角膜共焦点顕微鏡：末梢神経障害で小型ファイバ病理を定量化するための新しい非侵襲的方法

このビデオでは、非侵襲的な手法である角膜共焦点顕微鏡（CCM）を用いて角膜C繊維を画像化し、神経繊維の損傷を定量化する手順を実演します。まず、CCMのレンズの焦点面を調整し、使い捨てキャップを装着する前にレンズにビスコティアゲルを塗布します。その後、眼に麻酔薬点眼液とビスコティアゲルを塗布します。

次に、レンズ前面のゲルが患者の角膜に接触するようにカメラを調整します。最後に、焦点面の深さを調整し、Bowman層の中心部から角膜神経の画像を撮影します。角膜神経線維の形態学的変化を観察することで、ニューロパチーを定量化できます。

これは非常に斬新な手法であり、実際にはこれまで検眼学や眼科学の分野で使用されてきましたが、ここ8年ほどの間に、私たちは糖尿病性ニューロパチーやその他の末梢ニューロパチーの研究および評価にこれを非常に効果的に活用してきました。この手法の最大の利点は、非常に早期の段階で小線維の損傷を定量化し、患者のニューロパチーの重症度を完全に非侵襲的に層別化できることです。また、2分間のスキャンで迅速に行うことができ、その結果からニューロパチーの重症度を定量化できるため、皮膚生検や神経生検などのより侵襲的な手法に取って代わることが期待されます。全体としては単純な手法に見えますが、実際には、最適な画像を撮影し、その画像を定量化するための明確な手順が必要となります。

この手法を利用しようとするすべての方にとって、プロセス全体が明確かつ明快であるようにしたいと考えています。HRT角膜共焦点顕微鏡を用いた検査の最初のステップは、レーザースキャニングカメラの対物チューブにある対物レンズチップの準備です。屈折力を+12ディオプトリーに設定し、次にカメラを最低位置に調整して、反時計回りに回転させてレンズを固定します。

Visco Tearsをレンズチップ上に、気泡のない均質なPサイズの滴として滴下します。滅菌容器からtomo capを取り出し、ゲルのメニスカスが対物レンズとキャップの間に形成されるように、ホルダーの可能な限り深い位置までレンズチップに被せます。装着時にtomo capの前面に触れないよう注意してください。

次に、レーザースキャニングカメラをカメラマウント上で可能な限り後方に移動させ、tomoキャップの内面と外面を確認します。両者はディスプレイモニター上に明るいレーザー反射として表示されます。明るい反射が観察されるまで焦点調整ホイールを回し、レンズのピントがキャップの前方に合わせられていることを確認してください。

フォーカスポジション表示に表示される深度値が、-150 µmから+150 µmの間になっているはずです。深度設定をゼロにリセットしてください。次に、患者の準備方法について説明します。

0.4%テトラカイン塩酸塩点眼液で被験者の眼を麻酔させた後、ビスコティアーズで眼表面を潤滑にします。被験者の顎を顎当てに乗せ、前頭部を額当てにしっかりと押し当てて、快適な状態で固定します。患者に外固定灯を注視させることで、検査がより容易になります。

検査していない側の目は、顕微鏡ヘッドがコンパクトであるため、被験者の対側眼が遮られることはありません。これにより、距離ターゲットの使用が可能になります。CCDカメラは、その光軸がレーザースキャニングカメラの光軸と垂直になるように配置してください。

右眼を撮影する場合はカメラを患者の右側に、左眼の場合は左側に配置します。この位置では、CCDカメラの中心にtomoキャップの前面が見えます。ライブ画像。

患者の角膜がtomo capから約5〜10 mmの距離になるまで、レーザースキャニングカメラを患者の方へ移動させます。次に、カメラマウントにある垂直および水平方向の調整ノブを使用して、tomo capが患者の角膜の中心に位置するように、レーザースキャニングカメラを上下左右に移動させます。その後、患者にできるだけ大きく目を開くように指示してください。

レーザースキャニングカメラをゆっくりと患者側に移動させ、トモキャップが患者の角膜に接触するようにします。この段階で、赤色レーザー光が角膜の中心にあること、および角膜からのレーザービームの反射が角膜の前極で正確に起こっていることを確認してください。適切に調整されていれば、レンズと角膜の接触は最小限になります。

CCDカメラのライブ画像で、tomoキャップと角膜の間に薄いゲルのブリッジが確認できます。tomoキャップと角膜の間の圧力が強すぎる場合、CCDカメラ越しに角膜が平坦化したように見えます。ライブ画像とストレイヤーがCCM画像に表示されます。

