Name: ヒト造血細胞のためのコロニー形成細胞（CFC）アッセイ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-18T17:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 30 s
Description: 学ぶヒト造血幹細胞の増殖と分化を評価するCFCアッセイ。レトロウイルス導入したCD34+細胞をメチルセルロース培地で培養し、コロニー形態と細胞分化を解析することで、造血と白血病発生のメカニズムを解明する。

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我々は、フローサイトメトリー機器と並べ替えのサービスを提供する高速セルソーターのコアの使用のために、医学とセントルイス、ミズーリのバーンズユダヤ人病院のワシントン大学でアルヴィンJ ·サイトマンがんセンターに感謝します。この作品は、健康補助R01 HL082549とK02 HL084179（NRY）の国立研究所によってサポートされていました。サイトマンがんセンターは、NCIがんセンターサポート助成金P30 CA91842によって部分的にサポートされています。

<ol><li>Takeda, A., Goolsby, C., Yaseen, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NUP98-HOXA9+induces+long-term+proliferation+and+blocks+differentiation+of+primary+human+CD34%2B+hematopoietic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">NUP98-HOXA9 induces long-term proliferation and blocks differentiation of primary human CD34+ hematopoietic cells.</a> Cancer Res. , 66-6628 (2006).</li>
<li>Yassin, E. R., Abdul-Nabi, A. M., Takeda, A., Yaseen, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+the+NUP98-DDX10+oncogene+on+primary+human+CD34%2B+cells%3A+role+of+a+conserved+helicase+motif%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">Effects of the NUP98-DDX10 oncogene on primary human CD34+ cells: role of a conserved helicase motif.</a> Leukemia. , Forthcoming (2010).</li>
<li>Yassin, E. R., Sarma, N. J., Abdul-Nabi, A. M., Dombrowski, J., Han, Y., Takeda, A., Yaseen, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+of+the+transformation+of+primary+human+hematopoietic+cells+by+the+oncogene+NUP98-HOXA9%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Dissection of the transformation of primary human hematopoietic cells by the oncogene NUP98-HOXA9.</a> PLoS One. 4, e6719-e6719 (2009).</li>
<li>Nissen-Druey, C., Tichelli, A., Meyer-Monard, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+hematopoietic+colonies+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Haematol%22%5BJournal%5D)">Human hematopoietic colonies in health and disease.</a> Acta Haematol. 113, 5-96 (2005).</li>
<li>Pereira, C., Clarke, E., Damen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoietic+colony-forming+cell+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Hematopoietic colony-forming cell assays.</a> Methods Mol Biol. 407, 177-208 (2007).</li>
<li>Coulombel, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+hematopoietic+stem%2Fprogenitor+cells%3A+strength+and+drawbacks+of+functional+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Identification of hematopoietic stem/progenitor cells: strength and drawbacks of functional assays.</a> Oncogene. 23, 7210-7222 (2004).</li>
<li>Hogge, D. E., Lansdorp, P. M., Reid, D., Gerhard, B., Eaves, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+detection%2C+maintenance%2C+and+differentiation+of+primitive+human+hematopoietic+cells+in+cultures+containing+murine+fibroblasts+engineered+to+produce+human+steel+factor%2C+interleukin-3%2C+and+granulocyte+colony-stimulating+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Enhanced detection, maintenance, and differentiation of primitive human hematopoietic cells in cultures containing murine fibroblasts engineered to produce human steel factor, interleukin-3, and granulocyte colony-stimulating factor.</a> Blood. 88, 3765-3773 (1996).</li>
</ol>

