Name: モスキート子育てのためのプロトコル（A. gambiae） (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-07-04T01:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 3 s
Description: 学ぶAnopheles gambiaeの飼育法。27度、80%湿度、12時間明暗サイクルで管理し、血液給養から成虫採集までの全段階を解説。マラリア媒介蚊研究に必須の実験室技術です。

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モスキート食べ物： <ol><li>食べ物：接地された魚の餌（Aquaricare）。小さいピンチを追加する必要があります。 </li><li>食べ物B：接地CATフード（ピュリナ）。小さいピンチを追加する必要があります。 </li><li>食品C：猫フード（ピュリナ）。 2錠を追加する必要があります。 </li></ol>ブラッド： 動物またはヒトの血液は、背面蚊に使用することができます。新鮮な血液が注射器で採取し、血液の各10 mlのCPD（抗凝固）の1mlを含む滅菌15ミリリットルファルコンチューブに入れ、その後穏やかに混合し、5分間2000rpmで、室温で遠心分離する。上清を他の血液細胞（例えばWBC）を含むバフィーコートを除去するために世話をして、破棄されます。 RBCペレットをピペッティングによりRPMI培地の等量に懸濁し、そしてさらにこの培地で3回洗浄する。最終洗浄後、ペレット化赤血球はRPMI培地の等量に再懸濁させ、4℃（8-10日間保持することができます）で保存。ちょうど授乳する前に、RBCは（RPMIで）セルダウンペレットに（5分間2000rpmで）遠心分離され、パックされたRBCは40％のヘマトクリットを取得するために血清（O +ヒト血清）中に再懸濁されている。血液を37℃で常に送りのために保持されている必要があります。 1日目： <ol><li> 3〜5日齢成体メスの蚊が卵を産むために血を供給されています。 </li><li>吸血のために、人工膜（パラフィルム）給電方式は、以下のように使用されます。 <ol><li>赤血球は（血液の準備については上記を参照）〜40％のヘマトクリット（パックされたRBC 40〜60％の血清）を取得するために血清不活化熱と混合されています。これは、ガラスのフィーダに追加されます。 </li><li>フィーダは、暖かい水ジャケット（37℃）に接続され、膜表面への蚊のアクセスを許可するようにケージに配置されます。 </li><li>蚊が〜30分間供給することが許可されています。 </li></ol></li></ol> 3日目： <ol><li>女性は二日、彼らが血を餌後に卵を産むでしょう。円錐形に包まれた小さなろ紙は、ろ紙​​が湿った得ることを確認して、蒸留水を含む小さなビーカーに入れられます。ビーカーは、産卵のた​​めに蚊の一晩ケージの内部に保持されます。 </li></ol> 4日目： <ol><li>蚊の卵を含む濾紙〜300 mlの蒸留水をプラスチックトレイに配置されます。食品のピンチをトレイに追加され、卵は、次の日の間に幼虫に孵化するために許可されています。 </li></ol>デイズ5 - 8： <ol><li>成長する幼虫は食品Cの2つの錠剤で毎日供給し、密度と人口のために監視されます。八日目（5日齢幼虫）で、幼虫の人口は、各トレイ内の食品の食品Cのと2つの錠剤をのピンチで、1トレーから〜10トレーに希釈される。 （〜30分） </li></ol> DAYS 9〜12： <ol><li>幼虫は12日目（9日齢幼虫）の食品Cに毎日供給され、水は新鮮な水で変更されており、食品は（食品Bと食物Cの2つの錠剤のピンチ）が追加されます。蛹はこの段階で開発を開始します。トレイは、大人のエスケープを避けるために、ネットで覆われている。 （〜80〜10分） </li></ol> 13日目 - 15： 3日間 - サナギは、次の2の成人に現れるが許可されています。食品は、慎重に大人のエスケープを避けるためにネットを除去することによって幼虫/蛹に毎日与えられます。 16日目： <ol><li>大人の真空に接続して吸引器を介してケージに収集されます。ケージには、10％ショ糖（オートクレーブ）やケージの処理中に発生する可能性のある潜在的な砂糖の流出を浸して底部にペーパータオルのライニングに浸したさ綿の芯を持つ小さな100mlのボトルで構成されています。 （〜30〜40分） </li></ol> 17日目 - 21： <ol><li>大人（男性と女性の両方）、彼らは次のサイクルを開始するために再び血液に供給される前に、10％ショ糖を与えた、4-5日のための昆虫館室に保管されています。同じ蚊が複数回産卵するために使用することができます。 </li><li>実験や飼育に必要されていない蚊は、冷凍庫にケージを置くことによって殺すことができます。使用されるトレーやケージは、それらが再び使用する前に洗浄し、乾燥する必要があります。 </li></ol> 注 ：蚊飼育法と異なるラボで多少のバラツキができる各種の方法があるかもしれません。

