コー​​ルド - プレコンディショニングによる神経保護の研究のための戦略

我々は、傷害の発症前に脳を保護するための治療薬の開発のための新たなターゲットを特定する手段として、コールドプレコンディショニングを担当し神経免疫シグナルを定義しようとしています。我々は生物学的システム、実験操作に加え、再現性の高いと小文字が区別される技術的能力を必要とするような作業のための戦略を提示する。

神経学的損傷は、全身麻酔による罹患率と死亡率の頻繁な原因です。このビデオで紹介する研究の目標は、損傷を発症する前に脳を保護するための治療薬の新規標的を特定する手段として、ラットの神経免疫シグナル伝達に対する寒冷プレコンディショニングの影響を調べることです。これは、健康で長寿命の成体ラット海馬スライス培養物を作製することによって達成されます。

培養物は、免疫ベースの神経防御を誘発するために、低温プレコンディショニングにさらされます。次に、古代の毒素を添加し、スライス培養物を画像化します。画像解析では、コールドプレコンディショニングが選択的ニューロン損失のレベルを劇的に低下させることが示唆されています。

私の名前はリチャード・クレイグ、こちらはハイディ・ミッチェルです。シカゴ大学神経学部の出身ですが、今日は、脳を脳疾患に対して強くする手段として、低レベルの炎症性免疫シグナル伝達を含む神経保護に関する質問に答えるために、スライス培養製剤をどのように使用できるかを説明します。一般的に言えば、この手順に不慣れな個人は、長期的な生存率と低レベルの炎症誘発性シグナル伝達を示すことができる健康な培養物を確保する必要があるため、苦労しています。

ハイジは、これらのハードルを克服するために研究室で使用しているいくつかの手順を示し、低レベルの炎症誘発性シグナル伝達を脳の神経保護剤を作る手段として測定できるようにします。次の実験は、清潔な白衣を着用し、実験室に滅菌手袋を敷いて行う必要があります。上着。スリーブ まず、MCIL WANE組織チョッパー関連のテフロンインサート、カミソリの刃、手術器具、解剖用ペトリ皿など、BSL One Lamina Flow Hoodに施術に必要なすべてのアイテムを入れます。

フードは、実験開始の少なくとも 30 分前に、自己完結型の紫外線空気浄化ファンによって空気が浄化された HIPAA フィルター付き陽圧培養室に配置する必要があります。フードに解剖用コールドプレートを置き、細胞培養フード内の近くのウォーターバスに接続します。ミリセルインサートを6ウェルプレートの各ウェルに置き、それぞれに1.1ミリリットルの培地を加えます。

トレイを摂氏36度、二酸化炭素5%、湿度95%のインキュベーターに少なくとも20分間よく置きます。ラットの子犬をヒートランプの下に置いて、必要なまで子犬を暖かく保ち、子犬を100%二酸化炭素に入れて麻酔します。麻酔をかけたら、子犬を100%エタノールに浸し、首を切って、体を100ミリメートルのシャーレに、頭を別のシャーレに入れます。

次に、湾曲した虹彩はさみを使用して頭蓋骨を開き、正中線を切開した後、目の後ろの左右に2つの横方向の切り込みを入れます。角度のついた鉗子を使用して、上にある頭蓋骨を剥がし、へらで脳をすくい取り始めます。へらで三叉神経を切断して脳を取り出し、ブドウ糖を補給した10ミリリットルの滅菌コールドゲイズバランス塩溶液を含む60ミリメートルのシャーレの下半分に脳を置きます。

次に、2番の虹彩ヘラの下にある5番のIOx鉗子を使用して、各半球からカバカンピを解剖し、マキルウェインチョッパーのテフロンディスクに配置します。ヘラを使用して、セクションの厚さが350〜400マイクロメートルに設定されたチョッパーを使用して、メディアを脳組織から離して広げます。カバカンピを長軸に垂直に1ミリリットルのパーペットで活発に切断します。

テフロンインサートから切りたてのスライスを洗い流し、コールドゲイズBSSを含む60ミリメートルのペトリ皿の上半分に洗い流します。スライスを実体顕微鏡の下に置き、それらを調べます。無傷の歯状回とパラメタル細胞層を持つスライスを特定します。

次に、最も大きい3つのスライスをインサートにそっと置き、ポップごとに合計12スライスを準備します。インサートを6ワールドトレイに置き、3〜4日ごとに摂氏36度でインキュベートします。古い培地を新鮮で温かみのある培地に交換して、成長培地をリフレッシュします。

