原虫シロアリ腸に対するリガンド - 溶解性ペプチドのProtozoacidal活性を試験する in vitroで（原生動物文化）と in vivoで（シロアリ後腸へのマイクロインジェクション）

本手順の全体的な目的は、合成したリガンドがフォームモーゼンシロアリの腸内に存在するセルロース消化原生動物に特異的に結合すること、およびリticペプチドと結合させたリガンドが、嫌気性原生動物培養によるin vitro試験およびシロアリ後腸への注入によるin vivo試験において、これらの原生動物を死滅させることを実証することです。これは、まず嫌気条件下で働きアリの腸内原生動物を抽出することによって達成されます。手順の第2段階では、蛍光標識リガンドがシロアリの腸内原生動物にin vitroで結合することを確認します。

本手順の第3ステップでは、リガンド結合リティックペプチドがin vitroでシロアリ腸内原生動物を死滅させることを示します。最終ステップでは、蛍光結合リガンドおよびリガンド結合リティックペプチドをシロアリの後腸に注入し、in vivoでの結合と腸内原生動物の破壊を確認します。原生動物培養液のシロアリ後腸への注入と蛍光顕微鏡観察を用いることで、リティックペプチドに結合したリガンドがin vitroおよびin vivoにおいてシロアリ腸内原生動物に結合し、効率的に死滅させることを示します。

リガンドを溶菌ペプチドに結合させたことで、溶菌ペプチド単独の場合と比較して原生動物に対する毒性が向上しました。リガンドが細菌の細胞膜に結合しなかったためと思われる、E. coli などの非標的生物への毒性は低下しましたが、原生動物が消失したことで、シロアリは2週間以内に死滅しました。地下シロアリの腸内に共生する原生動物を殺すために LIG 溶菌ペプチドを使用する本手法は、シロアリ防除のための代替技術を開発する取り組みの一環です。

腸内に共生生物がいないと、化学物質への依存度が低くなるため、シロアリは死滅します。リガンドが原生動物に結合すること、およびリガンド溶解性ペプチドが原生動物を死滅させることを証明するため、シロアリの腸から原生動物を抽出します。原生動物内部の木材粒子は自家蛍光を示すため、蛍光リガンドで処理した原生動物の結果を、未処理の原生動物と比較することが重要です。

偽陽性を避けるため、ペプチドを後腸に直接注入します。なぜなら、シロアリにペプチドを摂食させた場合、前腸で消化され、また中腸にはプロテアーゼが存在するためです。New England Bio Labs社のファージディスプレイライブラリを用いて、原生動物に結合する19種類のペプチド配列を特定しました。その中から、Trypanosoma bruceiの細胞膜に由来することが知られている推定糖タンパク質と類似したペプチド配列を持つリガンドを1つ選択しました。

ペプチド合成後、ペプチド接合体の溶解性を評価するため、E-D-A-N-S novatech resinを用いた固相ペプチド合成により、合成したペプチドをC末端蛍光プローブに結合させました。この手順では、実験の前日にLSUタンパク質施設で合成した合成リガンドと溶解性ペプチドの接合体を使用します。使用するすべての材料にsigma coatを適用し、原生動物やペプチドが表面に吸着するのを防ぎます。

均一な層を塗り広げ、翌日に使用するまで一晩乾燥させます。グローブボックス内にファンボックスを設置し、室温で乾燥剤およびタイプD触媒スタックパックを通じて空気を絶えず循環させ、1時間以上にわたって湿度と酸素レベルを低下させます。グローブボックスに窒素を20〜30分間連続的に流し込み、必要に応じてさらに窒素を使用して嫌気条件を維持します。

次に、Traeger U培地を調製し、pHを7に調整します。グローブボックス内の酸素残渣を除去するため、2.5%水素、5%二酸化炭素、92.5%窒素の混合ガスを接続したチューブを介して、200 µLチップを用いて滅菌済み培地をろ過し、1時間静置します。準備が整ったら、ピンセットを用いてペトリ皿からシロアリの働き蟻を1匹取り出し、70%エタノールを満たしたビーカーに全身を浸し、ピンセットで働き蟻を保持したまま約10秒間静かに振盪させます。表面の汚染物質を除去するため、働き蟻をエタノールから取り出し、清潔なキムワイプの上で約20秒間乾燥させます。