<ol><li>Bangs, M. J., Soelarto, T., Barodji,, Wicaksana, B. P., Boewono, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colonization+of+Anopheles+maculatus+from+Central+Java%2C+Indonesia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Mosq+Control+Assoc%22%5BJournal%5D)">Colonization of Anopheles maculatus from Central Java, Indonesia.</a> J Am Mosq Control Assoc. 18, 359-363 (2002).</li>
<li>Beier, M. S., Beier, J. C., Merdan, A. A., el Sawaf, B. M., Kadder, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laboratory+rearing+techniques+and+adult+life+table+parameters+for+Anopheles+sergentii+from+Egypt%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Mosq+Control+Assoc%22%5BJournal%5D)">Laboratory rearing techniques and adult life table parameters for Anopheles sergentii from Egypt.</a> J Am Mosq Control Assoc. 266, 266-270 (1987).</li>
<li>Benedict, M. Q. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBenedict%2C+MQ+%22Care+and+maintenance+of+anopheline+mosquitoes%2C+The+molecular+biology+of+disease+vectors%3A+A+methods+manual%22">Care and maintenance of anopheline mosquitoes, The molecular biology of disease vectors: A methods manual</a>. Crampton, J. M., Beard, C. B., Louis, C. , Champman & Hall. London. 3-12 (1997).</li>
<li>Casanges, A. H., Mcgovran, E. R., Chiles, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rearing+of+Anopheles+quadrimaculatus+Say+and+Aedes+aegypti+%28L.%29+in+the+laboratory%5BTitle%5D)+AND+%22Mosq+News%22%5BJournal%5D)">Rearing of Anopheles quadrimaculatus Say and Aedes aegypti (L.) in the laboratory.</a> Mosq News. 9, 112-117 (1949).</li>
<li>Merritt, R. W., Dadd, R. H., Walker, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feeding+behavior%2C+natural+food+and+nutritional+relation+ships+of+larval+mosquitoes%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Rev.+Entomol%22%5BJournal%5D)">Feeding behavior, natural food and nutritional relation ships of larval mosquitoes.</a> Annual Rev. Entomol. 37, 349-376 (1992).</li>
<li>Nasirian, H., Ladonni, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Artificial+bloodfeeding+of+Anopheles+stephensi+on+a+membrane+apparatus+with+human+whole+blood%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Mosq+Control+Assoc%22%5BJournal%5D)">Artificial bloodfeeding of Anopheles stephensi on a membrane apparatus with human whole blood.</a> J Am Mosq Control Assoc. 22, 54-56 (2006).</li>
<li>Ng'habi, K. R., John, B., Nkwengulila, G., Knols, B. G., Killeen, G. F., Ferguson, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+larval+crowding+on+mating+competitiveness+of+Anopheles+gambiae+mosquitoes%5BTitle%5D)+AND+%22Malar+J%22%5BJournal%5D)">Effect of larval crowding on mating competitiveness of Anopheles gambiae mosquitoes.</a> Malar J. 30 (4), 49(2005).</li>
<li>Stobart, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+affecting+the+control+of+body+volume+in+the+larvae+of+the+mosquitoes+Aedes+aegypti+and+Aedes+detritus%5BTitle%5D)+AND+%22Edw.+J.+Exp.+Boil%22%5BJournal%5D)">Factors affecting the control of body volume in the larvae of the mosquitoes Aedes aegypti and Aedes detritus.</a> Edw. J. Exp. Boil. 54, 67-82 (1971).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>餌A</td><td></td><td>Aquaricare</td><td></td><td>粉砕した魚用餌。少量を加える必要がある。</td></tr><tr><td>餌B</td><td></td><td>Purina</td><td></td><td>粉砕したキャットフード。少量を加える必要がある。</td></tr><tr><td>餌C</td><td></td><td>Purina</td><td></td><td>キャットフード。2錠を加える必要がある。</td></tr><tr><td>RBC</td><td></td><td></td><td></td><td>調製赤血球：ヒト血清中ヘマトクリット値40%</td></tr><tr><td>RPMI</td><td>培地</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CPD</td><td></td><td></td><td></td><td>抗凝固剤</td></tr><tr><td>血清</td><td></td><td></td><td></td><td>O+型ヒト血清</td></tr><tr><td>蚊用フィーダー</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>パラフィルム</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anopheles gambiae</td><td></td><td></td><td></td><td>蚊</td></tr><tr><td>10% sucrose</td><td></td><td></td><td></td><td>蚊用餌</td></tr><tr><td>昆虫飼育室</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