利害の衝突は宣言されません。

CFCアッセイは、造血前駆細胞の増殖と分化のパターンを決定し、癌遺伝子（4,5）の効果を研究するために広く使用されています。それは、コロニーは単一の前駆細胞の子孫を代表し、個別に、さらなる分析のために削除できるように、クローン検定というの液体培地より優れています。 CFCアッセイの制限は、より未熟な前駆細胞や造血幹細胞の検出のための適切ではないことがあるので、細胞は長期培養 - 開始細胞（LTC - IC）アッセイ（6,7）を用いて検出されています。実験では、AML関連の癌遺伝子NUP98 - HOXA9の骨髄および赤血球の成熟を阻害し、赤芽球過形成を（1、3）原因となることを示しているここで説明する。 メチルセルロースベースの文化が比較的長期であり、CFCの培地は抗生物質が含まれていないので、特に中および並べ替えの後に、細胞培養の汚染を防ぐために極めて重要である。わずかな細菌や真菌汚染は、文化を圧倒するでしょう。フローサイトメトリーおよび細胞形態の解釈には経験が必要です。トレーニングを受けた担当者と協議することをお勧めします。初代ヒト骨髄性前駆細胞と一緒に使用する適合性のために...

<table><tbody><tr><td>IMDM</td><td>Life Technologies</td><td>12440</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>06150</td><td></td></tr><tr><td>L-グルタミン</td><td>Life Technologies</td><td>25030</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン (PS)</td><td>Life Technologies</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>FLT-3リガンド</td><td>PeproTech Inc</td><td>300-19</td><td></td></tr><tr><td>GM-CSF</td><td>PeproTech Inc</td><td>300-03</td><td></td></tr><tr><td>SCF</td><td>PeproTech Inc</td><td>300-07</td><td></td></tr><tr><td>TPO</td><td>PeproTech Inc</td><td>300-18</td><td></td></tr><tr><td>IL3</td><td>PeproTech Inc</td><td>200-03</td><td></td></tr><tr><td>IL6</td><td>PeproTech Inc</td><td>200-06</td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7030</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP118</td><td></td></tr><tr><td>レトロネクチン</td><td>Takara Bio Inc</td><td>T100A</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Life Technologies</td><td>14175</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Life Technologies</td><td>14200</td><td></td></tr><tr><td>トリパンブルー溶液 (0.4%)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>Methocult GF+ H4435</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>04445</td><td></td></tr><tr><td>ヒトメチルセルロース濃縮培地</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>HSC005</td><td></td></tr><tr><td>ライト/ギムザ染色液</td><td>Harleco</td><td>64571</td><td></td></tr><tr><td>リン酸緩衝液, pH 6.4 - Giordano処方</td><td>Ricca Chemical Company</td><td>1450</td><td></td></tr><tr><td>メタノール</td><td>Fisher Scientific</td><td>A412-4</td><td></td></tr><tr><td>Cytoseal 60</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>8310</td><td></td></tr><tr><td>正常マウス血清</td><td>Rockland Immunochemicals</td><td>D208</td><td></td></tr><tr><td>抗ヒト CD11b フィコ&amp;#8211;エリトリン結合抗体</td><td>BD Biosciences</td><td>555388</td><td></td></tr><tr><td>抗ヒト CD33 アロフィコシアニン結合抗体</td><td>BD Biosciences</td><td>551378</td><td></td></tr><tr><td>抗ヒト CD45 フィコ&amp;#8211;エリトリン-Cy7結合抗体</td><td>BD Biosciences</td><td>557748</td><td></td></tr><tr><td>抗ヒト CD71 フィコ&amp;#8211;エリトリン結合抗体</td><td>BD Biosciences</td><td>555537</td><td></td></tr><tr><td>抗ヒト CD235a アロフィコシアニン結合抗体</td><td>BD Biosciences</td><td>551336</td><td></td></tr><tr><td>抗ヒト CD45 フィコ&amp;#8211;エリトリン-Cy7結合抗体</td><td>BD Biosciences</td><td>557748</td><td></td></tr><tr><td>24ウェル 未処理組織培養プレート</td><td>BD Biosciences</td><td>35-1147</td><td></td></tr><tr><td>30 mm 未処理ディッシュ</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>27150</td><td></td></tr><tr><td>100 mm 組織培養ディッシュ</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-757-12</td><td></td></tr><tr><td>グリッド付きスコアリングディッシュ</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>27500</td><td></td></tr><tr><td>15 ml 遠心チューブ</td><td>BD Biosciences</td><td>35-2097</td><td></td></tr><tr><td>50 ml 遠心チューブ</td><td>BD Biosciences</td><td>35-2070</td><td></td></tr><tr><td>3 ml シリンジ</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>28240</td><td></td></tr><tr><td>16ゲージ 鈍端 1&amp;frac12;インチ針</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>28110</td><td></td></tr><tr><td>50 &amp;mu;m CellTrics セルフィルター</td><td>Partec</td><td>04-004-2327</td><td></td></tr><tr><td>血球計数器</td><td>Fisher Scientific</td><td>0267110</td><td></td></tr><tr><td>TPXサンプルチャンバー</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>A78710018</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Superfrost/Plus 顕微鏡スライドグラス（洗浄済）</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Shandon フィルターカード</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>5991022</td><td></td></tr><tr><td>Shandon サイトスピン用スライドホルダー</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>59920063</td><td></td></tr><tr><td>Shandon Complete Staining Assembly 100</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>100</td><td></td></tr><tr><td>キムワイプス</td><td>Kimberly-Clark Corporation</td><td>34155</td><td></td></tr><tr><td>1 &amp;mu;m フィルターペーパー</td><td>VWR international</td><td>28307-134</td><td></td></tr><tr><td>倒立顕微鏡</td><td>Nikon Instruments</td><td>Diaphot</td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡カメラ</td><td>Nikon Instruments</td><td>DS-F11</td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡</td><td>Olympus Corporation</td><td>BX51</td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡カメラ</td><td>Olympus Corporation</td><td>DP71</td><td></td></tr><tr><td>スキャナー</td><td>Microtek</td><td>Scanmaker 4</td><td></td></tr><tr><td>ボルテックスミキサー</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-812</td><td></td></tr><tr><td>組織培養インキュベーター</td><td>Sanyo</td><td>MCO-18AIC</td><td></td></tr><tr><td>サイトスピン</td><td>Shandon, Inc.</td><td>Cytospin 2</td><td></td></tr><tr><td>卓上遠心機</td><td>Eppendorf</td><td>5810-R</td><td></td></tr><tr><td>水精製システム</td><td>Barnstead</td><td>Nanopure-Diamond</td><td></td></tr></tbody></table>

