デング熱蚊の感染症（A.ネッタイシマカ）と感染症の表現型決定のためのプロトコル

私はジョージ・ディモプロスですが、それではアイーダスGTI蚊にデング熱ウイルスを感染させる手順をお見せします。そして、最初に行う必要があるのは、Aidas Aus細胞株でウイルスを増殖させることです。私の名前はホセ・ルイス・ラミレスで、OUSラボの博士課程の学生です。

この手順には、組織培養フード、摂氏37度に設定されたCO2インキュベーターを備えたBSL 2施設が必要です。50mlのプラスチック製円錐管が必要です。人間の血清、ウォーターバス、摂氏37度、遠心分離機が必要です。

96ウェルプレートとその他の標準的な分子生物学および生化学、試薬、消耗品が必要です。つまり、これはBSL 2施設での通常の組織培養フードであり、最初のステップは、75平方センチメートルのフラスコで80%coの流暢さに成長した細胞を取り出すことです。これは、10%の熱、熱、および活性化されたウシ胎児血清に1%L-グルタミンと非必須アミノ酸を補充したMEM培地です。

さて、次にデング熱ウイルスを細胞に追加します。マイナス80度の冷凍庫からウイルスストックを取り出し、37度のインキュベーターで解凍しました。約0.5ミリリットルのストックウイルスを細胞に加えることで、1細胞あたり約1.5個のウイルス粒子の濃度を達成しています。

次に、細胞をシェーカーに約15分間、ゆっくりと振とうします。次に、細胞をCO2インキュベーターに約45分間置く。摂氏37度では、CO2濃度は5%です45分間のインキュベーション後、細胞を取り出して30mlの培地を追加し、その後、細胞をインキュベーターに再度入れて、さらに5日間インキュベートします。

次に、ウイルスの粒子を感染に備えます。まず、スクレーパーで細胞をフラスコから取り外し、次にそれらを培地と一緒に50mlの円錐管に移す必要があります。現在、細胞を 12 、 000 RPM で 10 分間遠心分離して、ペレット化しています。

このボトルの底には、ペレットが見えます。次に、上清を取り除き、ウイルスを細胞から放出するために、細胞に1mlだけを残します。冷凍いたします。

これにより細胞が破裂し、その後、細胞を解凍してから再び凍結し、この手順を3〜4回繰り返して、ドライアイスで凍結します。凍結後、細胞ペレットを37度の水浴に置いて解凍し、各凍結ステップの間にドライアイで再度凍結し、WEPがボルテックスによって細胞を懸濁します。現在、上清を含むウイルスを採取し、ウイルス粒子も含まれている前の遠心分離の上清

このウイルス調製物は、等量の全ヒト血液および血清と組み合わせる準備が整いました。ここでは、ウイルス製剤を15%ヒト血清を添加した全ヒト血液と組み合わせました。この血液ウイルス溶液は、蚊に餌を与えて感染させるためにこれから使用されます。

この血液をメンブレンフィーダーに加え、このメンブレンフィーダーを蚊の入ったカップに置き、蚊にこの血液を約25分間食べさせます。メンブレンフィーダーを安定させるために、メンブレンフィーダーにクリップを取り付けました。基本的にネット上で重さを量りますので、これからフィーダーに血液を追加します。

場合によっては、蚊は自然に暗闇で餌を食べることが多いため、この実験は暗闇で行うとうまくいく場合があります。もちろん、これは蚊のコロニーがどのように調整されているかによります。蚊は今、約25〜30分間餌を食べており、メンブレンフィーダーを取り外して、除染のために安全な容器に入れることができます。

血液フィッティングの後、不適合な蚊はFRBの蚊から取り除く必要があります。これを行うには、血液を与えられた蚊の入った小さなカップを冷蔵室に5〜10分間置いて、蚊を倒しました。ご覧の通り、蚊はすでに寒さに負けています。

蓋を開けて小さなガソリン皿に移し、氷のバケツに置いておけば、蚊はずっと冷たく保たれ、逃げることができなくなります。これらは感染した蚊であるため、それらを緩めないように細心の注意を払う必要があることを忘れないでください。蚊が冷蔵室に落ちると、蚊は室温に保たれている通常のインセクターに移されますが、私たちは蚊を常にペトロ皿に入れ、氷のバケツに保管されているので、常にそこにいるので、常に落ち込んでいます。

