Name: セプターのセルカウンターを用いて細胞培養中の細胞数の決定 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-11-26T18:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 33 s
Description: 学ぶセプターセルカウンターを用いた自動細胞計測法。インピーダンス検出で細胞径・容積を正確に測定し、ヒストグラムで解析可能。細胞培養の再現性と精度を向上させる低コストなハンディ型デバイスの使い方を解説します。

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1。細胞計数の重要性<ol><li>カウント細胞はin vitroでの細胞培養でのために必要ですが面倒なステップです。 </li><li>一貫性のある細胞濃度は、実験的な再現性と精度を確保する。 </li><li>細胞数は、その後の実験に、トランスフェクションまたは感染症のために細胞を播種し、セルベースアッセイの準備を、不死化または変形の評価、細胞の健康と増殖率を監視するために重要である。 </li><li>細胞計数のスピードと正確さの必要性にもかかわらず、、400研究者の71％は血球計算盤を使用して、カウント細胞を調査した。血球計算法は安価ですが、それは面倒で不正確なカウントで、その結果ユーザーのバイアスや誤用、対象となります。 </li><li>血球計算法の誤差の源は次のとおりサンプルの不均一な細胞分布、多すぎたり少なすぎたり、細胞のサンプルで、特定のセルが定義されている計数の領域内に収まるかどうかの主観的な意思決定、血球計数器の汚染、ユーザからユーザへの変化を、および血球計充填率の変化。 </li><li>手動の計数に関連付けられて退屈を軽減するために、研究者の29％が自動化された細胞計数装置を用いて細胞を数える。しかし、ほとんどの研究者のために、これらの大型ベンチトップ機器に関連付けられている価格は、それらの使用の障害となります。 </li><li>セプターの細胞計数は、比較的低コストでカウントコールターの自動化と精度を提供する自動化されたハンドヘルドデバイスです。 </li><li>システムは、センシング、信号処理、データストレージ、およびグラフィカルな表示、アナログとデジタルハードウェアの組み合わせを使用して小型化した形式でインピーダンスベースの粒子検出のコールター原理を採用しています。 </li><li>使い捨てのセンサーは、細胞の大きさとサブミクロンおよびサブピコリットルの分解能での細胞容積による差別を可能にする微細加工、細胞感知ゾーンに設計されています。 </li><li>精密液体処理チャンネルと電子機器で拡張された、セプターの細胞計数は、グラフィカルにヒストグラムとして細胞集団の統計情報が表示されます。 </li></ol> 2。カウントのための単一細胞懸濁液の調製<ol><li>セプターのセルカウンタを使用するには、細胞の単一の細胞懸濁液を希釈することにより開始する、リン酸塩で緩衝生理食塩水。 mL当たり10,000-500,000細胞の濃度が最適です。 </li><li> 1.5mlマイクロチューブに希釈した細胞100μLを移す。 </li></ol> 3。セプターを使用して実行するセルのカウント<ol><li>計器の背面にあるトグルを押し続けると、王笏のセルカウンタをオンにして、表示​​される画面上の指示を待ちます。 </li><li>プロンプトが表示されたら、機器の前面に向かって対向する電極センサーパネルでセプターユニットの端にセンサーを取り付けます。 </li><li>セプターのセンサーは、電子検出ゾーンと統合された細胞検知電極と、精密成形サンプリングチャンバーで構成されています。センサーにより、サブピコリットルの分解能でサブミクロンの解像度でセルサイズを区別し、細胞の体積になります。 </li><li>一貫性のあるセンサ技術は、同じサンプル量がカウントされると正確なサイズ測定が行われることを保証します。 </li><li>一度センサーが取り付けられている、次のように画面上の指示に従ってカウント処理の各ステップを実行します。 </li><li>画面が読み込むときに"開始するためにプランジャーを押しながら、"プランジャーを押し下げる。画面にはその後、"水没センサーを。"と表示されます細胞懸濁液にセンサーとセンサーに細胞懸濁液を吸引するためにプランジャーを離して水没。 </li><li>プランジ​​ャーは、電気信号​​として機能し、センサーにサンプルに加え、デッドボリュームが描画されます。それは、ピペッティングと同様プランジングのスピードや正確さは関係ありません。このプロセスには数秒かかります。準備ができたら、楽器音が鳴ります、および"ロードされたサンプルは、"画面に表示されます。 </li><li>サンプルをセンサーに読み込まれると、それは、マイクロチャネル通過し、細胞のサイズとセルの体積を評価するための感知ゾーンを通って描画されます。サンプル50μLがカウントされるとセンサーがカウントを停止するために楽器を伝えます。 </li><li>カウントが完了した後、測定器の画面は"完全なカウント。センサーを削除し、破棄してください。"と表示されますプロンプトに従い、センサーを取り外して廃棄します。 </li><li>楽器は、その画面上のセルの大きさや直径のヒストグラムだけでなく、mL当たりの細胞濃度が表示されます。 </li></ol> 4。