モスキート子育てのためのプロトコル（a. gambiae）

Protocol for Mosquito Rearing (A. gambiae)

このプロトコルは、昆虫館での蚊の飼育について説明します。昆虫館のお部屋は12時間で、℃、〜80％湿度28で保持されます。昼/夜サイクル。この手順では、蚊のケージ10％滅菌ショ糖溶液、ペーパータオル、ビーカー、ワットマン濾紙、ガラスフィーダー、ヒトの血液や血清、水浴、パラフィルム、蒸留水、きれいなプラスチックトレイ、蚊の食べ物を（説明​​する必要があります以下）、成人を収集するトレー、真空、及び収集チャンバーをカバーするために蚊帳。

このビデオでは、実験室で背面ハマダラカに使用される一般的なテクニックを示しています。実験室での蚊の世話をするための方法は、吸血性の成人に蛹に幼虫から生物のライフサイクルの全段階を経て実証されています。

モスキート子育てのためのプロトコル（A. gambiae）

本プロトコルでは、昆虫飼育室における蚊の飼育について記述する。飼育室は温度28°C、湿度約80%、12時間の明暗サイクルで維持されており...

私はシシュです。ジョンズ・ホプキンス公衆衛生大学院のGeorge OU博士の研究室でポストドクターを務めています。分子微生物学・免疫学教室において、蚊の An. gambiae の飼育方法について説明します。研究室では、通常 27 °C、湿度 80% に維持されている昆虫飼育室で飼育しています。昆虫飼育室は、自然環境を模倣するため、12時間の明暗サイクルで管理されています。ここが、本施設のコアファシリティである昆虫飼育室で、ここで昆虫の維持管理を行っています。ご覧のように、ここには蚊の卵、幼虫の各ステージ、および蛹など、あらゆる段階の蚊が入ったさまざまなトレイが置かれています。これらのトレイには、11日または12日目の幼虫が入っています。そして、こちらは成蚊を回収し、10% sucrose溶液で維持するためのケージです。蚊の飼育を開始するには、蚊に吸血させる必要があります。なぜなら、蚊が産卵するためには血液中のタンパク質が必要だからです。したがって、1日目は成蚊をケージに回収し、10% sucroseで維持した後の状態から始まります。1日目は蚊に血液を摂取させます。そのため、人工膜を用いた吸血法を行います。これは蚊の膜吸血に使用するガラス製フィーダーです。こちらに見える小さな穴から血液を注入し、内部に保持させます。底部側面には2つのノズルがあり、これらは37°Cに維持されたウォーターバスに接続されています。血液を37°Cに保つため、またフィーダーを給餌の準備に整えるため、少量のペリル（peril）を用意します。これを両端および四方から引き伸ばし、ガラスフィーダーの開放側に装着して、皮膚を模した薄い膜状のシートを作成します。これは膜給餌法と呼ばれる手法です。これは循環式恒温槽であり、水温を37°Cに維持し、さらにガラスフィーダー内に水を循環させることで、血液を37°Cに温めて保持します。ガラスフィーダーを細いキャピラリーで循環式恒温槽に接続し、恒温槽の電源を入れることで水が循環します。水と血液は別々のチャンバーに入っているため、混ざり合うことはありません。これは成体のPhis Gambi蚊が入ったケージです。こちらは循環恒温槽に接続されたガラスフィーダーで、ケージの上部にクランプを取り付け、200 µLの血液を加えます。ケージ内には雄と雌の両方の蚊が入っています。吸血にやってくるのは雌のみです。吸血は約30分間行われます。吸血の2日後、蚊が産卵できるように、ケージ内に産卵カップを設置しました。手順は以下の通りです。まず、少量の蒸留水を部分的に満たした小さなビーカーを用意します。次に、ろ紙を適量取り、それを円錐形に丸めて、蒸留水が入ったビーカーの中に入れます。この際、ろ紙が十分に濡れるようにしてください。その後、蚊が外に出ないよう注意しながら蚊のケージをゆっくりと開き、卵採取カップを中に入れます。カップをケージに入れた翌日、すなわち4日目に、それらをゆっくりとケージから取り出します。ここに卵がありますが、黒い部分には死んだ蚊も混ざっています。