ヒト造血細胞のためのコロニー形成細胞（cfc）アッセイ

Colony Forming Cell (CFC) Assay for Human Hematopoietic Cells

ヒト造血幹細胞/前駆細胞は、通常、骨髄、臍帯血、または末梢血から得られ、造血及び白血病を研究するために使用されています。彼らは、リンパ球と骨髄系の系統に分化する能力を持っている。コロニー形成細胞（CFC）アッセイは、半固形培地でコロニーを形成する能力によって造血前駆細胞の増殖と分化のパターンを研究するために使用されます。入力セルの固定の数によって形成されたコロニーの数と形態は差別化する前駆細胞の能力についての予備的な情報を提供して増殖する。細胞はフローサイトメトリーとギムザ染色スライドの形態学的評価を使用して、その数字と分化の状態を評価するために、個々のコロニーからまたはプレート全体から収穫することができる。このアッセイでは、骨髄がリンパではない差別化を評価するのに便利です。この文脈における用語骨髄性は、単球、顆粒球、赤血球を包含する、その広い意味で使用され、巨核球系統れている。 我々は、末梢血由来の初代ヒトCD34 +細胞の分化に癌遺伝子の効果を評価するために、このアッセイを使用している。この目的のために細胞を対照レトロウイルス構築物またはこの場合NUP98 - HOXA9で、関心の癌遺伝子の発現コンストラクトのどちらかで形質導入されています。我々は、関心とGFPマーカーの遺伝子を生成するバイシストロンmRNAを発現し、一般的に使用されるレトロウイルスベクター、MSCV - IRES - GFPを、採用しています。細胞は、レトロウイルス形質導入の前に二日間のサイトカインの存在下で増殖させることによって事前にアクティブ化されます。さらに2日後に、GFP +細胞は、蛍光活性化細胞選別（FACS）によって単離され、コロニーは表面に現れるまでの14日間一般的に、サイトカインを添加したとインキュベートメチルセルロースを含む半固形培地と混合。コロニーの数と形態は文書化されています。次いで、細胞をプレートから除去し洗浄し、カウント、およびフローサイトメトリーおよび形態学的検査に供される。造血過程で発現する細胞表面マーカーに特異的な抗体とフローサイトメトリーでは、系統と成熟段階についての情報を提供します。ライト - ギムザ染色後、顕微鏡下で個々の細胞の形態学的研究は、系統と成熟に関してさらなる情報を提供しています。癌遺伝子で形質ものに制御空のベクターで形質導入された細胞の比較では、造血系への分化に対する癌遺伝子の影響を明らかにする。