データ解析<ol><li>カウントが完了するとヒストグラムが計器に表示された後、トグルボタンを押してゲートを適用します。 "自動ゲーティング"を選択するかのどちらかを自動的にヒストグラムプロファイルに基づいてゲートを設定する、または前回データからのゲートを使用するために"最後に使用してください"。 </li><li>に関係なく、選択の、ゲートが手動でデータを微調整するために移動することができます。左のゲートを選択してスクロールし、もう一度トグルボタンを押してください必要に応じてゲートを移動するggle。 </li><li>その後、右側のゲートを活性化し、右側のゲートを配置するトグルをスクロールするには、再度トグルを押してください。もう一度クリックすると、新しい細胞の濃度、平均細胞容積と直径が表示されます。 </li><li>トグルは、日付、時間、平均セルサイズ、および細胞の容積を意味する間、表示を切り替えるにはどちらの側に移動することができます。 </li><li>最大72ヒストグラムに楽器自体に格納することができます。パーソナルコンピュータへデータをアップロードするには、表示画面上にUSBケーブルをポート経由で測定器を取り付けます。 </li><li> PC上で、二重"接続"をクリックしてソフトウェアを起動するにはセプターのソフトウェアアプリケーションをクリックしてください。すべてのカウントは自動的にソフトに移植する。 </li><li>セプターのアプリケーションソフトウェアは、ボリュームまたは直径のいずれかで文化の人口分布を詳細にヒストグラムが表示されます。ダウンロードしたファイルは、生データが指定されたセルの直径またはセルのボリュームのビンに表示されるMicrosoft Excelでは、にエクスポートすることができます。 </li></ol> 5。代表的な結果<ol><li>ナインティーンの異なる細胞株をカウントし、理論的な出発濃度に調製したコールターカウンターを用いて決定された。これらの細胞懸濁液は、さらに理論的な細胞の濃度で細胞懸濁液を得るために希釈した。 </li><li>セプターの細胞計数は、細胞濃度を決定するために使用されていました。図1は、理論的な細胞濃度と一緒に5代表的な細胞株について測定された5希釈を示しています。 </li><li> R2の値によって示されるように直線性の高いは、そのセプターのカウントが広い線形動作範囲にわたって、テストされた細胞株のための信頼性の高い方法であるを示しています。 </li><li>セプターのカウントの全体的な相対精度は、セプターのカウントから得られたデータは、コールターのカウントから得られたカウントと比較されている図2に示されている。 </li><li>セプターの細胞数のログは、コールターのカウントのログに対してプロットし、テストしたすべての細胞株を越え、セプターの数はコールター数に一致する、を示しています。 </li><li> 19細胞株のカウントがZ2コールターカウンター、セプターのセルカウンター、Viのセルまたは無数のシステム、およびhemocytemeterなどの自動視覚ベースのカウンタを用いて行った。 </li><li>カウントは、サスペンションと同一の希釈液を開始し、同じセルを使用して、メーカーの指示に従って行った。図3に示す結果は、セプターで測定された細胞の濃度が密接に高い直線性を持つ理論的な細胞濃度に一致数えることを示している。 </li><li> ％の変動係数、またはCVは、それぞれのカウントシステムのための各細胞株のそれぞれの希釈を計算した。図4は、細胞濃度とカウント方法に関しては、19細胞株の平均％のCVを示す。 </li><li>動作範囲内で、セプターの細胞計数は小さく、標準偏差と変動の小さい平均係数を表示し、視覚ベースの血球計計数よりも正確です。 </li><li>セプターのカウントは10倍の血球計算法よりも速く、あまりにも他の自動化されたカウンタよりも高速です。図5、SF9、MCF7、およびHEK293細胞ではこのビデオで説明する方法を用いてカウントした。 </li><li>細胞濃度を測定するために必要な平均時間を記録した。血球計算法は、サンプルごとに一度だけ実行されたことに注意してください。 </li><li>セプターは、セルサイズに基づいて測定を行います。したがって、細胞形態の変更については、ヒストグラムに取り込むことができます。健全な文化は、不健康な細胞をしながら、素敵なベル形のガウス分布を表示し溶解、そして左にヒストグラム（図6、左パネル）のシフトを引き起こす。 </li><li>同様に、50％の死細胞の人口が50％、生細胞と混合した場合、ヒストグラムのシフトも（図6、右のパネル）が観察された。 </li></ol><img src="/files/ftp_upload/2204/2204fig1.jpg" alt="図1"><img src="/files/ftp_upload/2204/2204fig2.jpg" alt="図2"><img src="/files/ftp_upload/2204/2204fig3.jpg" alt="図3"><img src="/files/ftp_upload/2204/2204fig4.jpg" alt="図4"><img src="/files/ftp_upload/2204/2204fig5.jpg" alt="図5"><img src="/files/ftp_upload/2204/2204fig6.jpg" alt="図6"><img src="/files/ftp_upload/2204/2204fig7.jpg" alt="図7">

