ヒト造血細胞のためのコロニー形成細胞（CFC）アッセイ

この手順では、半固体培地で、造血前駆細胞が増殖し、異なる造血系統に沿って分化して培養を開始する能力を評価します。2日後に活性化を促進するために、サイトカインの存在下で新たに解凍したCD 34陽性細胞。活性化されたCD 34陽性細胞をウイルスが予めロードされたプレートに添加することにより、GFP発現試験コンストラクトのレトロウイルス形質導入を行います。

48時間後、GFP陽性細胞をファックスで単離し、次いでこれらの細胞を成長因子を補充した半固体メチルセルロース培地にプレートし、コロニーが表面に現れるまで約2週間インキュベートする。最後に、コロニーを採取し、シトシンを使用してスライド上に細胞を固定し、右ギザで染色して造血系統と成熟段階を顕微鏡で測定します。この方法は、白血病発生の研究、すなわち造血分化に対する癌遺伝子の影響において、機構的な洞察を提供することができます。

培養物を見るためには、凍結CD34陽性細胞のバイアルを37°Cで静かに振とうし、最後の小さな氷の結晶が残るまで静かに解凍し、細胞懸濁液を50ミリリットルの円錐管に移します。バイアルから残りの細胞を1ミリリットルの室温、2%F-B-S-I-M-D-M培地で静かに洗い流し、穏やかに渦巻きながら50ミリリットルのチューブに滴下します。3分間待ちます。

続けて、2ミリリットルのメディアをゆっくりと加えながら、穏やかに混合し、再び3分間平衡化します。希釈した細胞懸濁液に等量の培地を3分間隔で添加するこの手順を繰り返し、最終容量が32ミリリットルに達するまで添加の間に穏やかに渦巻き、細胞を収集し、室温で250Gで10分間遠心分離し、ペレットの上に約0.5ミリリットルの培地を残してスーパーナートを除去します。ペレットを20ミリリットルの培地に懸濁し、200Gで8分間遠心分離することにより、細胞を一度洗浄し、室温で正気を取り除き、細胞を完全なIMDM培地に約50万個/ミリリットルで懸濁します。

最後に、細胞濃度を測定するために、懸濁液の10マイクロリットルを同量の0.4%トライアンブルー溶液と混合したマイクロチューブに入れてカウントします。ヘモサイトメーターを使用して、活性化サイトカインの混合物を補充した完全なIMDM培地を添加することにより、細胞を1ミリリットルあたり10〜5番目の細胞に希釈し、形質導入の日に2日間、加湿摂氏37度のインキュベーターで細胞を5%二酸化炭素でカウントし、ウイルスのプレロードを開始する前に、ウイルスのプレロードを開始する前に、A24ウェル未処理の組織培養プレートを調製するために調製するウェルの数を決定します。各ウェルに25マイクログラム/ミリリットルのレトロアクチン溶液を400マイクロリットル加え、層流バイオセーフティフード内で室温で2時間インキュベー

レトロアクチン溶液を取り出し、室温で30分間インキュベートして、各ウェルを2%BSAでコード化します。その間、ウイルスストック溶液を解凍し、氷上に保存します。次に、各ウェルに0.5ミリリットルのウイルス調製物を加えてBSA溶液をロードウイルスを吸引し、摂氏4度で2,200Gで15分間遠心分離します。

ウェルからウイルス溶液を取り出し、ウイルスのロードをさらに3回繰り返します。最後に、冷たいIMDM培地で各ウェルをすすぎます。次に、事前に活性化したCD 34陽性細胞を遠心分離によって収集し、サイトカインアリコートを添加した新鮮な完全なIMDM培地で細胞を再懸濁し、15万個のCD 34陽性細胞をウイルスコード化されたウェル、ウェルのそれぞれにインキュベートし、加湿摂氏37度のインキュベーターで5%二酸化炭素で2日間インキュベートします。

ウイルス浮遊プレートから細胞を懸濁し、懸濁液を50ミクロンの細胞フィルターで円錐形のチューブにろ過します。10マイクロリットルの細胞懸濁液をマイクロチューブに入れます。等量のトリアンブルー溶液と混合し、ヘモサイトメーターを使用して細胞をカウントします。

