Name: SJLマウスにおける実験的自己免疫性下垂体炎の誘導 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-17T17:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 38 s
Description: 学ぶSJLマウスを用いた実験的自己免疫性下垂体炎の誘導法と組織病理学的評価手法。下垂体免疫原の投与とリンパ球浸潤の定量的解析により、ヒト疾患を模したモデル動物を作成し、自己免疫疾患の病態解明に貢献します。

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実験的なプロトコル下垂体免疫原が（関連記事参照）準備されると、それはSJLマウス（ジャクソンラボラトリーズ、株式000686）に皮下注射される。第二同一の注入は、7日後に繰り返されます。マウスは、 生体と検死結果に収集するために使用されています。 ステップ1。 SJLマウスに下垂体の免疫原を皮下注射マウスは、20 mg / mlの2,2,2 - トリブロムエタノールを0.5ml（AVERTIN、TCIアメリカ、T - 1420）を腹腔内注入による最初の麻酔です。マウスは、コンパニオンJoveの2181の記事で示したように、下垂体エマルジョン100μlを皮下注射する、下垂体抽出物と完全フロイントアジュバントの0.25ミリグラム、1ミリグラムが含まれています。エマルジョンは、左背側後肢領域（（50μL）と右鼠径部（50μL）に注入されます。下垂体エマルジョンは反対側の部位（50μlの右背側後肢の地域の中に7日目に再び注入されており、左鼠径部に50μlの）マウスは最初の3日間、毎日モニターし、初回免疫後に一般的に28日間である犠牲、の日まで、毎週されています。 ステップ2。 in vivoでの結果でのコレクション：血アッセイマウスはまだ生きている間、最も一般的に実験結果を評価するために使用される組織は、血液です。血液は、日常的に14日間下垂体抗体やサイトカインやケモカインなどの他のマーカーの血清レベルを測定するために初回免疫後に描画されます。 血液は、次のように生きたマウスから収集されます。マウスは首の首筋によって安全に保管されており、顎骨のバックが位置しています。顎骨の後部が特定されると、4mmのランセットは、ピアスに顎下維管束を使用している。血した後、血腫を避けるために、アルコール綿を使用して領域上での場所の圧力を集めている。使用されるまで、採取した血液は20分、2,000 gで遠心分離し、-80℃で保存されます。 ステップ3。事後の成果の収集：下垂体組織病理学マウスは、通常、28日初回免疫後に屠殺されています。 EAHの診断を確立するために必要な枢機卿の機能は、造血単核細胞による下垂体の浸潤である。 マウスをCO 2で潅流されているプラスチック封じチャンバ内に配置することにより安楽死されています。マウスは8分の合計のためのチャンバー内に保持されます。安楽死の後、下垂体は、関連記事で説明されているように収集されます。病気の下垂体は腫れと、よりしっかりと周囲の硬膜に付着されます。シャープ鉗子は、下垂体の周囲の髄膜を緩めるために使用されます。一度ちょう形骨上に自由に下垂体の動き、下垂体の一端を鉗子で把持され、下垂体は慎重に持ち上げられる。腺は、ベックステッドの固定液5を含むマイクロ遠心チューブに配置されます。下垂体は、一晩固定レンズの紙に包まれ、そしてカセットに配置されます。腺は、次のプロトコルを使用して処理されます。 <table border="1"><tbody><tr><td>ステーション番号</td><td>試薬</td><td>分単位の時間</td><td>温度（摂氏） </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 70％アルコール</td><td> 5 </td><td> 25 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 70％アルコール</td><td> 15 </td><td> 25 </td></tr><tr><td> 3 </td><td> 95％アルコール</td><td> 15 </td><td> 25 </td></tr><tr><td> 4 </td><td> 95％アルコール</td><td> 15 </td><td> 25 </td></tr><tr><td> 5 </td><td> 100％アルコール</td><td> 15 </td><td> 25 </td></tr><tr><td> 6 </td><td> 100％アルコール</td><td> 7.5 </td><td> 25 </td></tr><tr><td> 7 </td><td> 100％アルコール</td><td> 7.5 </td><td> 25 </td></tr><tr><td> 8 </td><td>キシレン</td><td> 20 </td><td> 25 </td></tr><tr><td> 9 </td><td>キシレン</td><td> 20 </td><td> 25 </td></tr><tr><td> 10 </td><td>キシレン</td><tD&gt; 20 </td><td> 25 </td></tr><tr><td> 11 </td><td>パラフィン</td><td> 30 </td><td> 58 </td></tr><tr><td> 12 </td><td>パラフィン</td><td> 5 </td><td> 58 </td></tr><tr><td> 13 </td><td>パラフィン</td><td> 5 </td><td> 58 </td></tr></tbody></table>処理後は、下垂体腺はパラフィンに埋め込まれているし、少なくとも5連続していないセクションは、（5 -μm厚）各腺からカットされます。切削後は、腺を、ヘマトキシリン​​およびエオシンで染色し、単核細胞浸潤を定量化するために分析されています。最も深刻な浸潤を伴うセクションがスコアリングのために選択されています。重大度は、免疫細胞による下垂体前葉の交換や破壊の程度の主観的な見積もりに基づいて採点さ：グレード0、無疾患、グレード1、2％-20％の関与、グレード2、20％-30％、グレード3、 30％〜50％、グレード4の、50％-90％、5年生、90％以上。すべてのセクションは、セクションのソースを知らされていない二人の個人によって採点されます。

