から初代細胞培養ショウジョウバエ原腸胚

この手順の全体的な目的は、RNAiおよび細胞イメージング解析のために、ショウジョウバエ胚から解離させた初代細胞を調製する方法を示すことです。まずフライケージを準備し、次に同期化した胚を回収して洗浄し、ホモジナイズして細胞を解離させることでこれを達成します。

次に、初代細胞を播種し、RNAi構築物を導入します。最終的に、免疫蛍光顕微鏡観察を通じて、分化した初代細胞に対するRNAiの効果を確認することができます。私の名前はNamoです。

私はハーバード大学医学部遺伝学部の教授であり、Overuse Medical Instituteの研究員です。本日は、私と、研究室のフェローであるJonathan、そして元プロフェローと共に、マウス胚から初代細胞を調製する手法についてご紹介します。この手法は、細胞生物学や発生生物学における多くのアプリケーションにおいて重要であり、特に数年前にJanuが示したように、この手法は初代筋細胞におけるゲノムワイドなCRISPRスクリーンに活用することが可能です。

既存の不死化細胞株の解析などの手法と比較した本手法の主な利点は、初代細胞培養の方が生物体の生物学的特性をより正確に反映できる点にあります。一般的に、本手法を実践する際、いくつかの工程は単に手順書を読むだけでは習得が困難であるため、苦労することがあります。死滅酵母ペーストを調製するには、まず顆粒状の生酵母をコーヒーミルで微粉末に粉砕し、それをビーカーに入れて20分間のドライサイクルでオートクレーブ滅菌します。オートクレーブ後、直ちに操作を行います。

酵母に十分な量の滅菌温水を加え、歯磨き粉のような硬さのペースト状にします。ショウジョウバエ胚から解離させた一次細胞を調製するには、Oregon Rなどの野生型系統のdrosophilaを新しい飼育瓶で育成し、羽化したばかりの成虫を大きな胚収集ケージまたは個体群ケージに移します。次に、同期した胚を効率的に収集するため、ケージを温度約25 °C、湿度65%の部屋に移し、12時間の明暗サイクルで管理し、死んだハエを餌として与えます。

糖蜜プレートに酵母ペーストを塗布します。餌プレートは2〜3日間、1日1回交換してください。一次細胞調製の日には、1〜2時間の産卵前期間として、新鮮なプレートでショウジョウバエに餌を与えます。

12時間の暗期に入る直前に、プリレイプレートを、少量の酵母ペーストを塗布した新鮮なモラセスプレートに交換します。非同期の古い胚が含まれているプリレイ回収分は廃棄してください。

1〜2時間かけて胚を回収します。比較的同調した胚集団を含むプレートを取り出し、25 °Cで5〜6時間保持します。この時点で、胚は回収に適した進行した胃期（gastro stage）に達します。

5〜6時間のインキュベーション後、濡れた絵筆を使用して、プレートからそれらを剥がします。次に、重ねたふるいに入れ、酵母やハエの破片を可能な限り取り除くために十分に洗浄します。これにより、胚が一番下のふるいに集まるようにします。

ふるいを傾けて胚を片側に集め、ゆっくりとふるいからデコレーションバスケットへ洗い出します。次に、50% (v/v) の漂白剤に浸し、胚を滅菌およびコーティングします。胚をインキュベートさせながら、5〜10分間漂白します。

室温の均質剤を用いて満たします。胚 0.5 mLあたり40 mLの培地となるように、M3中等度培地を加えます。その後、70% (v/v) エタノールを用いて、バスケットの壁面から胚を洗い流します。

オートクレーブ滅菌した蒸留水を用いて、胚を十分にすすぎ、漂白剤やエタノールを除去します。次に、すすいだ胚をM3培地に浸します。滅菌したビーカーの中で胚を2〜5分間浸漬させ、胚をインキュベートしている間に、デコレーションバスケットを分解し、NYXメッシュを滅菌したペーパータオルで吸水して乾かします。

胚をM three培地で浸漬させた後、滅菌済みの筆を用いてホモジナイザーに移します。緩めのペッスルを使用し、短いストロークで穏やかにホモジナイズし、ペッスルをチューブの底まで押し付けないようにしてください。すべての胚が懸濁されたら、8回のフルストロークでしっかりとホモジナイズします。このとき、ペッスルを上下に動かす際にねじらないでください。ホモジナイズした液を、注ぐかピペッティングによって滅菌済みの50 mLコニカル遠心チューブに移し、蓋をします。室温で10分間、40 gで遠心分離し、組織の破片、大きな細胞塊、および卵膜をペレット化させます。