各ウェルを0.8ミリリットルの冷HBSSと0.02%EDTAですすぎ、50ミクロンのCEL Trixセルフィルターを介して同じ収集チューブに加えます。細胞を遠心分離でペレット化し、冷たいHBSSで一度洗浄します。最終細胞ペレットをHBSSに1%BAで再懸濁し、その後の細胞選別のために細胞を氷上に保ち、その後の細胞選別は、通常、実験計画に基づいて高速セルソーターコア施設で行われます。

必要な数のCFCアッセイ培地をボルテックスで解凍して混合し、チューブを少なくとも5分間放置して、気泡を表面に浮かび上がらせてから細胞を添加します。次に、3000個のウイルス形質導入された選別細胞を、冷たい2%F-B-S-I-M-D-M培地が入った滅菌マイクロチューブに取り込み、最終的な懸濁液量を0.3ミリリットルに調整します。細胞を懸濁し、細胞懸濁液全体を3ミリリットルのメチルカルト増殖培地に移します。

激しくボルテックスすることにより、均質な細胞懸濁液を作成します。チューブを3分間静止させます。細胞をプレートするためには、16ゲージの鈍い端の針を3ミリリットルの注射器に取り付け、2.2ミリリットルのドローを行います。

大きな気泡が取り込まれないように注意しながら、30mmの未処理組織培養皿2枚に各1.1ミリリットルを押し出し、100mm皿に複製したプレートを水皿と一緒に回転させて均等に広げます。3リットルの滅菌水培養を2週間続けます。コロニーをその形態に従って特徴付け、スコアリンググリッドでマークされた培養皿で40倍の倍率で倒立顕微鏡でスコアリングします。

培養結果を文書化するために、600DPIで通常のスキャナーを使用してCFCアッセイプレート全体をスキャンし、カラーカメラを装備した倒立顕微鏡を使用して代表的なコロニーの低倍率写真顕微鏡写真を撮影し、全体のCFCアッセイプレートから細胞を回収し、室温で数容量の2%F-B-S-I-M-D-Mを洗浄してモルフォロジー分析のためにカウントします。CFCアッセイプレートから回収した30, 000個の細胞をスライドに移します。STOsスピン遠心分離機を使用して、スライドを一晩風乾し、スライドを効率的に染色します。

溶液が入った9つの染色容器の組立ラインを次の順序で設置します。絶対メタノール右gemsaストック溶液右gemsa緩衝液、50%メタノールと水、水リン酸緩衝液pH6の2つの容器、そして最後に水の2つの容器。スライドをスライドキャリアに入れ、無水メタノールに2分間浸し、余分なメタノールを血液で取り除きます。

すぐにスライドキャリアを浸し、5分間gemsaストック溶液を書き込みます。担体をpH 6.4の右gemsa緩衝液に移し、10分間インキュベートします。担体を50%メタノールに2回浸し、水に10回浸し、さらに次の水容器に10回浸し、次にリン酸緩衝液に5回浸します。

pH 6.0です。担体を水に移し、2分間インキュベートします。最後の水容器で洗浄を繰り返します。

次に、スライドをキャリア内で完全に風乾させます。各スライドを取り外し、メタノールを染み込ませたキムワイプでスライドの裏側を拭いて汚れを取り除きます。サイトシール60を一滴垂らし、カバーガラスをシールする。

顕微鏡を使用して、各GM持続スライドについて500細胞分画カウントを実行します。この実験では、細胞を原始細胞、中間骨髄細胞、成熟骨髄細胞、中間赤血球細胞、成熟赤血球細胞の5つに分けます。例えば、新しい98匹のタカの対照発現と比較すると、9つのがん遺伝子は赤色赤血球コロニーの形成を増加させた。

このがん遺伝子の市場への影響は、コロニーを低倍率で観察するとはっきりと明らかになります。GEM stainingによるさらなる形態学的検査により、細胞集団の系統と成熟度に関する情報が得られます。この例では、新しい98ホークを導入し、9は赤血球過形成を有する細胞の総数を全体的に増加させ、赤血球および骨髄の両方の成熟の阻害を阻害する。

このSAは、インプット細胞調製物が半固体培地中で増殖、分化、コロニーを形成する能力を測定することにより、造血細胞の分化に関する洞察を提供します。