グローブボックス内で、シロナイズ処理を施した顕微鏡スライドにシロアリ腸管回収用のTrager U media 100 µLを、またチューブに原生動物回収用のTrager U media 900 µLを準備します。次に、解剖顕微鏡と滅菌済みの微細先端ピンセットを使用し、ワーカーのアブドメンを固定し、別のピンセットでアブドメンの先端を掴んで、腸管を45度の角度でゆっくりと上方または下方に引き出します。中腸と後腸が一体となった状態で4本の腸管を回収するようにします。回収したシロアリの腸管を、顕微鏡スライド上のTrager U media 100 µLの液滴の中に置きます。

次にスライドを移動させ、滅菌した細い解剖用プローブで後腸を突き刺して原生動物を放出し、200 µL ピペットを用いて腸の内容物を、900 µL の Traeger 溶液を含む 1 mL マイクロ遠心チューブに慎重に移します。腸壁の断片を沈降させるために 5 秒間待ち、上清 900 µL を新しいチューブに移します。原生動物の培養液数 µL を、シグマコートを施した顕微鏡スライドに移します。

スライドを作成し、顕微鏡の200倍 magnification で原生動物の状態を確認します。原生動物を入手後直ちに、好気性原生動物、tetra piriformis、amoeba、ug、gleaner、およびparameciumのコントロール培養液と、サプライヤーの推奨する培地で overnight 培養した e coli を準備します。固定化したシロアリ腸内原生動物およびその他の原生動物コントロールと e coli を、10% formaldehyde を用いて 4 °C で 12 時間固定します。その後、原生動物溶液を 30 ×g で 10 分間遠心分離します。

上澄みを捨て、固定された原生動物を含むペレットを1 mLのTrager U mediaで2回洗浄し、ペレットを1 mLのTraeger Ediaに懸濁させます。合成リガンドを蛍光色素E-D-A-N-Sに結合させた溶液100 µLを用いて、固定した微生物を1〜2時間インキュベートします。この際、水に溶解したリガンドの最終濃度を50 µMとします。リガンド処理した微生物および未処理のコントロールを、蛍光顕微鏡を用いて400倍の倍率で観察します。なお、最大吸収波長は341 nm、青色領域の放出波長は471 nmに設定します。

リガンド結合溶解ペプチドの特性を評価するため、セクション3に従って調製した原生動物培養液198 µLを、0.5 mLエッペンドルフチューブ6本に分注します。シロアリ腸内原生動物培養液の分注量の半分に、100 µMのリガンド溶解ペプチド溶液2 µLを添加します。最終濃度を1 µMとするため、残りの半分の分注量には、コントロールとして滅菌水2 µLを添加します。

1時間後、各原生動物培養液から10 µLをスライドグラスに分注します。リガンド結合リチックペプチド処理した原生動物の生存率を、対照群と比較し、顕微鏡を用いて200倍の倍率で観察します。NGI PC 10マイクロピペットプラー（2段階加熱レベル）を用いてニードルをプルします。チップ径を20～30 µmにするため、顕微鏡下で測定してチップ径を確認してください。

マイクロメーターを用いて、水に懸濁させた50 µMの蛍光標識リガンドを、1本のニードルに約30 µL充填します。対照群として、別のニードルにアタッチシリンジを用いて水を充填します。マイクロピペットをホルダーとマイクロマニピュレーターに取り付けます。2台目のマイクロマニピュレーターにある注入システムのホルダーに、ニードルを取り付けます。

初期注入パラメータを、パルス長約1秒、注入圧10～12 PSIに設定します。次に、ニードルをマイクロピペット内にゆっくりと進め、フットペダルを使用して溶液を注入します。注入後、マイクロピペットを取り外し、注入された溶液の長さを記録します。

ベニヤ calipersを用いて、マイクロピペットの既知のパラメータから注入量を算出し、0.3 µLの溶液を排出するように圧力とパルス長を調整します。次に、各処理につき20匹のシロアリを注入用に準備します。まず、柔らかいピンセットで腹部の末端を絞り、直腸にある排泄物を除去します。

次に、シロアリの働きアリを氷上で5分間冷却して麻酔させ、静止させます。100 µL ピペットチップを切断して、働きアリを保持するためのレシーバーを作成します。メスを用いてチップの先端を10～12 mmの長さに切り、シロアリの大きさに合わせて使用し、バイアルに入れます。

ネジ止めして、レシーバーをマイクロマニピュレーターに取り付けます。働きアリをペトリ皿の上に腹側を上にして置き、窒素吸引ポンプを用いて、頭部からレシーバーに吸引します。この際、働きアリの末端がレシーバーから突き出るようにします。働きアリをレシーバーに保持したまま、マイクロマニピュレーターを使用して満たされた針を慎重に進め、働きアリの肛門に挿入します。蛍光標識したリガンドまたは水対照を0.3 µL注入します。

