モスキート子育てのためのプロトコル（A. gambiae）

私はシシュです。ジョンズ・ホプキンス公衆衛生大学院のGeorge OU博士の研究室でポストドクターを務めています。分子微生物学・免疫学教室において、蚊の An. gambiae の飼育方法について説明します。研究室では、通常 27 °C、湿度 80% に維持されている昆虫飼育室で飼育しています。

昆虫飼育室は、自然環境を模倣するため、12時間の明暗サイクルで管理されています。ここが、本施設のコアファシリティである昆虫飼育室で、ここで昆虫の維持管理を行っています。ご覧のように、ここには蚊の卵、幼虫の各ステージ、および蛹など、あらゆる段階の蚊が入ったさまざまなトレイが置かれています。

これらのトレイには、11日または12日目の幼虫が入っています。そして、こちらは成蚊を回収し、10% sucrose溶液で維持するためのケージです。蚊の飼育を開始するには、蚊に吸血させる必要があります。なぜなら、蚊が産卵するためには血液中のタンパク質が必要だからです。したがって、1日目は成蚊をケージに回収し、10% sucroseで維持した後の状態から始まります。

1日目は蚊に血液を摂取させます。そのため、人工膜を用いた吸血法を行います。これは蚊の膜吸血に使用するガラス製フィーダーです。こちらに見える小さな穴から血液を注入し、内部に保持させます。

底部側面には2つのノズルがあり、これらは37°Cに維持されたウォーターバスに接続されています。血液を37°Cに保つため、またフィーダーを給餌の準備に整えるため、少量のペリル（peril）を用意します。これを両端および四方から引き伸ばし、ガラスフィーダーの開放側に装着して、皮膚を模した薄い膜状のシートを作成します。

これは膜給餌法と呼ばれる手法です。これは循環式恒温槽であり、水温を37°Cに維持し、さらにガラスフィーダー内に水を循環させることで、血液を37°Cに温めて保持します。ガラスフィーダーを細いキャピラリーで循環式恒温槽に接続し、恒温槽の電源を入れることで水が循環します。水と血液は別々のチャンバーに入っているため、混ざり合うことはありません。

これは成体のPhis Gambi蚊が入ったケージです。こちらは循環恒温槽に接続されたガラスフィーダーで、ケージの上部にクランプを取り付け、200 µLの血液を加えます。ケージ内には雄と雌の両方の蚊が入っています。

吸血にやってくるのは雌のみです。吸血は約30分間行われます。吸血の2日後、蚊が産卵できるように、ケージ内に産卵カップを設置しました。

手順は以下の通りです。まず、少量の蒸留水を部分的に満たした小さなビーカーを用意します。次に、ろ紙を適量取り、それを円錐形に丸めて、蒸留水が入ったビーカーの中に入れます。この際、ろ紙が十分に濡れるようにしてください。その後、蚊が外に出ないよう注意しながら蚊のケージをゆっくりと開き、卵採取カップを中に入れます。

カップをケージに入れた翌日、すなわち4日目に、それらをゆっくりとケージから取り出します。ここに卵がありますが、黒い部分には死んだ蚊も混ざっています。卵の準備ができたら、プラスチックトレイの上に載せます。

あらかじめ、プラスチックトレーに蒸留水を満たしておきます。卵が付いたフィルターペーパーを取り出して、トレーに入れます。さらに、粉末状の魚用飼料である餌Aを少 amount 加え、トレーをラックに設置します。

トレイを開始する日に、トレイを水平にする必要があります。また、ここで使用している種についても確認します。これは、卵をトレイに入れた翌日の操作です。つまり、これらは1日齢ですが、実際のプロトコルでは蚊の5日目にあたります。

これらの黒いものが卵で、間もなく幼虫へと孵化します。そして、これらが蚊の餌です。蚊の飼育には、通常3種類の異なる餌を使用します。

食品Aは粉末状の魚類用飼料であり、蚊の培養を開始するX段階の時点でこれを添加します。毎日、食品C（Purina社製のキャットフード）を2タブレット添加します。8〜9日後、トレイの水を交換して新しい水を補充します。その際、食品Aの代わりに、食品Cを粉砕したものである食品Bをひとつまみ添加し、さらに食品Cを2タブレット添加して、卵から幼虫へと孵化させます。

幼虫には3つの異なる段階があります。1段階目、2段階目、そして3段階目です。これらは、生後5日または6日の幼虫が入ったトレーです。

これらは、9〜10日齢というかなり後期の段階にあるRaviです。その間に水換えを行い、新しい水と餌を補充しました。このトレイには、成体とppeの両方が入っています。

ご覧のように、これらが蚊帳の下を飛んでいる成虫です。そして端の方には、成虫へと羽化する濃色の蛹が見えます。成虫になれば、このようなケージに回収する準備が整ったことになります。

内部にはペーパータオルのライニングがあり、蚊の餌となる10%super solutionを入れた小型ボトルと、石鹸を浸した綿を入れた容器が設置されています。次に蓋で密閉します。こちらはアスピレーターという装置で、真空ポンプに接続されており、これを用いてトレイから成虫を回収します。アスピレーターのこの部分は、こちらと反対側に接続されています。

真空ポンプに接続します。ケージを設置し、成虫をこの小さなボックスに回収します。これはアスピレーターの別の部品で、長いチューブが付いており、これを蚊のトレイの中に入れます。

反対側をケージに接続します。真空が適切に機能するよう、すべてがしっかりと密閉されていることを確認してください。蓋を閉め、完全に密閉されていることを確認します。

バックエンドをゆっくりと起動させます。セットアップが完了したら、蚊が逃げ出さないようネットをしっかり閉じた状態で、この長いパイプを蚊のトレイの中にゆっくりと挿入します。このように、蚊が小さなケージの中に回収されていくのがわかります。

パイプをゆっくりと全体に動かし、すべての成虫を回収します。これでほぼ完了です。すべての成虫が回収され、こちらのケージに入ったことが確認できます。

その後、ゆっくりと真空を解除し、回収装置を外します。こちらが成体のアナガムビ（An. gambiae）であり、数日間このケージ内で飼育します。10% sucroseを給餌し、産卵が必要なタイミングで血液を吸血させます。

蚊の飼育方法について説明しました。実験室条件下での蚊の飼育における重要な手順は、まず血液を提供することです。次に卵カップを設置し、卵の発生を追跡します。その後、幼虫、蛹、そして成虫という異なる段階を経て成長します。

最後に、成虫を回収します。この手法の重要な点は、自然界の外環境を模倣することで、健康な蚊を確保することにあります。その後、それらに plasmodium を感染させ、マラリアに関するさまざまな研究を行います。その主目的は、世界からマラリアを根絶することです。