持つトランスジェニックマウスから単離・培養した線維芽細胞にCreを導入するために、アデノウイルスを使用します。この手法により、外来遺伝子の導入効率をほぼ100%まで高めることができます。ウイルスが細胞に投与されると、エンドサイトーシス小胞内に取り込まれて核膜まで輸送され、目的の外来遺伝子を含むウイルスDNAが核膜孔複合体を介して核内に浸入します。その後、細胞内の機構が導入された遺伝子を転写し、そのタンパク質産物が細胞に作用します。この場合、ウイルスにコードされたCreリコンビナーゼ酵素が、宿主細胞のゲノムからフロックス化されたアレルを切り出します。私たちは、カナダのオンタリオ州グエルフにあるグエルフ大学のJones研究室のメンバーです。当研究室では、シグナル伝達の概念と、さまざまなシグナル伝達カスケードから特定の構成要素を除去した際に何が起こるかに関心を持っています。本日は、アクチンの構築に関連するカスケードについて検討します。シグナル伝達は、情報を伝達し、アクチンの再構成などの表現型の変化を誘発する一連の生化学的成分によって達成されます。目的タンパク質はRAC1であり、これは細胞接着、遊走、形態などのアクチンダイナミクスの媒介において重要な小型GTPaseです。本研究では、Cre-LoxPシステムを用いてこの遺伝子を欠損させ、細胞内での役割を確認します。以前、受精後12日目の、片方のRac1アレルがフロックス化された胚マウスから線維芽細胞を単離しました。これらの細胞はその後、長期保存のために液体窒素中に保存されました。まず、1つの胚に相当するこれらの細胞が1バイアル入ったものを融解することから始めます。細胞培養実験を行う際は、無菌環境を維持することが重要です。これには、承認済みのフローフードの露出面を拭き上げることや、フード内に持ち込むすべての試薬ボトルおよび実験器具に70% ethanolをスプレーすることが含まれます。クリーンベンチの準備が整ったら、バイアルを37 °Cの水が入ったビーカーに浸し、内容物が液体になるまで細胞を融解させます。次に、バイアルを70% ethanolで滅菌し、細胞懸濁液を加えます。10 cmプレートに分注します。プレートには、10% fetal bovine serumおよび1% penicillinを添加した9 mLのDMEM high glucose mediumが入っています。ストレプトマイシンを加え、プレートを緩やかに揺らして細胞を分散させ、適切な情報を記載したラベルを貼付して、37°C、5%CO2のインキュベーターに入れます。通常、細胞は24時間以内に100%のコンフルエンシーに達します。この時点で、細胞を新しいプレートに継代することができます。まず、古い培地を吸引して取り除きます。滅菌したPBSを5 mL加えて細胞を洗浄し、その後これも除去します。次に、10 mM EDTAを含むトリプシンを1 mL加えます。プレートを37°Cのインキュベーターに約5分間置き、細胞を基質から剥離させます。フローフードに戻し、トリプシン処理したプレートに培地9 mLを加えて細胞を10倍に希釈します。ピペッティングを数回行い細胞の凝集を解消した後、懸濁液1 mLを取り出し、新しい10 cmプレートに入れた新鮮な培地9 mLに滴下して加えます。再度、プレートを緩やかに揺らして細胞を分散させ、37°Cのインキュベーターに入れます。細胞がコンフルエントに達したら、次のステップとして、顕微鏡で観察できるようにガラスカバースリップ上に細胞を播種します。細胞の調製は、トリプシンの添加および37 °Cのインキュベーターへの配置までを含む、パッキング時に用いたものと同じ手法で行います。細胞がプレートから剥離している間に、オートクレーブ滅菌済みのカバースリップを1枚ずつ配置し、6ウェルディッシュを準備します。細胞がプレートから剥離したら、トリプシン処理した細胞に5〜6 mLの培地を添加します。実験の次の段階に向けて、効率的なウイルス感染のために適切な細胞数を播種できるよう、細胞計数を行います。細胞を計数するには、15 µLのサンプルと同量のトリパンブルーを合わせ、ピペットで上下に混ぜ合わせ、この溶液15 µLをヘモサイトメーターに加えます。死細胞は青色に染まります。この調製状態で、1 µLあたりの細胞数を算出するために、4×4のグリッド内にある生存細胞（無色細胞）のみをカウントしてください。まず、AからDまでの4つの独立したグリッドで細胞をカウントし、その平均値を求めます。次に、トリパンブルーによる希釈を考慮し、この値に2を掛けます。グリッド1つ分は0.1 µLであるため、10倍して1 µLあたりの細胞数として算出します。次に、目的の細胞数を先ほど算出した細胞濃度で除して、必要な液量を決定します。算出した量の細胞懸濁液を、6ウェルプレートの各ウェルに滴下します。これらの細胞を37°Cのインキュベーター内で一晩培養します。翌日、細胞にウイルスを添加します。Vector B labsから入手したden creek virusは、分注して-80°Cで保存していました。このウイルスを回収し、フローフードに戻します。インキュベーターから6ウェルプレートを取り出し、フードに移動させます。培地を吸引除去し、1 mLの無血清DMEMで細胞を洗浄します。次に、ウイルスの添加に向けて、各ウェルに無血清培地を1 mL加えます。ウイルスの適用には、感染多重度（MOI）500を用います。プロトコルの最適化をさまざまなMOIで行った結果、MOI 500では細胞生存率への影響がほとんどないか全くない状態で、非常に効率的な感染率が得られることが分かりました。MOIを算出するには、以下の式を使用します。まず、必要なウイルス数を計算します。これは、目標とするMOI（この場合は500）に1ウェルあたりの細胞数（30,000個）を掛けることで算出できます。使用すべきウイルスストックの容量を決定するには、このウイルス数に1000を掛け、それをウイルスの初期濃度で除します。本例では、感染させる各ウェルに1.5 µLのウイルスストックを添加します。プレートを静かに揺らしてウイルスを分散させ、37 °Cのインキュベーターで一晩培養します。翌朝、細胞からウイルス含有培地を除去してPBSで洗浄し、2 mLの通常培地を細胞に加えます。本実験では、約72時間で細胞に表現型の変化が生じることが確認されました。Actinodinで染色した細胞を、グエルフ大学高度解析センターのLeica T-C-S-S-P fiveマルチフォトコンフォーカルレーザー走査顕微鏡を用いて撮影しました。これにより、感染細胞と非感染細胞の間で形態に変化があることが明らかになりました。RAC1を欠損した細胞は、感染していない幅広く扁平な細胞と比較して、細長く伸びた形態を示しました。ここでは、ADOC creaseシステムがシグナル伝達の研究にとどまらず、細胞へ効率的に遺伝子を導入するための堅牢な手法であることを示しました。また、この手法を用いて実験動物の遺伝子をノックアウトさせたり、個体内の特定の細胞集団をラベル化したりすることも可能です。原理的に、アデノウイルスシステムはCre以外の遺伝子を導入するためにも利用できます。このデリバリー方法を使用する利点には、高い親和性と効率、および宿主細胞DNAへの組み込みがないことが挙げられます。しかし、一般的なアデノウイルスの作製には多大な労力を要する場合があります。したがって、本プロトコルでは、以前に開発されたocreウイルスと我々のflocked RAC one mesを用いたアデノウイルスシステムの能力を活用しています。この条件付きノックアウトを通じて、我々は以下のことを示しました。したがって、形態は確かにRACなどの小型GTPaseに部分的に依存しています。結論として、Jones Labから、私たちのビデオを視聴していただきありがとうございました。皆様の今後の研究が成功することを願っております。

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Research

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