細胞と卵黄を含む上清を清潔なチューブに移し、遠心分離の手順を5分間繰り返します。次に、注ぎ入れるかピペッティングして上清を慎重に清潔なチューブに移し、室温で360 Gsにて10分間遠心分離して細胞をペレット化し、上清を捨てます。RNAi実験用の血清フリー培養基10 millilitersで細胞ペレットを再懸濁します。

細胞密度を推定するため、ヘモサイトメーターを用いて生存細胞数をカウントします。その後、360 ×gで細胞を再度ペレット化します。細胞を無血清M3培地で1～5 × 10⁶ cells/mLの濃度で再懸濁し、384ウェルプレートの各ウェルに1.7～2.5 × 10⁵ cells/cm²の密度で播種します。

ウェルプレートに、最終濃度が約 250 ng/well となるように、二本鎖 RNA を 5 µL 分注します。マルチチャンネルピペットを用いて、血清不含 M3 培地で調製した 1～4 × 10⁶ cells/mL の初代細胞を、384 ウェルプレートの各ウェルに 10 µL ずつ分注します。あるいは、共焦点イメージングを行う場合は、細胞を 8 ウェルガラスチャンバースライド上で培養することも可能です。

室温で300 Gsで1分間、プレートを遠心分離します。プレートを25 °Cで22時間、または18 °Cで1〜2日間置きます。それぞれにM3培養液を含む血清をさらに30 µL加えます。

プレートを室温、300 Gsで1分間遠心分離します。その後、一次細胞を湿潤チャンバー内で25 °Cにてさらに5〜7日間培養します。最後に、生細胞のまま、あるいは免疫蛍光染色後に細胞のイメージングを行います。

最適な条件下では、細胞および培養物は健全な状態に見えます。細胞は円形の形態を示し、細胞破片はほとんどなく、コンフルエンスは50から80%になります。初期播種後、細胞は形態変化を起こし、25 °Cで約5〜8日間培養すると完全に分化します。この明視野像は、播種直後の初代細胞の例を示しています。

播種から20時間後、大部分の細胞は円形で完全な状態にあり、互いに十分に分散しています。初代細胞はすでにクラスターを形成しており、この段階で枝分かれした形態を持つ筋肉が認められます。この段階において、5日間培養した初代細胞のコントラスト画像では、神経突起や神経クラスター、および筋肉を伴い、より分化が進んだ様子が観察されます。

これらの例では、DMF2-GAL4、D42-GAL4、およびUAS-mito-GFP導入遺伝子を持つ胚から一次細胞を単離しました。DMF2-GAL4とD42-GAL4は、それぞれ筋肉と運動ニューロンにおいてmito-GFPの発現を誘導します。これらの細胞に対し、LACまたはinflatedを標的とする二本鎖RNAを処理しました。この蛍光画像は、LACを標的とする対照二本鎖RNAを導入した培養系において、GFPを発現している分化した一次筋肉細胞とニューロンの両方を示しており、白い矢印はニューロンの突起を、矢頭は枝分かれした筋肉構造を指しています。分化した筋肉をPhalloidinで染色すると、半数以上の筋肉が枝分かれ構造を示し、残りの筋肉は丸みを帯びた形態を示しました。

合成画像では、筋肉が黄色に、神経構造が緑色に染色されています。この蛍光画像は、inflatedを標的とする二本鎖RNAを含む培養液中で、GFPを発現している分化した一次筋肉とニューロンの両方を示しています。phin染色で可視化した際、白い矢印は神経突起を、矢印の先端は筋肉を指しています。枝分かれした筋肉が見られる野生型コントロールとは異なり、ここでの筋肉はすべて丸まっています。この合成画像において、筋肉は黄色に、神経構造は緑色に染色されています。

二本鎖RNAで処理したこの培養細胞では、丸みを帯びた筋肉形態のみが観察されることに注意してください。神経突起は野生型コントロールのものと同様に見えますが、これらの画像は、抗drosophila titanで赤色に、actonを標識するPhinで緑色に蛍光染色した一次筋肉細胞を示しています。これらのパネルは、野生型コントロールの筋肉と、RNAi処理によりサルコメアが短縮した筋肉へと分化した細胞を示しています。

この手順を行う際は、実験間で比較可能な結果を得るために、プロトコルを一貫して遵守することが重要です。習熟すれば、適切に実施することで2〜4時間以内に完了させることができます。