<ol><li>Tzou, S. C., Lupi, I., Landek, M., Gutenberg, A., Tzou, Y. M., Kimura, H., Pinna, G., Rose, N. R., Caturegli, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoimmune+Hypophysitis+of+SJL+mice%3A+Clinical+Insights+from+a+New+Animal+Model%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Autoimmune Hypophysitis of SJL mice: Clinical Insights from a New Animal Model.</a> Endocrinology. , (2008).</li>
<li>Twarog, F. J., Rose, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+production+of+thyroid+autoantibodies+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">The production of thyroid autoantibodies in mice.</a> J Immunol. 101, 242-2450 (1968).</li>
<li>Patrick, J., Lindstrom, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoimmune+response+to+acetylcholine+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Autoimmune response to acetylcholine receptor.</a> Science. 180, 871-872 (1973).</li>
<li>Caturegli, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoimmune+hypophysitis%3A+an+underestimated+disease+in+search+of+its+autoantigen%28s%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Endocrinol+Metab%22%5BJournal%5D)">Autoimmune hypophysitis: an underestimated disease in search of its autoantigen(s).</a> J Clin Endocrinol Metab. 92, 2038-2040 (2007).</li>
<li>Beckstead, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+technique+for+preservation+of+fixation-sensitive+antigens+in+paraffin-embedded+tissues%3A+addendum%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">A simple technique for preservation of fixation-sensitive antigens in paraffin-embedded tissues: addendum.</a> J Histochem Cytochem. 43, 345-345 (1995).</li>
<li>Levine, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Allergic+adenophypophysitis%3A+new+experimental+disease+of+the+pituitary+gland%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Allergic adenophypophysitis: new experimental disease of the pituitary gland.</a> Science. 158, 1190-1191 (1967).</li>
<li>Yoon, J. W., Choi, D. S., Liang, H. C., Baek, H. S., Ko, I. Y., Jun, H. S., Gillam, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+an+organ-specific+autoimmune+disease%2C+lymphocytic+hypophysitis%2C+in+hamsters+by+recombinant+rubella+virus+glycoprotein+and+prevention+of+disease+by+neonatal+thymectomy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Induction of an organ-specific autoimmune disease, lymphocytic hypophysitis, in hamsters by recombinant rubella virus glycoprotein and prevention of disease by neonatal thymectomy.</a> Journal of Virology. 66, 1210-1214 (1992).</li>
<li>Davis, J. R., McMahon, R. F., Lowenstein, P. R., Castro, M. G., Lincoln, G. A., McNeilly, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenovirus-mediated+gene+transfer+in+the+ovine+pituitary+gland+is+associated+with+hypophysitis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Adenovirus-mediated gene transfer in the ovine pituitary gland is associated with hypophysitis.</a> J Endocrinol. 173, 265-271 (2002).</li>
<li>Rotondo, F., Quintanar-Stephano, A., Asa, S. L., Lombardero, M., Berczi, I., Scheithauer, B. W., Horvath, E., Kovacs, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenohypophysitis+in+rat+pituitary+allografts%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Exp+Pathol%22%5BJournal%5D)">Adenohypophysitis in rat pituitary allografts.</a> Int J Exp Pathol. , (2010).</li>
</ol>

