セプターのセルカウンターを用いて細胞培養中の細胞数の決定

セプターセルカウンターは、細胞のカウント、細胞の直径と体積のモニタリング、細胞集団の健康状態と品質の確認を行うためのハンドヘルド自動装置です。これは、精度の向上、使いやすさ、細胞のカウントコストの低さなど、他のカウント方法に比べて大きな利点を提供します。セプターを使用して、グラフィカルディスプレイの指示に従って、細胞を使い捨てセンサーに吸引します。

その後、細胞がカウントされ、デバイスは細胞濃度と統計を報告し、それらをコンピューターにアップロードして分析できます。こんにちは、ソーニャです。私はここミルポートの研究員ですが、今日はセプターの使い方をお見せします。

セルカウンター 細胞のカウントは、in vitro細胞培養には必要ですが、面倒なステップです。細胞濃度が一定であるため、実験の再現性と精度が確保されます。細胞数は、細胞の健康状態と増殖速度のモニタリング、その後の実験、トランスフェクションまたは感染のための不死化細胞または形質転換細胞の播種評価、および速度と精度が必要な細胞ベースのアッセイの準備に重要です。

細胞カウントでは、400人の研究者のうち71%がヘモサイトメーターを使用して細胞をカウントしました。ヘモサイトメトリーは安価ですが、手間がかかり、ユーザーの偏見や誤用の影響を受けやすいため、カウントが不正確になります。ヘモサイトメトリーのエラーの原因には、サンプル中の細胞分布が不均一である、サンプル中の細胞が多すぎるまたは少なすぎるなどがあります。

特定のセルが定義されたカウントエリア内にあるかどうかに関する主観的な決定。ヘモサイトメーターの汚染、ユーザーの手作業によるカウントに関連する面倒な作業を軽減するための、ヘモサイトメーターの充填率の変動。29%の研究者が自動細胞計数装置を使用して細胞をカウントしています。

しかし、ほとんどの研究者にとって、これらの大型ベンチトップ機器に関連する価格は、その使用に対する障壁となっています。セプターセルカウンターは、使いやすいハンドヘルド形式で比較的低コストでコターカウントの自動化と精度を提供する自動ハンドヘルドデバイスです。このシステムは、アナログとデジタルのハードウェアを組み合わせて信号処理、データ保存、グラフィック表示を行い、インピーダンスベースの粒子検出のCoter原理を小型

使い捨てセンサーは、精密な液体処理チャネルと電子機器で強化されたサブミクロンおよびサブピコリットル分解能で細胞サイズと細胞体積による識別を可能にする微細加工された細胞センシングゾーンで設計されています。セプターセルカウンターは、使用するヒストグラムとして細胞集団統計をグラフィカルに表示します。セプターセルカウンターは、まず、細胞の単一細胞懸濁液をリン酸緩衝生理食塩水で希釈することから始まります。

ミリリットルあたり10, 000〜500, 000個の細胞の濃度が最適です。100マイクロリットルの希釈細胞を1.5ミリリットルのマイクロビューチューブに移します。装置の背面にあるトグルを押したままにしてセプターセルカウンターをオンにし、画面上の指示が表示されるのを待ちます。

プロンプトが表示されたら、電極検出パネルを機器の前面に向けて、セプターユニットの端にセンサーを取り付けます。Scepterセンサーは、電子センシングゾーンと統合されたセルセンシング電極を備えた精密成形サンプリングチャンバーで構成されています。このセンサーは、サブミクロンの分解能で細胞サイズを、サブピコリットルの分解能で細胞体積を識別できるようにします。

一貫したセンサーエンジニアリングにより、等しいサンプル量がカウントされ、正確なサイズ測定が行われます。センサーを取り付けたら、次のように画面の指示に従ってカウントプロセスの各ステップを実行します。画面が読み取ったら、プランジャーを押し続けると、プランジャーを押し始めると、画面はセンサーを水没させ、センサーをセル懸濁液に沈め、プランジャーを解放してセル懸濁液をセンサーに吸引します。

プランジャーは電気信号として機能し、サンプルとデッドボリュームをセンサーに引き込みます。プランジの速度や精度は、ピペッティングの場合のようには関係ありません。このプロセスは、準備ができてから数秒かかります。

機器がビープ音を鳴らし、サンプルがロードされたファイルが画面に表示されます。サンプルがセンサーにロードされると、検出ゾーンに引き込まれ、セルサイズとセルボリュームが評価されます。次に、マイクロチャネルを介して、50マイクロリットルのサンプルがカウントされると、センサーは機器にカウントを停止するように指示します。