<ol><li>Barghshoon, S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBarghshoon%2C+S+%22Cell+Counting+Survey%22">Cell Counting Survey</a>. , Millipore. (2009).</li>
<li>Tucker, K. G., Chalder, S., al-Rubeai, M., Thomas, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+hybridoma+cell+number%2C+viability%2C+and+morphology+using+fully+automated+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Enzyme+Microb+Technol%22%5BJournal%5D)">Measurement of hybridoma cell number, viability, and morphology using fully automated image analysis.</a> Enzyme Microb Technol. 16 (1), 29-35 (1994).</li>
<li>Houwen, B. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHouwen%2C+B+%22Fifty+years+of+hematology+innovation%3A+the+Coulter+principle%22">Fifty years of hematology innovation: the Coulter principle</a>. , Medical Laboratory Observer. (2003).</li>
</ol>

キャスリーンOngena、C​​handreyeeダス、ジャネットL.スミス、ソニアギル、そしてグレースジョンストンは、この資料に使用される楽器を生成するミリポア、によって雇用されている。

他のカウントの方法からの結果にセプターのセルカウンタのパフォーマンスを比較すると、我々はこの新しい携帯、自動細胞計数器は、広い動作範囲にわたって正確に、速く、信頼性の高い細胞数を提供すると結論付けている。セプターのカウントの機能は、センサー先端部とコールター原理に基づく洗練されたカウントの計測に埋め込まれた精密エンジニアリング技術の結果です。パフォーマンスの質は速度を上げるとセルベースアッセイの再現性を向上させる方法としてカウントセプターを示唆している。ハンドヘルドの形式は、細胞培養のフードで迅速な退屈フリーカウント権利を許可します。

<table border="1"><tbody><tr><td> 材料名 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント </td></tr><tr><td> 40μmの王笏センサと笏2.0ハンドヘルド自動化セルカウンター</td><td> EMDミリポア</td><td> PHCC20040 </td><td></td></tr><tr><td> 60μmのセプターのセンサと笏2.0ハンドヘルド自動化セルカウンター</td><td> EMDミリポア</td><td> PHCC20060 </td><td></td></tr><tr><td>セプターセンサ、60μmの</td><td> EMDミリポア</td><td> PHCC60050 </td><td>センサーの50パック</td></tr><tr><td>セプターセンサ、40μmの</td><td> EMDミリポア</td><td> PHCC40050 </td><td>センサーの50パック</td></tr><tr><td>ユニバーサル電源アダプタ</td><td> EMDミリポア</td><td> PHCCPOWER </td><td> </td></tr><tr><td>笏O -リングキット</td><td> EMDミリポア</td><td> PHCCOCLIP </td><td> Oリング2個、一つのフィルターカバー</td></tr></tbody></table>