利害の衝突は宣言されません。

4つの技法は、動物実験で下垂体炎を誘導することが報告されている。フロイントアジュバントと混合して下垂体蛋白質の注入であるこの記事で説明する手法は、1967年6にさかのぼる最古の一つである、そして最近では1に改善されました。他の技術は、1992年7の水溶性風疹ウイルスの糖タンパク質の注入、2002 8で下垂体に直接アデノウイルスの定位の注入、および2010年9別のラット系統の腎被膜未満のラット系統から下垂体腺の移植です。 。フロイントアジュバントアプローチの主な利点は、それが密接に人間相手に似た病気を誘発において、低侵襲、より一貫性と、上記のすべて、より正確であるということです。このビデオの記事で説明されているテクニックは、この魅惑的な病気の我々の理解を向上させるために研究者によって使用できる下垂体炎の再現可能なモデルを生み出し、。

<table><tbody><tr><td>SJLマウス (The Jackson Laboratories)</td><td></td><td>ストック 000686</td><td></td></tr><tr><td>2,2,2-トリブロモ&amp;#8211;エタノール (アベルチン)</td><td>TCI America</td><td>T-1420</td><td></td></tr><tr><td>Beckstead&amp;rsquo;s固定液</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

sjlマウスにおける実験的自己免疫性下垂体炎の誘導

Induction of Experimental Autoimmune Hypophysitis in SJL Mice

自己免疫性下垂体炎は、感受性のマウス1内にアジュバントに混合した下垂体蛋白質の注入によって実験的に再現することができます。マウスモデルは、しばしば人間に発生する同じプロセスの正常な複製を提供し、私たちは病気の展開方法を学ぶことができます。一部の自己免疫疾患の場合は、タイプ1Aの糖尿病のように、自発的に人間のものと同様の疾患を発症モデル（NODマウス）があります。他の多くの自己免疫疾患の場合は、しかし、モデルは実験的に誘導する必要があります。この点で一般的なアプローチが検討されて臓器由来する支配的な抗原をマウスに注入することです。例えば、自己免疫性甲状腺炎に興味のある研究者は、サイログロブリン2でマウスを注入し、重症筋無力症に興味のある人は、アセチルコリン受容体3とそれらを注入する。特定の自己免疫疾患の自己抗原が知られていない場合は、捜査官は、自己免疫反応の標的臓器から粗タンパク質抽出液を注入する。自己免疫性下垂体炎の場合は、病原性の自己抗原（s）は4をまだ明らかにされないままであるため、原油下垂体タンパク質調製物が使用されます。このビデオの記事では、SJLマウスにおける実験的自己免疫性下垂体炎を誘導する方法を示します。

このビデオでは、SJLマウスとどのように病理組織学的にその重症度を評価するために自己免​​疫性下垂体炎を誘導する方法を示しています。

SJLマウスにおける実験的自己免疫性下垂体炎の誘導

自己免疫性下垂体炎は、感受性マウスにアジュバントと混合した下垂体タンパク質を注射することで実験的に再現することができます1。マウス...