7日後に細胞を36度のインキュベーターに戻します。培地を1.1ミリリットルの無血清サプリメントニューロ基礎培地と交換してください。18日目に、スライス培養物の活力を調べます。

1.1ミリリットルのオックスポールを6つのウェルカルチャーディッシュに入れることから始めます。皿をインキュベーターに入れて摂氏36度まで温めます。その間、顕微鏡用のフィットフィルターを備えた蛍光光源をオンにし、少なくとも20分間ウォームアップします。

これにより、均一な光強度が保証されます。次に、鉗子を使用してスライスカルチャーインサートイノックス培地を10分間配置します。次に、それらをSIMフリーメディアに戻します。

培養インサートを顕微鏡ステージに置き、不可逆的になるように向きをマークします。CA 1つのパラメタル層の損傷。倒立顕微鏡の無菌面に培養物を5倍の倍率で置き、スライスをプレスクリーニングに使用したのと同様の向きに保ちます。

FIT CX 引用エミッションキューブに切り替えます。コールドプレコンディショニングのための約1つの領域に30未満のcytx陽性細胞を有する培養物を選択します。1.1ミリリットルの無血清培地を6ウェル培養皿に入れ、5%の二酸化炭素と95%の湿度の30度のインキュベーターに少なくとも20分間置いて、20分が経過した後に培地を平衡化します。

インキュベーターから平衡化培地を取り出します。スライスを含む培養インサートを、通常の無血清培地から30度培地に移します。次に、インキュベーション後90分間、30度のインキュベーターに入れます。

スライス培養物を通常の無血清培地に戻し、36度で24時間インキュベートします。スライス培養実験用のプレスクリーニングを開始するには、培養インサートを細胞培地に20分間移します。スライサーがインキュベートしている間に、紫外線ランプとCCDカメラの電源を入れ、20分間ウォームアップします。

必要に応じて、ソフトウェアを使用してCCDを50サイクル光にさらし、CCDをクリアします。次に、10のペペタ溶液、90マイクロリットルのPBS中のフルオレセインのマイクロリットルを100マイクロメートルの深さのヘモサイトメーターに置き、顕微鏡ステージに置きます。ソフトウェアを使用して、ダイナミックレンジが1000のうち4、096になるように露光時間を調整します。

次に、冷たく予したスライス培養物を入れた皿を顕微鏡に置き、画像を取得します。これらは、バックグラウンドの蛍光レベルを決定するために使用され、損傷したスライスから放出される蛍光から差し引かれます。寒さのプレコンディショニング自体が損傷を引き起こした場合は、蛍光が増加した細胞が次に見られます。

ExoToxic損傷の影響を調べるには、インサートを20〜50マイクロモルと摂氏36度に相当するMDAを含む無血清培地に少なくとも20分間移します。.摂氏36度で60分間インキュベートすると、NMDAはインキュベーション後の神経伝達物質グルタミン酸の影響を模倣します。NMDAをインサートから洗い流し、各インサートを3つの別々の60mm皿に3回浸します。

それぞれに10ミリリットルの神経基礎培地が含まれており、摂氏36度に温められています。360mmウォッシュディッシュの各セットに3つ以上のインサートを使用しないでください。洗浄後、インサートを新鮮なメディアが入ったトレイに入れ、36度のインキュベーターに戻します。

24時間後、以前と同様にフルオレセイン標準でカメラをキャリブレーションします。次に、培養物をOXメディアに20分間置く画像。損傷後1日で損傷レベルが低い場合は、必要に応じて実験を2〜3日に延長し、メタモルフソフトウェアを使用して損傷を定量化します。

CA 1 領域の周囲に関心領域を定義して、選択した損傷領域の強度を測定します。怪我から関心のある領域をコピーして背景画像に貼り付けます。次に、統計ソフトウェアを使用して、怪我と背景の値をExcelに入力します。

分子から背景を除いたものを定量化し、対照および低温前処理培養では、実験群と対照群の損傷を比較するための適切な統計的検定を実行します。この画像は、in vitro培養の21日後の典型的な成熟海馬スライス培養染色を示しています。緑色で示された新しい末端標識は、主要なニューロンの細胞構造を示すために使用されます。

パラメタルニューロンは海馬の約1と約3の領域に示され、歯状回またはDGニューロンはここで左側に見られます。より高い電力で示されたCAの1つの領域は、静止ミクログリアの分岐した品質を示しています。成熟スライス培養物内で、細胞をミクログリア表面マーカーCD 11 Bで標識しました.この図は、死細胞のcytxグリーンマーカーとインキュベートされた低温プレコンディショニング、神経保護、および海馬スライス培養の効果を示しています。