セプターのセルカウンターを用いて細胞培養中の細胞数の決定

Determining Cell Number During Cell Culture using the Scepter Cell Counter

細胞のカウントは、多くの場合、in vitroでの細胞培養のために必要であるが、退屈なステップです。一貫性のある細胞濃度は、実験的な再現性と精度を確保する。細胞数は、その後の実験に、トランスフェクションまたは感染症のために細胞を播種し、セルベースアッセイの準備を、不死化または変形の評価、細胞の健康と増殖率を監視するために重要である。細胞数は、特に細胞応答の定量的測定のために、、正確で一貫性のある、かつ早くなることが重要です。 細胞計数のスピードと正確さのためのこの必要性にもかかわらず、400の研究者の71％は血球計算盤を用いて細胞をカウント1を調査した。血球計算法は安価ですが、それは面倒で不正確なカウントで、その結果ユーザーのバイアスや誤用、対象となります。 Hemocytometersは、細胞懸濁液は、指定されたボリュームにロードされ、顕微鏡下でカウントされている特殊な光学ガラスで作られています。血球計算法の誤差の源は、次のとおりサンプルの不均一な細胞分布、多すぎたり少なすぎたり、細胞のサンプルで、特定のセルが定義されている計数の領域内に収まるかどうかの主観的な意思決定、血球計数器の汚染、ユーザからユーザへの変化を、および血球計充填率2の変化。 手動の計数に関連付けられて退屈を軽減するために、研究者の29％がデバイスを数える自動化された細胞を用いて細胞を数えるが、これらは視覚ベースのカウンタ、コールター原理を用いて細胞を検出するシステム、またはフローサイトメトリー1が含まれます。ほとんどの研究者のための、自動化システムを使用する主な障壁は、これらの大規模なベンチトップ測定器1に関連する価格です。 セプターの細胞計数は、比較的低コストでカウントコールターの自動化と精度を提供する自動化されたハンドヘルドデバイスです。システムは、コールターの検出のためにアナログとデジタルハードウェアの組み合わせを使用して小型化した形式のインピーダンスベースのパーティクルの検出3の原理、信号処理、データストレージ、およびグラフィカル表示を採用しています。使い捨てチップは、セルサイズとサブミクロンおよびサブピコリットルの分解能での細胞容積による差別を可能にする微細加工、細胞感知ゾーンに設計されています。精密液体処理チャンネルと電子機器で拡張された、セプターの細胞計数は、グラフィカルにヒストグラムとして表示される細胞集団の統計を報告します。

セプターのセルカウンターは、セルを数えるセルの直径とボリュームを監視し、一つの文化から次の細胞集団の健康と品質を確認するために使用するために使用できる携帯型自動化されたデバイスです。

細胞のカウントは、in vitroの細胞培養において必要ではあるものの、手間のかかる工程であることが多い。細胞濃度を一定に保つことは、実験の再現性を確保し、...