卵の準備ができたら、プラスチックトレイの上に載せます。あらかじめ、プラスチックトレーに蒸留水を満たしておきます。卵が付いたフィルターペーパーを取り出して、トレーに入れます。さらに、粉末状の魚用飼料である餌Aを少 amount 加え、トレーをラックに設置します。トレイを開始する日に、トレイを水平にする必要があります。また、ここで使用している種についても確認します。これは、卵をトレイに入れた翌日の操作です。つまり、これらは1日齢ですが、実際のプロトコルでは蚊の5日目にあたります。これらの黒いものが卵で、間もなく幼虫へと孵化します。そして、これらが蚊の餌です。蚊の飼育には、通常3種類の異なる餌を使用します。食品Aは粉末状の魚類用飼料であり、蚊の培養を開始するX段階の時点でこれを添加します。毎日、食品C（Purina社製のキャットフード）を2タブレット添加します。8〜9日後、トレイの水を交換して新しい水を補充します。その際、食品Aの代わりに、食品Cを粉砕したものである食品Bをひとつまみ添加し、さらに食品Cを2タブレット添加して、卵から幼虫へと孵化させます。幼虫には3つの異なる段階があります。1段階目、2段階目、そして3段階目です。これらは、生後5日または6日の幼虫が入ったトレーです。これらは、9〜10日齢というかなり後期の段階にあるRaviです。その間に水換えを行い、新しい水と餌を補充しました。このトレイには、成体とppeの両方が入っています。ご覧のように、これらが蚊帳の下を飛んでいる成虫です。そして端の方には、成虫へと羽化する濃色の蛹が見えます。成虫になれば、このようなケージに回収する準備が整ったことになります。内部にはペーパータオルのライニングがあり、蚊の餌となる10%super solutionを入れた小型ボトルと、石鹸を浸した綿を入れた容器が設置されています。次に蓋で密閉します。こちらはアスピレーターという装置で、真空ポンプに接続されており、これを用いてトレイから成虫を回収します。アスピレーターのこの部分は、こちらと反対側に接続されています。真空ポンプに接続します。ケージを設置し、成虫をこの小さなボックスに回収します。これはアスピレーターの別の部品で、長いチューブが付いており、これを蚊のトレイの中に入れます。反対側をケージに接続します。真空が適切に機能するよう、すべてがしっかりと密閉されていることを確認してください。蓋を閉め、完全に密閉されていることを確認します。バックエンドをゆっくりと起動させます。セットアップが完了したら、蚊が逃げ出さないようネットをしっかり閉じた状態で、この長いパイプを蚊のトレイの中にゆっくりと挿入します。このように、蚊が小さなケージの中に回収されていくのがわかります。パイプをゆっくりと全体に動かし、すべての成虫を回収します。これでほぼ完了です。すべての成虫が回収され、こちらのケージに入ったことが確認できます。その後、ゆっくりと真空を解除し、回収装置を外します。こちらが成体のアナガムビ（An. gambiae）であり、数日間このケージ内で飼育します。10% sucroseを給餌し、産卵が必要なタイミングで血液を吸血させます。蚊の飼育方法について説明しました。実験室条件下での蚊の飼育における重要な手順は、まず血液を提供することです。次に卵カップを設置し、卵の発生を追跡します。その後、幼虫、蛹、そして成虫という異なる段階を経て成長します。最後に、成虫を回収します。この手法の重要な点は、自然界の外環境を模倣することで、健康な蚊を確保することにあります。その後、それらに plasmodium を感染させ、マラリアに関するさまざまな研究を行います。その主目的は、世界からマラリアを根絶することです。

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

遺伝子がマラリアのための潜在的に耐火として識別されると、それは蚊の中マラリア原虫の感染症の予防にその役割を評価する必要があります。このプロトコルは、蚊のマラリア原虫の感染の程度をアッセイする方法を示します。生殖母体の文化、膜の給餌蚊ヒト血液、及び蚊の中腸におけるウイルス力価を測定することを準備するための技術が実証されています。...