左のプレスクリーン画像では、ここには負傷者が1人も出ていないことが示されています。偽のコントロール培養物が上部に、冷たい前処理された培養物が下部に示されています。中央の行の画像は、20マイクロモルNMDAへの曝露から24時間後の相対的なスライス培養損傷を示しています。

偽のコントロール損傷は、cpとラベル付けされた低温プレコンディショニングにさらされた培養物の損傷よりも大きいことに注意してください。相対的な傷害カラーキャリブレーションスケールを左上の画像に示します。伝統的に、培養物は、CA 1ニューロンの損傷レベルと、損傷と最大の損傷の比率として注目される冷たさのプレコンディショニングと偽の相対的な損傷を最大化するために、20マイクロモルとMDAを一晩で最大の損傷レベルにさらします。

しかし、最大の傷害刺激への曝露は、プレコンディショニングからの神経保護を克服するのに十分ではないかもしれません。したがって、損傷と最大損傷の比率の使用は、プレコンディショニングからの神経保護を正確に反映していない可能性があります。これは、コールドプレコンディショニングの最大レベルが偽のコントロールのレベルよりも低いことを示す右側の画像で明らかです。

この研究では、傷害と最大傷害率の使用が、寒さのプレコンディショニングからの神経保護を曖昧にする可能性があることがわかりました。これは、模式図から、偽の傷害が赤で示されており、NMDA曝露の1日後に青で冷えたプレコンディショニングを行った後、傷害のレベルが3であると判断されたのに対し、模擬コントロールではレベル5であったことがわかります。これは40%の神経保護と一致しています。

しかし、傷害と最大傷害の比率を使用する従来の形式を使用すると、保護は明らかになりません。つまり、偽物の場合は50%、コールドプレコンディショニングの場合は50%です。ここに示すように、mRNAサンプルを使用して定量的PCRを行いました。

青線で示されているコールドプレコンディショニング後のTNFアルファのレベルは、緑、黄、紫の線で示されている対照よりも高かった。このことから、コールドプレコンディショニングが脳内でのTNFαの産生増加をトリガーし、定量的PCRおよび定量的PCRアレイの免疫染色結果を確認することが示唆されます。このスライス培養物は、赤で示されているインターロイキン11について処理され、ニューロンを緑色で示されている新しい端部を示しています。

矢印で示されている一部のパラメタルニューロンは、インターロイキン11と新しい末端染色を示し、黄色で示されていることに注意してください。矢印は、アストロサイトと推定され、インターロイキン11の染色の増加のみを示すいくつかの小さな細胞を指しています。コールドプレコンディショニングニューロプロテクションに関与するサイトカインシグナル伝達システムを説明する際には、いくつかの基本的に重要な概念に注意することが重要です。

サイトカインは正常な脳では非常に低い濃度にありますが、サイトカイン濃度のわずかな変化が遺伝子発現を変化させます。したがって、低濃度であっても、サイトカインは脳の構造と機能、したがって生物の表現型を変化させる大きな可能性を秘めています。この概念は、ここでは距離の逆数で表され、参照点として猫のひげと、TNFアルファと比較したナトリウムカリウムpHとカルシウムから始まります。

また、サイトカインは非常に冗長であり、熱帯性複数のサイトカインが同様の効果を持つ可能性があり、単一のサイトカインがさまざまな効果を持つ可能性があることに留意することも重要です。したがって、寒冷プレコンディショニングからの神経防御のための自然サイトカインの基礎を正確に確立するには、関連するシグナル伝達変数の複合解析を決定する必要があります。これは、マルチプレックスアッセイ戦略によって達成され、コールドプレコンディショニングニューロプロテクションのサイトカインシグネチャーが確立されます 一度習得すると、これらの培養物は約3時間で準備でき、研究するための操作を行うことができます。

コールドプレコンディショニングの応答は、これらの手順を実行しながら約3日間にわたって行うことができ、これらの手順に続く低レベルの炎症誘発性シグナル伝達を検出する能力を維持するためには、滅菌技術と最小限の取り扱いが必要であることを覚えておくことが不可欠である。プロテオミクス解析や分子生物学的解析などの他の方法を培養に適用して、コールドプレコンディショニングが脳に栄養的および保護的な影響を与える方法を解読することができます。