Scepter細胞カウンターは、細胞数のカウント、細胞径および体積のモニタリング、ならびに細胞集団の健康状態と品質の確認を行うためのハンドヘルド自動デバイスです。この装置は、精度の向上、操作の簡便さ、低コストでの細胞カウントなど、他の計数法に対して大きな利点があります。Scepterを使用し、グラフィカルディスプレイの指示に従って、使い捨てセンサーに細胞を吸引してください。その後、細胞をカウントし、装置が細胞濃度と統計結果を報告します。これらのデータはコンピュータにアップロードして解析することが可能です。こんにちは、Millportの研究員のSonyaです。今日はScepterの使い方について説明します。細胞計数装置 細胞の計数は、in vitro 細胞培養において必要不可欠ですが、手間のかかる工程です。一定の細胞濃度を維持することは、実験の再現性と正確性を確保するために不可欠です。迅速さと正確さが求められる一方で、細胞数などの計数は、細胞の健康状態や増殖速度のモニタリング、不死化細胞や形質転換細胞の評価、後続の実験に向けた播種細胞数の決定、トランスフェクションや感染、そして細胞ベースのアッセイの準備において重要です。細胞計数において、調査対象となった400人の研究者の71%がヘモサイトメーターを用いて細胞を計数しています。ヘモサイトメトリーは安価である一方、手間がかかり、ユーザーのバイアスや誤用が生じやすく、その結果、不正確な計数につながります。ヘモサイトメトリーにおける誤差の原因としては、サンプル内の細胞分布の不均一さ、サンプル中の細胞数の過多または過少などが挙げられます。特定の細胞が定義された計数領域内にあるかどうかの主観的な判断。ヘモサイトメーターの汚染、ユーザーによる操作のばらつき、およびヘモサイトメーターへの充填率の変動は、手動計数に伴う退屈な作業を軽減させる要因となります。研究者の29%が自動細胞計数装置を用いて細胞を計数しています。しかしながら、多くの研究者にとって、これらの大型ベンチトップ装置に伴う価格が導入の障壁となっています。Scepter cell counterは、自動化されたハンドヘルドデバイスであり、使いやすいハンドヘルド形式で、Coulter計数法と同等の自動化と精度を比較的低コストで提供します。このシステムは、インピーダンスに基づいた粒子検出というCoulter原理を採用しており、アナログおよびデジタルハードウェアを組み合わせて小型化することで、センシング信号処理、データ保存、およびグラフィカル表示を実現しています。この使い捨てセンサーは、マイクロファブリケーション技術による細胞検知ゾーンを備えており、精密な液体ハンドリングチャネルと電子回路によって強化され、サブミクロンおよびサブピコリットルの分解能で細胞サイズと細胞体積による識別が可能です。Scepter細胞カウンターは、細胞集団の統計をヒストグラムとして視覚的に表示します。Scepter細胞カウンターによる測定は、まずリン酸緩衝生理食塩水を用いて細胞の単一細胞懸濁液を希釈することから始めます。1 mLあたり10,000〜500,000個の細胞濃度が最適です。希釈した細胞液100 µLを1.5 mLマイクロビューチューブに移します。装置背面のトグルスイッチを長押ししてScepter細胞カウンターの電源を入れ、画面に指示が表示されるまで待ちます。指示に従い、電極センシングパネルを装置の前面に向けて、セプターユニットの先端にセンサーを取り付けます。セプターセンサーは、電子センシングゾーンと統合セルセンシング電極を備えた精密成形のサンプリングチャンバーで構成されています。これらのセンサーにより、サブミクロン分解能での細胞サイズの識別およびサブピコリットル分解能での細胞体積の識別が可能になります。一貫したセンサーエンジニアリングにより、等しいサンプル量のカウントと正確なサイズ測定が保証されます。センサーを取り付けたら、画面上の指示に従ってカウントプロセスの各ステップを次のように実行してください。画面に「プランジャーを押し下げて開始してください」と表示されたらプランジャーを押し下げます。次に画面に「センサーを浸してください」と表示されるので、センサーを細胞懸濁液に浸し、プランジャーを離して細胞懸濁液をセンサー内に吸引します。プランジャーは電気信号として機能し、サンプルとデッドボリュームをセンサー内に吸引します。ピペッティングとは異なり、プランジングの速度や精度は重要ではありません。準備が整うと、この工程には数秒かかります。装置からビープ音が鳴り、画面に「sample loaded」と表示されます。サンプルがセンサーにロードされると、センシングゾーンを通過し、細胞サイズと細胞体積が測定されます。その後、マイクロチャネルを通過し、50 µLのサンプルがカウントされると、センサーが装置にカウント停止の指示を出します。