カウントが完了すると、機器画面にカウント完了と表示されます。センサーを取り外して廃棄してください。プロンプトに従って、センサーを取り外して廃棄します。

その後、装置は、セルサイズまたは直径のヒストグラムを画面に表示し、ミリリットルあたりの細胞濃度も表示します。カウントが完了し、ヒストグラムが機器に表示されたら、トグルボタンを押してゲートを適用するか、自動ゲートを選択するか、最後に使用してヒストグラムプロファイルに基づいてゲートを自動的に設定するか、前のカウントのゲートを使用します。選択に関係なく、ゲートを手動で細かく移動できます。

データを調整し、トグルボタンをもう一度押して左のゲートを選択し、トグルをスクロールして必要に応じてゲートを移動します。次に、トグルをもう一度押して右ゲートをアクティブにし、トグルをスクロールして右ゲートを配置します。もう一度クリックします。

新しい細胞濃度、平均細胞量、および直径が表示されます。トグルは、日付、時刻、平均セルサイズ、および平均セルボリュームの表示を切り替えるために、どちらの側にもすることができ、最大72ヒストグラムを機器自体に保存できます。データをパソコンにアップロードするには、PCのディスプレイ画面にあるUSBケーブルポートを介して機器を接続します。

セプターソフトウェアアプリケーションをダブルクリックして、ソフトウェアを起動します。次に、[接続]をクリックします。すべてのカウントは自動的にソフトウェアに移植されます。

セプターアプリケーションソフトウェアは、培養物の集団分布を体積または直径で詳述したヒストグラムを表示します。ダウンロードしたファイルはMicrosoft Excelにエクスポートでき、生データは指定されたセル直径またはセルボリュームのビンに表示されます。19種類の細胞株を計数用に調製し、理論上の開始濃度をアカルターカウンターを用いて決定しました。

次に、これらの細胞懸濁液をさらに希釈して、理論上の細胞濃度の細胞懸濁液を得ました。次に、セプターセルカウンターを使用して細胞濃度を決定しました。この図は、5つの代表的な細胞株について測定された5つの希釈度と理論上の細胞濃度を示しています。

r二乗値で示される高い線形性は、セプターカウントが広い線形操作範囲にわたって試験された細胞株にとって信頼できる方法であることを示しています。ここでは、セプターカウントから得られたデータとコプターカウントから得られたカウントを比較することで、セプターカウントの全体的な相対精度を示しています。セプター細胞数の対数は、コターカウントの対数に対してプロットされ、試験されたすべての細胞株でセプターカウントがコターカウントと一致することを示しています。

19の細胞株のカウントは、Z 2コールターカウンターを使用して行いました。セプターセルカウンター、V細胞やカウントテストシステムなどの自動視覚ベースのカウンター、およびヘモTERカウントは、同じ細胞開始懸濁液および同一の希釈液を使用して、製造元の指示に従って実施した。この図に示す結果は、セプターカウンティングによって測定された細胞濃度が、高い直線性を持つ理論上の細胞濃度と密接に一致することを示しています。

変動係数(CV)は、各細胞株の希釈ごとに計算しました。ここに示されている各計数システムは、操作範囲内の細胞濃度および計数方法に対する19の細胞株の平均CVS率です。セプターセルカウンターは、ヘモサイトメーターのカウントよりも精度が高く、標準偏差が小さく、平均変動係数が小さくなります。

セプターカウントは、ヘモサイトメトリーよりも10倍速く、他の自動カウンターよりも高速です。ここでは、SF nine、MCF seven、HC 2 93細胞を、このビデオで説明されている方法を使用してカウントしました。細胞濃度の測定に必要な平均時間を記録しました。

ヘモサイトメトリーはサンプルごとに1回だけ実施されたことに注意してください。Scepterは、セルサイズに基づいて測定を行います。したがって、細胞形態の変化をヒストグラムで捉えることができます。

健康な培養物はベル型のガウス分布を示しますが、健康な細胞はシラミになり、ヒストグラムが左にシフトします。同様に、50%の死細胞の集団を50%の生細胞と混合した場合も、ヒストグラムのシフトが観察されました。私はちょうどあなたが彼らの細胞を数える方法に革命をもたらしているミリポアのための新しいセプターセルカウンターの使い方をあなたに示しました。