患者の調整後、HR threeレーザーカメラを起動すると、画面に画像取得ウィンドウが表示されます。CCD画像を使用して、トモキャップとレーザー光を患者の角膜上に位置合わせします。CCMには、画像をキャプチャするための3つのオプションがあります。

シーケンススキャンでは、調整可能なフレームレートで最大100枚の画像を取得できます。フレームレートは毎秒1フレームから30フレームの間で選択します。これにより、3秒から100秒の長さの動画を取得することが可能です。

ボリュームスキャンモードでは、カメラが連続する焦点面で40枚の一連の画像を自動的に取得します。合計85 µmの深度をスキャンでき、連続する2つの画像間の焦点距離は約2.1 µmです。最後のオプションはセクションモードであり、本実験ではこれを利用します。

このモードでは、フットスイッチを押すたびに鮮明な単一画像を取得・保存し、最適なイメージングを行うことができます。このモードは、角膜中心部のBowman層を含む角膜層全体の画像をキャプチャするために使用されます。十分な枚数の画像をキャプチャした後、シーケンスモードやボリュームモードなどの他のモードを使用することが可能です。

数回のスキャン後、レンズの焦点面を変更して、角膜表面に対する角膜細胞層の深さを測定することができます。具体的には、上皮細胞層に焦点を合わせ、リセットボタンをクリックして深さの値をゼロに設定します。検査が完了したら、取得ウィンドウのカメラ電源ボタンをクリックしてカメラの電源を切ります。局所麻酔が切れるまで、患者が目をこすらないように注意を促してください。

カメラからtomoキャップを取り外して廃棄し、蒸留水で湿らせた綿棒で顕微鏡レンズを清掃します。次に、既存の検査結果を確認・分析するために、画像を解析して神経線維パラメータを定量化する方法について説明します。まず、データベースウィンドウで適切な患者記録を選択してください。

画像表示ウィンドウでは、選択した患者の既存の角膜検査の概要が表示されます。異なる日に実施された検査は、個別の受診タブに保存されています。3種類の異なるスキャンタイプは、3つの異なるアイコンで表示されます。これはHeidelberg Eye Explorerの画像表示ウィンドウにあるHRT 3角膜受診タブです。

角膜画像を調査するには、適切な画像アイコンをダブルクリックし、「show now」を押して解析用の画像をエクスポートします。ツールバーの「export」をクリックし、画像を保存するフォルダを選択してください。本研究の主な焦点はBowman層および角膜神経であるため、この層の画像のみを解析します。被験者ごとに、角膜の異なる深度からBowman層のフレームを5〜6枚選択します。

画像解析は、当グループが開発した専用ソフトウェアであるCCM Image Analysis Tools（バージョン0.64）を用いて行います。角膜神経の主要なパラメータとして、1フレームあたりの主神経数と定義される神経線維密度を本ソフトウェアで測定します。神経分枝密度は、1フレームあたりの主分枝の総数です。

神経線維長は、1フレームあたりの主要神経および主要分枝の合計長です。屈曲度は、1フレームあたりの主要神経の屈曲率です。CCM画像を開くには、「ファイル」から「開く」を選択してください。

画像が読み込まれると、コントロールパネルの左上にある画像情報ボックスに画像のサイズとタイプが表示され、デフォルトのスケールが画像情報の編集行に表示されます。スケールが異なる場合は、編集行の数値を修正してください。画像の解析を開始するには、コントロールパネルの右上にあるメトリックボックスから測定したいパラメータを選択してください。

ページ下部の結果ボックスに、NFDおよびMBDが実数として表示されます。NFLはミリメートル（mm）で、曲折度は曲折係数として表示されます。結果はExcelシートにエクスポートすることが可能です。

Excelページを開くと、結果はNFDについては1mm²あたりの数、NFLについては1mm²あたりのmm、NFTについては屈曲係数として表示されます。これらの測定を行うには、まず各主神経をマーキングし、次に各主神経枝をマーキングしてください。最後に、フレーム内の各神経をトレースします。

精度の向上のためにデジタルペンを使用してもよい。この手技を習得すれば、適切に行うことで1分以内に完了させることができる。詳細な手順に従うことが重要である。

このビデオを視聴することで、角膜共焦点顕微鏡を用いて角膜の移動層から画像を撮影する方法、および末梢神経障害（特に糖尿病性神経障害）患者における同層の画像を定量化し分析する方法について、十分に理解していただけたことと思います。なお、CCMの操作には専門知識が必要であり、眼科検査のトレーニングを受けた専門家がこの手順を行うことが推奨されている点にご留意ください。