カウントが完了すると、装置の画面に「count complete」と表示されます。センサーを取り外して廃棄してください。画面の指示に従い、センサーを取り外して廃棄します。その後、装置の画面に細胞サイズまたは直径のヒストグラムと、1 mLあたりの細胞濃度が表示されます。カウントが完了し、装置にヒストグラムが表示されたら、トグルボタンを押してゲートを適用します。「auto gating」を選択してヒストグラムのプロファイルに基づいてゲートを自動的に設定するか、「use last」を選択して前回のカウントのゲートを使用します。どちらの選択肢を選んだ場合でも、ゲートを手動で移動させて微調整することが可能です。データを調整し、トグルボタンを再度押して左ゲートを選択し、トグルをスクロールしてゲートを任意の位置に移動させます。次に、もう一度トグルを押して右ゲートを有効にし、トグルをスクロールして右ゲートを配置します。最後に、再度クリックします。新しい細胞濃度、平均細胞容積および直径が表示されます。トグルスイッチを切り替えることで、表示を日付・時刻、平均細胞サイズ、または平均細胞容積に変更することができ、最大72個のヒストグラムを装置本体に保存可能です。データを個人用コンピュータにアップロードするには、USBケーブルポートで装置を接続し、PCのディスプレイ画面で操作してください。scepterソフトウェアアプリケーションをダブルクリックして起動します。次に、「connect」をクリックします。すべてのカウントが自動的にソフトウェアに転送されます。Scepterアプリケーションソフトウェアは、培養細胞の集団分布を体積または直径で詳細に示したヒストグラムを表示します。ダウンロードしたファイルはMicrosoft Excelにエクスポートでき、そこでは生データが指定された細胞直径または細胞体積のビン（階級）ごとに表示されます。19種類の異なる細胞株を計数用に調製し、細胞カウンターを用いて理論的な開始濃度を決定しました。これらの細胞懸濁液をさらに希釈し、理論上の細胞濃度の細胞懸濁液を得ました。その後、Scepter細胞カウンターを用いて細胞濃度を測定しました。この図は、5つの代表的な細胞株について測定した5つの希釈系列と、それぞれの理論上の細胞濃度を示しています。R2値（決定係数）に示される高い線形性は、scepterによるカウントが、テストした細胞株において広い線形動作範囲にわたり信頼性の高い手法であることを証明しています。scepterによるカウントの全体的な相対精度を検証するため、scepterで得られたデータとcoterによるカウント結果を比較しました。scepterによる細胞カウントの対数をcoterによるカウントの対数に対してプロットしたところ、テストしたすべての細胞株においてscepterのカウント値がcoterのカウント値と一致することが示されました。19種類の細胞株のカウントをZ two coulter counterを用いて行いました。Scepter cell counter、V cellやcount test systemなどの自動画像解析式カウンター、およびhemo TERを用いて、同一の細胞懸濁液および同一の希釈倍数を使用し、製造元の指示に従ってカウントを行いました。本図に示す結果は、Scepterによる計測で得られた細胞濃度が、高い直線性を持ち、理論的な細胞濃度と密接に一致することを示しています。各細胞株の各希釈段階について、変動係数（CV）のパーセント値を算出した。ここに示した各計数システムについて、動作範囲内における細胞濃度および計数方法に関する19種類の細胞株の平均CV（％）を記載している。Scepter細胞カウンターは、ヘモサイトメーターによる計数よりも精度が高く、標準偏差および平均変動係数がより小さい値を示している。Scepterによるカウントは、血球計数法よりも10倍速く、他の自動細胞カウンターよりも高速です。ここでは、本ビデオで説明した方法を用いて、SF9、MCF7、およびHC293細胞のカウントを行いました。細胞濃度を測定するのに要した平均時間を記録しました。血球計数はサンプルあたり1回のみ行われたことに注意してください。Scepterは細胞サイズに基づいて測定を行います。したがって、細胞形態の変化はヒストグラムに反映されます。健康な培養細胞はきれいなベル型のガウス分布を示しますが、不健康な細胞は死滅し、ヒストグラムを左側にシフトさせます。同様に、50%の死細胞と50%の生細胞の集団を混合した場合にも、ヒストグラムのシフトが観察されました。以上が、研究者の細胞計数方法に革新をもたらしているMillipore社の新しいScepter細胞カウンターの使用方法です。

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