Name: デング熱蚊の感染症（A.ネッタイシマカ）と感染症の表現型決定のためのプロトコル (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-07-04T21:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 25 s
Description: 学ぶデングウイルス感染プロトコル。Aedes aegypti蚊にウイルスを感染させ、中腸と唾液腺のウイルス価を測定する方法です。遺伝子機能評価や感染症制御戦略の研究に活用できます。

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A.は、C6/36細胞株にウイルスを伝播します。 <ol><li>細胞は75 cm 2でフラスコに80％コンフルエントに成長する。 </li><li>フラスコ内に残っ​​ている3〜4ミリリットルで、メディアを削除する。 </li><li> 0.5mlの株式のウイルスを取り出し、細胞あたり1.5ウイルス粒子の感染多重度で、上記のセルに追加します。徐々に室温で15分間フラスコを振とう。 </li><li> 5％CO 2、37℃で45分間インキュベート</li><li> 30mlのメディアを追加し、5日間インキュベートする。 </li></ol> B.は、ウイルスと血液の混合物を準備する<ol><li>スクレーパーで細胞をデタッチし、50 mLコニカルチューブに細胞とメディアを転送する。 </li><li>上清を収集するが、細胞ペレットと上清1mlのまま、10分間、800グラムでCentrifugate。 </li><li> ℃の水浴、繰り返し2〜3倍の37に解凍し乾燥したCO 2に、上記の細胞ペレットを凍結し、 </li><li>上清を取り、ステップ3から採取した上清と結合して、10分間800グラムでCentrifugate。 </li><li>熱帯熱マラリア原虫を持つハマダラカ蚊を感染させるために生殖母細胞培養の調製のための同じ手順（ステップ3）でのヒト全血を集める。 </li><li>ステップ4からウイルス上清を上記のヒト全血の同量を組み合わせて、ヒト血清を（全体の体積の10％）を追加。 </li><li> 37℃の水浴で30分間ヒト血液およびデングウイルスの上記混合物をインキュベート</li></ol> C.の餌付けの蚊この手順では、蚊の熱帯熱マラリア原虫感染症のセクションで説明されているものとほとんど同じです。吸血後14日目7日目、および唾液感染で我々は、アッセイ中腸感染症を。ウイルスと接触して来たすべての材料は、75％エタノールで、次に10％の漂白剤との最初の扱われます。 D.アッセイ蚊組織におけるウイルス力価<ol><li>二、三日蚊の組織解剖前に、細胞はアッセイが行われる日で80％コンフルエントに達するように24ウェルプレートでのC6/36細胞を成長させる。 </li><li>蚊は4で麻酔℃で1分間75％エタノールでそれらを浸すことによって犠牲と滅菌表面C、。その後、蚊は、解剖顕微鏡下で腸や唾液腺の解剖前に二度滅菌水で洗浄した。このステップからは、以下のすべての手順は、このような生物学的安全キャビネットのような無菌環境で実施する必要があります。これらの組織は、150μlの培地を含む試験管に移し、90秒間Kontesペレット乳棒モーターでホモジナイズされています。 </li><li> 990μLのメディアにホモジネートの10μlを添加することにより100倍希釈液を加えます。 </li><li>さらに1を確認：10、1:100と96ウェルプレートの培地で1:1000希釈; </li><li> 24ウェルプレートでメディアを取り出し、それぞれの対応するウェルに上記の4つの希釈液の各々の100μlを加える。 </li><li>その後、5％で45分間インキュベートし、室温で15分間ゆっくりプレートを振るCO 2、37 ° C; </li><li>各ウェルにmethycelluloseオーバーレイ（1％）の1mlを追加します。 </li><li> 37プレートをインキュベート℃で5日間、5％CO 2で。 </li><li>ここから無菌環境を必要としない上に、任意の他の病原体のケアと同様のステップは常に注意が必要です。各プレートからmethycelluloseのオーバーレイを破棄し、余分なメディアを削除するには汚点</li><li>各ウェルにメタノール/アセトン固定液（1:1）を1mlを追加。 1時間4℃でおいてください。 </li><li>固定液を捨て、そして1X PBSで1回洗浄する。 </li><li> 5パーセントへべれけとウイルスに対する一次抗体に1:1000希釈を行う。 </li><li> 37℃でインキュベート、各ウェルに希釈した高度免疫液200μlを加え℃で1時間のためのC; </li><li>高度免疫体液を削除し、1 × PBSでプレートを洗浄</li><li> 5パーセントへべれけ（1 X PBSを100mlの5グラム脱脂粉乳）でヤギ抗マウス共役（KPLカタログ番号074〜1806）の1:1000希釈を準備し、各ウェルに200μlを加える、とでインキュベート1時間37 ° C; </li><li>次のように基板を準備する：溶解後、1 X PBSの20ml中の3&#39; -ジアミノベンジジンterrahydrochloride（Sigmaカタログ＃D5905）の1錠を追加し、次に30％過酸化水素ペルオキシダーゼの8μlを追加する</li><li>各ウェルに上記基板の200μlを追加。 10分間室温で放置</li><li>基板を取り外し、各ウェルに蒸留水を1mlを加えて反応を停止</li><li>乾燥して水とブロットプレートを捨て、 </li><li>ウイルス粒子を数える</li></ol>