細胞（CFC）アッセイをコロニー形成は、造血前駆細胞が半固形培地でコロニーを形成しているのin vitroアッセイである。コロニー形態、細胞形態、およびフローサイトメトリーの組み合わせは、異なる造血系統に沿って増殖し、分化する前駆細胞の能力を評価するために使用されます。

ヒト造血細胞のためのコロニー形成細胞（CFC）アッセイ

ヒト造血幹/前駆細胞は通常、骨髄、臍帯血、または末梢血から採取され、造血および...の研究に使用されます。

この手順では、半固形培地を用いて、造血前駆細胞が異なる造血系に沿って増殖および分化する能力を評価します。凍結融解直後のCD 34陽性細胞をサイトカイン存在下で2日間培養し、活性化を促進させます。活性化したCD 34陽性細胞を、ウイルスをあらかじめ添加したプレートに播種し、GFP発現試験構築体のレトロウイルス導入を行います。48時間後、FACSを用いてGFP陽性細胞を分離し、成長因子を添加した半固形メチルセルロース培地にこれらの細胞を播種します。表面にコロニーが出現するまで、約2週間インキュベートします。最後に、コロニーを回収し、サイトシンを用いて細胞をスライドガラス上に固定し、ライトギムザ染色を行い、造血系の系統および成熟段階を顕微鏡で判定します。この手法は、白血病発生、すなわちオンコジーンが造血分化に及ぼす影響の研究において、機序的な知見を提供することができます。培養を開始するために、凍結保存されたCD 34陽性細胞のバイアルを37°Cで、最後の小さな氷結晶が残るまで静かに振って急速解凍し、細胞懸濁液を50 mLコニカルチューブに移します。室温の2% F-B-S-I-M-D-M培地1 mLを用いて、バイアルに残った細胞を静かに洗い流し、チューブを軽く回しながら滴下して加えます。その後、3分間待ちます。ゆっくりと撹拌しながら培地を2 mL加え、再び3分間平衡化します。希釈した細胞懸濁液に同量の培地を加えるこの操作を、加え終わるたびに緩やかに旋回混和させながら、最終容量が32 mLに達するまで3分間隔で繰り返します。細胞を回収するため、室温で250 Gで10分間遠心分離し、ペレットの上に約0.5 mLの培地を残して上清を除去します。続いて、ペレットを20 mLの培地に懸濁させ、室温で200 Gで8分間遠心分離して細胞を1回洗浄します。上清を除去し、完全IMDM培地を用いて細胞濃度が約5×10⁵ cells/mLになるように懸濁します。最後に、細胞濃度を決定するため、懸濁液10 µLをマイクロチューブに取り、同量の0.4%トリパンブルー溶液と混合して計測します。ヘモサイトメーターを用い、活性化サイトカイン混合物を添加した完全IMDM培地を加えて、細胞密度を10⁵ cells/mLに希釈します。細胞を5% CO2を含む37 °Cの加湿インキュベーターで2日間培養します。導入当日は、ウイルスプレロードを開始する前に細胞数を計測し、24ウェル未処理組織培養プレートを準備するためのウェル数を決定します。各ウェルに25 µg/mLのレトロネクチン溶液を400 µL添加し、ラミナーフローバイオセーフティキャビネット内で室温で2時間インキュベートします。レトロアクチン溶液を除去し、2%BSAを用いて室温で30分間インキュベートし、各ウェルをコーティングします。その間に、ウイル

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Immunology and Infection

免疫学と感染症

内皮コロニー形成前駆細胞（ECFCs）は血管の恒常性と修復を研究するために有望なツールです。...