リガンドまたは水を注入したワーカーを、湿らせたフィルターペーパーを入れた個別のペトリ皿に移し、26 °C、相対湿度78%で一晩保持します。24時間後、注入したシロアリから腸管を摘出し、既報の方法に従って原生動物を回収します。注入したシロアリ由来の原生動物におけるリガンド結合を蛍光顕微鏡で観察し、生きたシロアリ内におけるリガンド結合溶菌ペプチドの溶菌特性を評価します。

注入用の材料、器具、およびシロアリを前回の注入時と同様に準備し、20匹のシロアリ働きアリの後腸に、500 micromolarのリガンド溶解ペプチド溶液またはコントロールとしての水を0.3 microliters注入する。24時間後、数匹の働きアリから後腸を摘出し、顕微鏡を用いて200倍の倍率で腸内容物を観察し、処理したシロアリの腸内のすべての原生動物の死滅を確認する。残りの処理済みシロアリとコントロールは、湿ったフィルターペーパーを入れたペトリ皿で飼育し、毎日死亡率を観察する。蛍光プローブと結合したリガンドが、p grassi、h heart mani、およびslaの3種の原生動物すべてに結合することを認めた。

4匹のシロアリ（Mosson subterranean termites）の後腸から得られた原虫において、検出可能な密度でリガンド結合が全細胞表面で起こっており、特に微小管のシートと核（MP grass eye）が存在する軸上の原虫前方領域に集中していることが分かりました。また、テストしたすべての自由生活好気性原虫種においても蛍光が検出されたことから、このリガンドは原虫に共通する構造に結合することが示唆されました。E. coliではリガンド結合は見られませんでしたが、1 µMのリガンド溶解性ペプチドを作用させたところ、シロアリ（Omo and subterranean termite）の働きアリの後腸由来の3種の原虫、およびin vitroでの自由生活原虫（T. piriformis）のすべてが10分以内に死滅し、一方でコントロール群は生存していました。

この画像は、リガンド結合型溶菌ペプチドで処理したシロアリ腸内原生動物の膜完全性が漸次的に喪失していく様子を示しています。リガンド結合型溶菌ペプチド処理群と水処理群の間でE. coliコロニー数に差は見られませんでしたが、リガンドのない溶菌ペプチドはE. coliコロニー数を大幅に減少させました。このことは、溶菌ペプチドにリガンドを結合させることで、非標的微生物をある程度溶菌から保護できることを示唆しています。500 µMのリガンド結合型溶菌ペプチドを0.3 µL注入したところ、24時間以内にヤマトシロアリおよびイエシロアリの腸内に生息する3種の原生動物すべてが死滅し、リガンド結合型溶菌ペプチドを注入したシロアリは10日後に死亡しました。

Husen and Colia (2009)に示されているように、リガンド非結合の溶解性ペプチドを注入した場合と比較して、原生動物およびシロアリは3倍速く死亡しました。これは、最適な培養条件下において、リガンドが溶解性ペプチドの原生動物に対する殺細胞効率を高めることを示唆しています。Omo. Subterranean termiteの腸から抽出した3種すべての原生動物は、少なくとも3日間は生存し、健全な状態で維持される必要があります。

しかし、培地に酸素が残留している場合、原生動物の運動は直ちに停止します。不適切な培地を使用して細胞内の浸透圧が高くなりすぎると、原生動物の細胞膜が膨張し、破裂します。逆に、細胞内の浸透圧が低くなりすぎたり、細胞膜が損傷したりすると、原生動物は萎縮し、収縮します。原生動物を固定することで、蛍光カップルリガンドの原生動物への結合を検出しやすくなります。

原生動物が自由に動き回っている状態では、蛍光を検出し、それを木粒の自家蛍光と区別することは困難です。この手法を習得すれば、助手の協力を得て1時間あたり約30匹のシロアリに注入することが可能です。リガンド・コリティック・ペプチドは、地下シロアリの腸内の原生動物共生体を殺し、それによってシロアリを駆除するために開発されましたが、ヒトに多くの疾患を引き起こす slash mania、ponoma、te、odium などの原生動物寄生虫に対する薬剤の開発にも有用である可能性があります。

このビデオを視聴することで、シロアリの腸管から抽出した原生動物の培養および維持方法、蛍光顕微鏡を用いたリガンドの原生動物への特異的結合の確認方法、およびコリティックペプチドリガンドによる原生動物の自殺作用のin vitroでの実証方法について深く理解することができます。そして最後に、in vivoでの確認のためにペプチドをシロアリの腸管へ注入する方法について学びます。