<table><tbody><tr><td>インキュベーター</td><td></td><td></td><td></td><td>5% CO2, 37oC</td></tr><tr><td>50 ml コニカルチューブ</td><td></td><td></td><td></td><td>プラスチック製</td></tr><tr><td>ピペットチップ</td><td></td><td></td><td></td><td>組織培養用</td></tr><tr><td>ピペットマン</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>パストゥールピペット</td><td></td><td></td><td></td><td>ガラス製、滅菌済み</td></tr><tr><td>恒温水槽</td><td></td><td></td><td></td><td>37C</td></tr><tr><td>遠心分離機</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>パラフィルム</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>循環水槽</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ガラス製メンブレンフィーダー</td><td></td><td></td><td></td><td>フィーダー適合ゴムチューブ付き</td></tr><tr><td>蚊飼育カップ</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>75% エタノール</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10% 漂白剤</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>組織培養プレート</td><td></td><td></td><td></td><td>6ウェル、24ウェル、および96ウェルプレート</td></tr><tr><td>ペトリ皿</td><td></td><td></td><td></td><td>ガラス製</td></tr><tr><td>スライドガラス</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>先細ピンセット</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td></td><td></td><td></td><td>1X, 滅菌済み</td></tr><tr><td>解剖顕微鏡</td><td>顕微鏡</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>C6/36 細胞</td><td>細胞</td><td></td><td></td><td>ウイルス増殖用</td></tr><tr><td>C6/36培地</td><td></td><td></td><td></td><td>10% 熱不活化FBS、1% L-グルタミンおよび非必須アミノ酸、1% (v/v) ペニシリン-ストレプトマイシン含有MEM</td></tr><tr><td>3&amp;rsquo;-ジアミノベンジジン四塩酸塩</td><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5905</td><td>1錠を20 mlの1 X PBSに溶解し、その後30% 過酸化水素を8 &amp;#x03BC;l添加する</td></tr><tr><td>30% 過酸化水素</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>A. aegypti</td><td>動物</td><td></td><td></td><td>蚊</td></tr></tbody></table>

デング熱蚊の感染症（a.ネッタイシマカ）と感染症の表現型決定のためのプロトコル

Protocol for Dengue Infections in Mosquitoes (A. aegypti) and Infection Phenotype Determination

この手順の目的は、実験室条件でのデング熱ウイルスにヒトスジシマカの蚊に感染し、蚊の組織の感染レベルやウイルスのダイナミックを検討することである。このプロトコルは、定期的に、特にベクトルの能力を決定することができる新たな宿主因子の同定のために、蚊のウイルスの相互作用を研究するために使用されます。全体の実験は、BSL2実験室で行われなければならない。熱帯熱マラリア原虫の感染症と同様に、手袋と白衣を含む適切な服装を常に着用する必要があります。実験後は、ウイルスと接触したすべての材料は通常の洗濯を始める前に、75％エタノールと漂白で処理する必要があります。他のすべての材料は廃棄それらの前にオートクレーブ処理する必要があります。

遺伝子は、デング熱ウイルスのための潜在的に耐火として識別されると、それは蚊の中でウイルス感染の予防にその役割を評価する必要があります。このプロトコルは、蚊のデング熱感染症の程度をアッセイする方法を示します。文化、膜の給餌蚊、ヒト血液中にウイルスが育ち、そして蚊の中腸におけるウイルス力価を測定するための技術が実証されています。