分離と成人ヒト内皮コロニー形成前駆細胞の大規模拡張

内皮コロニー形成細胞（ECFCs）組み込み表示されていること、堅牢なクローン増殖能と血管内皮細胞を循環している...

ヒト臍帯血由来血管内皮コロニー形成細胞の表現型および機能解析

このビデオでは、抗がん剤による治療に応答して白血病細胞によって形成されるコロニーの数を特定し、カウントするのに役立つメチルセルロースベースのコロニー形成ユニットまたはCFUアッセイのプロトコルについて説明しています。...

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このプロトコルは、転写因子の強制発現を通じて、ヒト多能性幹細胞からの血行性内皮および多能性造血前駆細胞の効率的な誘導について説明しています。...

ヒト多能性幹細胞における転写因子の過剰発現によって、造血内皮と血液の直接誘導

ここで、提示ひと多能性幹細胞 (hPSC) 培養のプロトコル、CD34 に hPSCs を区別するために使用される+造血前駆細胞。このメソッドは、排他的に決定的なまたは原始的な造血プログラムのいずれかのセルを指定するカノニカル WNT...

ひと多能性幹細胞からプリミティブかつ決定的な造血前駆細胞の分化を監督

ここでは、in vitro および in vivo 遺伝子とヒト化マウスモデルを使用して白血病の薬剤標的として C-fos と Dusp1...

C-fos の役割と Dusp1 の遺伝子依存性の評価方法

ここで、フィーダーおよびキセノフリー状態でヒト多能性幹細胞から血原性内皮を正確に形成するプロトコルを提示する。この方法は、疾患のモデリングと治療化合物のスクリーニングに幅広い応用を持つことになります。...

フィーダーとゼノフリーの定義条件におけるヒト多能性幹細胞からの血原性内皮分化

ここでは、生体内培養造血幹細胞およびT細胞におけるミトコンドリア質量および膜電位を測定する信頼性の高い方法について説明する。...

造血幹細胞とT細胞におけるミトコンドリア質量と膜電位の測定

ここでは、初期バースト形成ユニット赤血球(BFU-e)およびコロニー形成ユニット赤血球(CFU-e)前駆細胞を新鮮なマウス骨髄および脾臓から直接前向きに単離するための新しいフローサイトメトリー法について説明します。単一細胞トランスクリプトームデータに基づいて開発されたこのプロトコルは、組織のすべての赤血球前駆細胞を高純度で分離した最初のプロトコルです。...

フローサイトメトリーによるマウス組織からのバースト形成ユニットおよびコロニー形成ユニット赤血球前駆細胞の同定と単離(英語)

ここでは、細胞分裂の数、表面細胞の表現型、および細胞の親族関係を同時に測定できるフローサイトメトリーベースの技術を紹介します。これらのプロパティは、順列ベースのフレームワークを使用して統計的にテストできます。...

フローサイトメトリー による 造血幹細胞と前駆細胞の血縁関係、分裂数、表現型の同時評価

このプロトコルは、患者の骨髄および末梢血単核細胞から由来するヒト造血幹細胞および前駆細胞の分化誘導手順を概説しています。このアッセイは半固体培養培地を用いて赤血球および骨髄系譜のコミットメントを支持し、前臨床薬物特性評価のための再現性コロニー分類の標準化された指標を取り入れています。...

患者由来の骨髄および末梢血単核細胞に適応したコロニー形成ユニットアッセイ

学ぶヒト造血幹細胞の増殖と分化を評価するCFCアッセイ。レトロウイルス導入したCD34+細胞をメチルセルロース培地で培養し、コロニー形態と細胞分化を解析することで、造血と白血病発生のメカニズムを解明する。

ヒト造血細胞のためのコロニー形成細胞（CFC）アッセイ

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