自己免疫性下垂体炎は、下垂体の腫大と1つまたは複数の下垂体ホルモンの欠乏を特徴とする。原因となる自己抗原は依然として不明である。付随するビデオでは、マウス下垂体免疫原の調製プロトコルを実演しており、これを用いてヒトの自己免疫性リンパ球性下垂体炎に類似したマウスモデルを作成する。感受性マウス系統に下垂体免疫原を注射します。その後、7日後に再度注射を行い、14日後にバイオマーカー研究のための採血を行います。28日目に、犠牲にしたマウスから下垂腺を採取して切片を作成し、染色を行うことで白血球浸潤の程度を判定します。自己免疫性下垂体炎は、鞍（sella）に生じる他の非ホルモン分泌性腫瘤との区別が困難な場合がある、近年認識が高まっている疾患です。この疾患は約50年前に初めて報告されましたが、自己免疫性下垂体炎において患者の免疫系が認識する自己抗原はこれまで不明なままでした。2008年に我々は、模倣することを目的として設計したヒトの疾患を忠実に再現するマウスモデルの開発について発表しました。このマウスモデルは、関与する下垂体自己抗原の探索や、下垂体炎の病態および自然経過についての詳細な解明に利用できます。本モデルは、SJL系統のような感受性系統にマウス下垂体タンパク質を注入することに基づいています。これらのタンパク質は、下垂体自己反応性リンパ球の出現を最終的に誘導する局所的な炎症環境を作り出すために、強力なアジュバントと混合する必要があります。まず注入部位をドレナージするリンパ節に、次いで下垂体に現れます。このモデルでは、マウス1匹あたり合計2 mgという比較的大量の下垂体タンパク質の注入が必要です。このことは、標的となる自己抗原または複数の自己抗原が下垂体内に極微量しか存在しないことを示唆しています。適切に調製したエマルションの注入は、疾患の誘導において極めて重要です。なぜなら、これにより注入部位で下垂体タンパク質が緩徐に持続的に放出され、最終的に下垂体特異的なリンパ球の生成と活性化が促進されるためです。付随するビデオでは、下垂体免疫原の調製方法を紹介しています。安楽死させたマウスから単離した下垂体をホモジナイズし、低速遠心分離によって清浄化します。得られたタンパク質混合物の量は比色法であるBCA法で評価し、品質はポリアクリルアミドゲル電気泳動によって評価します。次に、水溶性タンパク質ホモジネートを、不活化結核菌（mycobacterium tuberculosis bacilli）を含むオイルアジュバントと混合し、下垂体エマルションを作製します。付属のビデオで示された方法でエマルションを調製した後、1 mLシリンジからマイクロエマルジョン用針を取り外し、25Gの針を装着します。マウス1匹あたりの注射に必要な下垂体エマルションの量は100 µLです。Evertonでマウスを麻酔した後、足指をつねっても反応がないことを確認し、乳剤50 µLを左後肢の背側皮下に注入します。針先が完全に皮膚下にあること、および注入部位から乳剤が漏れ出していないことを確認してください。次に、右鼠径部に50 µLを注入します。再び、液剤が漏れ出していないことを確認してください。注入後、SGL Lマウスの白い被毛を背景とするため、白色をしたエマルションは判別しにくい場合があることに注意してください。マウスをケージに戻し、回復状態を観察します。注入後最初の3日間は、マウスに過度の苦痛が生じていないか毎日観察してください。このアジュバントには不活化した結核菌（m tuberculosis Bacilli）が含まれているため、炎症性です。7日目に、反対側の解剖学的部位に再度注入を行ってください。右後肢の背側領域に50 µL、左鼠径領域に50 µLを注射します。免疫反応が起こった後に実験結果を評価するため、これまでと同様にマウスを観察します。マウスが生存している間に実験結果を評価するために最も一般的に用いられる組織は血液です。初回免疫から14日後に定期的に採血を行い、下垂体抗体の血清レベルや、サイトカイン、ケモカインなどのその他のマーカーを測定します。生きたマウスから採血するには、項をしっかりと保持して顎骨の後方を確認します。この位置が明確になったら、4 mmのランセットで下顎血管束を穿刺します。穿刺部位から血液が出始めます。血液を6滴、マイクロ遠心チューブに回収してください。止血するため、濡れたペーパータオルで穿刺部位を拭いて清浄します。