デング熱蚊の感染症（A.ネッタイシマカ）と感染症の表現型決定のためのプロトコル

本手順の目的は、実験室条件下でネッタイシマカ（Aedes mosquito）にデングウイルスを感染させ、その感染レベルおよび...の動態を検討することである。

ジョージ・ディモプロスです。これから、Aedes GTI蚊にデングウイルスを感染させる手順を説明します。まず最初に行うのは、Aedes Aus細胞株を用いてウイルスを増殖させることです。ホセ・ルイス・ラミレスです。Ausラボの博士課程学生です。本手順では、組織培養フードと37°Cに設定されたCO2インキュベーターを備えたBSL-2施設が必要です。また、50 mlプラスチック製コニカルチューブ、ヒト血清、37°Cのウォーターバス、および遠心機を使用します。96ウェルプレートおよびその他の標準的な分子生物学・生化学用試薬、消耗品が必要です。ここはBSL-2施設内の通常の組織培養フードであり、最初のステップは、75 cm²フラスコ内でコンフルエンシーが80%まで達した細胞を取り出すことです。使用する培地は、10%熱不活化胎児牛血清、1% L-glutamineおよび非必須アミノ酸を添加したMEM培地です。それでは、細胞にデングウイルスを添加します。-80°Cのフリーザーからウイルスストックを取り出し、37°Cのインキュベーターで解凍しておきました。細胞1個あたり約1.5個のウイルス粒子という濃度にするため、約0.5 mLのウイルスストックを細胞に添加します。その後、細胞をシェーカーにかけ、低速で約15分間振盪させます。次に、細胞をCO2インキュベーターに約45分間置きます。温度は37 °C、CO2濃度は5%です。45分間のインキュベーション後、細胞を取り出して30 mlの培地を加え、再びインキュベーターに戻してさらに5日間インキュベートします。次に、感染に使用するウイルス粒子を調製します。まず、スクレーパーを用いてフラスコから細胞を剥離させ、培地とともに50 mlのコニカルチューブに移します。次に、細胞を12,000 RPMで10分間遠心分離し、ペレット化させます。このボトルの底にペレットが確認できます。次に、上清を除去し、細胞からウイルスを放出させるため、細胞を含む1 mlのみを残します。その後、これらを凍結させます。これにより細胞が破裂します。その後、細胞を融解させ、再び凍結させるというこの手順を3〜4回繰り返します。凍結にはドライアイスを使用します。凍結後、細胞ペレットを37 °Cのウォーターバスに置いて融解させ、再びドライアイスで凍結させます。各凍結ステップの間、ボルテックスを用いて細胞を懸濁させます。ここで、ウイルスを含む上清を回収し、同様にウイルス粒子を含む前回の遠心分離後の上清に加えます。このウイルス調製液は、同量のヒト全血および血清と混合する準備が整いました。ここでは、15%のヒト血清を添加したヒト全血にウイルス調製液を混合しました。この血液ウイルス溶液を、蚊への給餌および感染に使用します。この血液をメンブレンフィーダーに加え、このメンブレンフィーダーを蚊の入ったカップの上に設置し、約25分間、蚊にこの血液を吸わせます。メンブレンフィーダーを固定するためにクリップを装着しています。これにより、基本的にはネットの上でフィーダーを重しで固定しており、これからフィーダーに血液を加えます。蚊は通常、暗い場所で吸血することが多いため、本実験は暗所で行った方がより効果的な場合があります。これは、もちろん蚊のコロニーがどのように馴化されているかによって異なります。ここで、蚊が約25分から30分間吸血したため、メンブレンフィーダーを取り外し、除染用の安全な容器に入れます。吸血後、吸血しなかった蚊を吸血済みの蚊から分ける必要があります。そのためには、吸血済みの蚊が入った小型カップを5～10分間冷室に置き、蚊をダウン（麻酔状態に）させます。このように、冷室に入れることで蚊はすでにダウンしています。蓋を開け、蚊を小さなペトリ皿に移します。蚊を常に低温に保ち、逃走を防ぐため、ペトリ皿はアイスバケットの中に置いておきます。これらの蚊は感染しているため、絶対に逃がさないよう細心の注意を払ってください。蚊を低温室に移動させた後、室温に維持された通常の昆虫飼育室へ移しますが、蚊は常にアイスバケットに入れたペトリ皿の中に保持し、常に活動を抑制した状態にします。吸血した蚊を、吸血していない蚊から分けることができるのがわかります。吸血した蚊は血を吸っており、完全に腹部が膨張しています。一部の個体は部分的に吸血しており、完全には飽食していません。腹部に少量の血液が含まれているものもあれば、大量に含まれているものもあります。UNFIの個体は腹部に血液を全く含んでいないため、吸血済みの個体と未吸血の個体を非常に容易に区別することができます。これらの蚊をペトリ皿からワックスライン付きのカードボードカップに移動させます。次のステップは、蚊におけるデングウイルスの感染をアッセイすることです。蚊の中腸におけるウイルス感染をアッセイしたい場合は、吸血から約7日後に蚊を解剖する必要があります。唾液腺におけるウイルス感染を分析したい場合は、吸血後約14日で蚊を解剖する必要があります。それでは、ホセが蚊から中腸を摘出する方法を説明します。蚊は氷上で麻酔されており、70%エタノールに約1分間浸漬させることで殺虫します。次に、蚊を2つの連続した水浴に移動させます。それぞれ1分間ずつ行います。これにより、蚊からエタノールを洗い流します。次に、顕微鏡スライド上のPBS中で蚊を解剖します。エジプトカイ蚊から中腸を摘出する最適な方法は、蚊を翅の上に仰向けに置き、一方のピンセットで腹部を、もう一方のピンセットで胸部を掴み、そのまま蚊を引き離すことです。現在、Joseが蚊を引き離しており、腹部と胸部の間に腸が現れます。この半透明の組織が、蚊の上部に現れた腸です。次に、解剖した腸を細胞株用培地に移し、組織培養フードへ運んで腸からウイルス粒子を単離します。解剖した中腸を組織培養室に持ち込み、乳鉢と乳棒でホモジナイズしてウイルス粒子を放出させます。中腸のホモジナイズ後、ホモジネートに培地を加え、ウイルス粒子を1/100に希釈します。次に、これをさらに1/10、1/100、1/1000へと希釈し続けます。96ウェルプレートにおいて、24ウェルプレートにコンフルエンス80%まで育成させたAlba picto細胞株を準備します。その後、Alba picto細胞から上清を除去し、各希釈段階におけるウイルス粒子の濃度を決定するために、これらの細胞に希釈したウイルス粒子を添加します。これにより、ウイルスの感染レベルを判定することができます。蚊の中腸において、細胞を室温で15分間ゆっくりと振盪します。その後、細胞を37°CのCO2インキュベーター内に45分間置きます。次に、各ウェルに1%メチルセルロースオーバーレイ液を1 ml加え、プレートを再び37°CのCO2インキュベーターで5日間インキュベートします。5日間のインキュベーション後、各ウェルにアセトン・メタノール固定液を1 ml加えます。その後、プレートを冷蔵庫にて4°Cで1時間インキュベートします。次に、固定液を除去し、各ウェルをPBSで1回洗浄します。続いて、抗デング一次抗体を5%血液溶液で1:1000に希釈します。次に、この抗体溶液を200 µL添加します。各ウェルに液を分注します。次に、プレートを37°Cで1時間インキュベートします。その後、超免疫血清を除去し、各ウェルを1 mLのXPBSで洗浄します。次に、二次抗体を用いてまったく同じ手順を繰り返します。プロトコルに従って20 mlの基質を調製し、容器に入れます。その後、各ウェルに200 µLの基質を添加します。次に、基質を除去して反応を停止させ、各ウェルに1 mlの蒸留水を加えます。その後、プレートから水を除去し、プレートを乾燥させます。それぞれの色の点はウイルスプラークを表しており、これらのプラークを数えることで、ホモジナイズした蚊の中腸に元々含まれていたウイルス粒子の数を推定できます。ここでは、aegypti蚊へのデングウイルス感染させる手順について説明しました。このプロトコルでは、蚊の細胞株を用いてウイルスを産生させます。次に、細胞株からウイルス粒子を精製・単離し、それらをヒト全血と混合して蚊に吸血させます。ウイルスが蚊に感染し、感染が成立した後、蚊の中腸組織を単離する方法と、この中腸の感染レベルを決定する方法について説明しました。基本的には中腸をホモジナイズし、この中腸からウイルス粒子を放出させる手順を用います。その後、これらのウイルス粒子を用いて再び蚊の細胞株に感染させ、中腸の感染レベル、すなわち蚊の中腸に感染したウイルス粒子の数を決定します。