蚊と感染症の表現型決定における熱帯熱マラリア原虫の感染症のためのプロトコル

逆遺伝学的アプローチは、蚊のベクトルの病原体にどの遺伝子が基礎となる抵抗を決定するための非常に有用であることが証明されている。このビデオプロトコルは、マラリア原虫を抱いているハマダラカ蚊、にdsRNAを注入するDimopoulosラボで使用される方法を示しています。インジェクションのセットアップを操作し、胸部にdsRNAを注入する手法が示されている。...

成虫（A. gambiae）におけるRNAiのアッセイのためのプロトコル

げっ歯類のマラリア原虫の遺伝学的交配は蚊に2つの遺伝的に異なる寄生虫を供給することによって実行されます。組換え子孫は、蚊が感染したマウスを噛まないようにできるようにした後、マウスの血液からクローン化されています。このビデオでは、遺伝的交雑を生成する方法を示しています。...

げっ歯類のマラリア原虫の遺伝的交雑の生産のためのプロトコル

RNA-Seq解析は、非モデル生物の適応形質の分子基盤を特定するためにますます重要になってきています。ここでは、蚊の飼育からRNAシーケンシング、RNA-Seqデータのバイオインフォマティクス解析まで、休眠時と非休眠型のAedes...

アジアのタイガーモスキートにおける日長休眠のRNA-seqの分析のための実験とバイオインフォマティクス·プロトコル、ヒトスジシマカ

ビーズの接種を通じて、記載されている技術は、血リンパ循環系における蚊のメラニン化反応の刺激を可能にします。ビーズを覆うメラニンの量は、免疫応答の尺度として解剖後に測定できます。...

接種<em&gt;ハマダラカ</emメラニン免疫応答を誘導し、測定するためにビーズと&gt;蚊

ボルバキアに感染しているネッタイシマカ蚊はアルボ ウイルスの伝達を抑制する自然集団にリリースされています。我々 は研究所適応と選択範囲を最小限に抑えるための対策を講じて実験およびフィールド ・ リリース、ボルバキア感染症研究室と後部Ae。...

ネッタイシマカ蚊ボルバキアに感染維持

捕虜のアノフェレス蚊に餌を与えるために、血液のない人工食餌の処方のためのプロトコルが提示される。この食事は脊椎動物の血液と同様のパフォーマンスを有し、卵形成および卵の成熟を引き起こし、実行可能な成人の子孫を生み出す。...

アノフェリン蚊を後ろにする無血ダイエット

アノフェレスガンビアにおける機能遺伝学のGAL4-UASシステムの使用

このプロトコルは、φC31システムを使用してアノフェレスマラリア蚊のゲノムにおいて部位特異的修飾を達成する方法を記述している。記載される改変には、attP含有ドッキングラインのゲノムにおけるトランスジェニックカセットの統合および交換の両方が含まれる。...

マラリアのアノフェレスベクターにおける部位特異的φC31媒介集積分とカセット交換

無菌昆虫技術(SIT)は、化学的防除に耐性がある可能性のある特定の医学的に重要な蚊の個体数を制御するために使用されます。ここでは、 ネッタイシマカ...

照射され、マークされたオスの ネッタイシマカ を、操作可能な滅菌昆虫技術プログラムで放出するための準備

蚊のゲノムに外因性遺伝子を導入するには、マイクロインジェクション技術が不可欠です。このプロトコルは、変換された蚊を生成するために アノフェレスガンビア 胚にDNA構築物をマイクロ注入するためにジェームズ研究所によって使用される方法を説明します。...

アノフェレスガンビア胚の微小注入法

学ぶAnopheles gambiaeの飼育法。27度、80%湿度、12時間明暗サイクルで管理し、血液給養から成虫採集までの全段階を解説。マラリア媒介蚊研究に必須の実験室技術です。

モスキート子育てのためのプロトコル（A. gambiae）

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