FRBの蚊をUNFIの蚊からどのように取り除くことができるかを見ることができます。FRBの連中は、その中に血が流れている。彼らは完全に充血しています。

彼らの中には、完全に充血していないために部分的に血液を食べている人もいます。彼らは腹部に少量の血液を持っていますが、他の人は腹部に大量の血液を持っています。UNFIのものは腹部に血液がないので、FRBと不適格なものを簡単に区別できます。

そこで、これらの蚊をガソリン皿からワックスラインの段ボールカップに移します。次のステップは、蚊のデングウイルス感染を分析することです。蚊の中腸でのウイルス感染をアッセイしたい場合は、蚊が血液の食事を摂取してから約7日目に蚊を解剖する必要があります。

また、唾液腺のウイルス感染をアッセイしたい場合は、給血後約14日で蚊を解剖する必要がありますが、ホセは今、蚊から腸を解剖する方法をお見せします。蚊は氷の上で麻酔をかけられ、70%エタノールで約1分間インキュベーションして蚊を殺します。次に、蚊を2つの連続したウォーターバスに移します。

それぞれ1分ずつ。これは、蚊からエタノールを洗い流すためです。次に、顕微鏡のスライドでPBSの蚊を解剖します。

蚊から中腸を解剖する最良の方法は、蚊を逆さまにして翼に置き、一方の鉗子で腹部をつかみ、もう一方の鉗子で胸部をつかみ、次に蚊を引っ張ることです。今、ホセは蚊を引き離し、腸は蚊の腹部と胸部の間に現れます。さて、腸は蚊の上部に現れた半透明の組織です。

次に、解剖した腸を細胞株培地に移し、組織培養フードに運んで、腸からウイルス粒子を分離します。解剖した中腸を組織培養室に運び、ウイルス粒子を放出するために乳棒で均質化します。中腸の均質化後、ホモジネートに培地を添加して、ウイルス粒子を1〜100

次に、これをさらに1から10、1から101、1000に希釈し続けます。96ウェルプレートでは、24ウェルプレートでAlba picto細胞株を80%coの流暢さまで調製しました。次に、裂孔アルバピクト細胞からsup natantを取り出し、これらの細胞に希釈したウイルス粒子を添加して、各希釈中のウイルス粒子の濃度を決定します。

これにより、ウイルスの感染レベルを判断できます。次に、蚊の中腸で、細胞を室温で15分間ゆっくりと振とうします。次に、細胞を37°CO2インキュベーターに45分間置きます。

次に、1 mLの1%メチルセルロースオーバーレイを各ウェルに加え、プレートを再び37°CCO2インキュベーターで5日間インキュベートします。5日間のインキュベーション後、各ウェルに1mlのアセトンメタノール固定剤を加えます。次に、プレートを摂氏4度で冷蔵庫で1時間インキュベートします。

次に、固定剤を取り除き、PBSでそれぞれ1回ずつよく洗います。次に、抗デング熱一次抗体を5%血液溶液中で1〜1000希釈します。次に、この抗体溶液を200マイクロリットル加えます。

それぞれに、よく頭を動かします。感謝。次に、プレートを摂氏37度で1時間インキュベートします。次に、過免疫液を取り除き、1つのXPBSでそれぞれをよく洗います。

次に、二次抗体と全く同じ手順を繰り返します。プロトコルに従って20mlの基質を調製し、それを容器に加えます。次に、各ウェルに200マイクロリットルの基質を追加します。

次に、基質を除去して反応を停止し、各ウェルに1mlの蒸留水を加えます。次に、プレートから水を捨て、プレートを乾かします。各色のドットはウイルスのプラークを表しており、これらのプラークを数えることで、均質化した蚊の元の中腸に存在していたウイルス粒子の数を推定できます。

ちょうどあなたにaegypti蚊でデングウイルス感染を実行する方法の手順を示しました。このプロトコルには、蚊細胞株でのウイルスの産生が含まれます。次に、ウイルス粒子を細胞株から精製して単離し、ヒトの全血と混合して蚊に供給します。

ウイルスは蚊に感染し、感染が確立されたら、蚊の中腸組織を分離する方法と、この中腸の感染レベルを決定する方法を示しました。基本的には中腸を均質化し、この中腸からウイルス粒子を放出する手順を使用します。次に、このウイルス粒子を使用して蚊の細胞株に再度感染させ、中腸の感染レベル、つまり蚊の腸に感染したウイルス粒子の数を決定します。