protocol-for-dengue-infections-mosquitoes-aegypti-infection-phenotype

Research

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Biology

生物学

逆遺伝学的アプローチは、蚊のベクトルの病原体にどの遺伝子が基礎となる抵抗を決定するための非常に有用であることが証明されている。このビデオプロトコルは、デング熱ウイルスを抱いている女性A.ネッタイシマカ蚊、にdsRNAを注入するジェームズラボで使用される方法を示しています。...

女性A.ネッタイシマカのモスキートへのdsRNAの注射

遺伝子がマラリアのための潜在的に耐火として識別されると、それは蚊の中マラリア原虫の感染症の予防にその役割を評価する必要があります。このプロトコルは、蚊のマラリア原虫の感染の程度をアッセイする方法を示します。生殖母体の文化、膜の給餌蚊ヒト血液、及び蚊の中腸におけるウイルス力価を測定することを準備するための技術が実証されています。...

蚊と感染症の表現型決定における熱帯熱マラリア原虫の感染症のためのプロトコル

アルファウイルス形質導入システム：蚊で感染を可視化するためのツール

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黄熱病の蚊から血球を収集し、染色のためのプロトコルネッタイシマカ</em

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げっ歯類マラリア寄生虫の現象分析無性および性的血液段階と蚊の段階

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学ぶデングウイルス感染プロトコル。Aedes aegypti蚊にウイルスを感染させ、中腸と唾液腺のウイルス価を測定する方法です。遺伝子機能評価や感染症制御戦略の研究に活用できます。

デング熱蚊の感染症（A.ネッタイシマカ）と感染症の表現型決定のためのプロトコル

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