血液試料チューブを遠心分離機にセットし、2000 Gで20分間遠心分離します。この遠心分離により、血球成分がペレットとして沈殿し、血清が上清として分離されます。血清を新しいマイクロ遠心チューブに移します。血清は使用するまで-80°Cで保存します。免疫したマウスに本格的な自己免疫性下垂体炎が発症するまでには、約1か月かかります。そのため、通常は初回免疫から28日後にマウスを犠牲にします。頭蓋骨を切開した後、脳を持ち上げて後方に反転させ、下垂体を露出させます。病変のある下垂体は腫大しており、周囲の髄膜への癒着がより強くなります。鋭いピンセットの先端を下垂体の周囲に動かし、髄膜を剥離させます。下垂体がこの蝶形骨上で自由に動くようになったら、ピンセットで腺の一端をつかみ、蝶形骨から慎重に持ち上げます。組織を1 mLのBetted solution（亜鉛ベースの固定液）が入ったマイクロ遠心チューブに入れ、室温で一晩固定します。翌日、下垂体をレンズペーパーに移します。下垂体をレンズペーパーで包み、組織カセットに入れます。エタノールの濃度を段階的に上げてインキュベートし、その後キシレンで処理して、検体を処理します。レンズペーパーを取り除き、下垂体を金属モールドに入れます。その後、下垂体をパラフィンで覆います。組織カセットをモールドの上に置き、さらにパラフィンを満たします。最後に、アセンブリを氷上に置いてパラフィンを凝固させます。パラフィンが凝固したら、ミクロトームを用いて厚さ5 µmの切片を作成します。切片をガラススライドに採取します。各マウスの下垂体から、同一のスライド上に連続しない切片を少なくとも5枚採取してください。自動組織染色装置を用いて、スライドをヘマチン・エオジンで染色します。光学顕微鏡でスライドを観察し、結果を収集します。下垂体炎を発症した下垂体の主要な特徴はリンパ球の浸潤であり、これは下垂体実質を単独で、あるいは集団を形成して浸透する小さな青色の細胞として観察されます。リンパ球は、下垂体の正常な内分泌細胞のさまざまな程度の破壊に関連しています。リンパ球浸潤と下垂体破壊が最も深刻な切片を選出し、実験条件を知らされていない2名の研究者がスコアリングを行います。スコアリングは、損傷の程度に関する主観的な評価に基づいて行われます。スコア0は、下垂体が正常であるか、またはリンパ球およびその他の造血系単核細胞がほとんど見られないことを示します。スコア1は、単核細胞浸潤が前葉下垂体全面積の2%から20%を占めていることを示します。スコア2は、単核細胞浸潤が前葉下垂体全面積の20%から30%を占めていることを示します。スコア3は、単核細胞浸潤が前下垂体全領域の30%から50%を占めていることを示します。スコア4は、単核細胞浸潤が前下垂体全領域の50%から90%を占めていることを示し、スコア5は、単核細胞浸潤が前下垂体領域のほぼ全域を占めていることを示します。習熟すれば、マウス1匹への免疫原の注射は15分で完了できます。マウス1匹からの末梢血採取は5分で完了し、免疫処置の合間に組織病理学用のスライド作成を6時間で行うことができます。麻酔および免疫原の注射後、マウスの健康状態に細心の注意を払うことが重要です。また、下垂体前葉の組織病理学的評価も併せて行います。この手順は、ドレナージリンパ節における浸潤サブポピュレーションのフローサイトメトリーによる評価など、さまざまな手法を用いて幅広い実験結果を収集するために使用できます。組織抽出物を用いて自己免疫疾患を誘導する免疫手法は、自己免疫分野の研究者が疾患の病態生理における鍵となるイベントを発見するための道を開くものです。このビデオを視聴することで、実験的自己免疫性下垂体炎を誘導するためのマウスへの免疫方法と、その発生率および重症度の評価方法について十分に理解できるはずです。マイクロトーム刃の取り扱いには危険が伴うことに注意してください。そのため、手袋の着用や十分な照明条件下での作業など、常に適切な予防措置を講じる必要があります。

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機能と神経病理学的評価の c57bl/6 マウスの実験的自己免疫性視神経炎を誘導するための単純なアプローチ

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