Name: から初代細胞培養ショウジョウバエ原腸胚 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-28T17:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 55 s
Description: 学ぶショウジョウバエ原腸胚からの初代細胞培養法。RNAi導入と免疫蛍光顕微鏡による細胞イメージング解析により、細胞・発生生物学研究における遺伝子機能解析を効率的に行う手法を解説します。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

JBは、デイモンラニヨンがん研究財団フェローシップDRG - 1716 - 02サポートされていました。 JZは、NIH / NIGMSフェローシップF32 GM082174 - 02によってサポートされていました。 NPは、ハワードヒューズ医学研究所の研究者でもある。

1。フライケージの準備<ol><li>例えば32オンスの昆虫のカップとして便利な容器にショウジョウバエを （そのようなオレゴン- Rまたは遺伝子型などの野生型株）成長する。 </li><li>大胚コレクションケージに新しくeclosedハエを転送したり、人口のケージを飛ぶ。 </li><li> 〜25℃、湿度〜光12時間と暗12時間のサイクルで65％の同期胚の収集を容易にするための温度と部屋にケージを移動します。 </li><li>それらは糖蜜のプレートにストリーク酵母ペーストを殺した供給することによりケージ内のハエを維持する。 2-3日に一度糖蜜プレートを（殺した酵母ペーストで）変更するD. </li></ol> 2。同期胚のコレクション<ol><li>主細胞の準備の日に、1〜2時間プレレイアウト期間貼り殺さ酵母でコーティングWTH新鮮なプレートを飛ぶ餌。 </li><li>ちょうど12時間の明暗サイクルの前に、酵母ペーストの最小限の縞新鮮な糖蜜のプレートにあらかじめレイアウトプレートを交換してください。非同期古い胚を含むプレ素人のコレクションを、捨てる。 </li><li> 1〜2時間の期間のための胚を収集する</li><li> 5〜6時間にわたって25℃で胚や店舗の比較的同期人口を含むプレート° Cを削除します。胚は、この時点で高度な原腸胚の段階でとなります。 </li></ol> 3。胚の回収と洗浄<ol><li>胚は、下部の最高級のメッシュのふるいで収集するように、ウェットブラシでプレートから胚を緩め、そしてふるいの積み上げセットを介してなまぬるい水道水ですすぐ。できるだけ多くの酵母とハエの残骸として削除するには、数分間洗い流してください。 </li><li>ヒントは、胚が一面に蓄積するようにふるい、ゆっくりとdechorionationバスケットにふるいか​​らそれらを洗い流してください。 </li><li>胚を乾燥させることなく、組織培養のフードエリアに移動します。 </li></ol> 4。胚の均質化と細胞のプレーティング<ol><li> 5〜10分間50％（vol / vol）の漂白剤でそれらを浸漬することにより胚を滅菌しdechorionate。 70％（vol / vol）のエタノールでバスケットの壁から胚を洗浄します。また、エタノール処理の前に蒸留水で胚から漂白剤を洗浄する。この時点から以降の胚を滅菌条件下で組織培養フードで処理する必要があります。 </li><li>オートクレーブした蒸留水で漂白剤及び/またはエタノールを除去するために徹底的に胚を洗浄します。 </li><li> dechorionationステップの間、胚の量に基づいて、室温のM3媒体の適切な音量でダウンスホモジナイザーを埋める。胚の体積の間に、メディアのその比は0.5 mlの胚を超えることはできません：40 mlの培地（または〜100から200まで胚/ ml）を。 </li><li>水没胚のに十分なM3メディアの量を滅菌ビーカーでリンス胚を置きます。胚は2〜5分間浸してみましょう。 </li><li> dechorionationバスケットを分解して滅菌ペーパータオルでNitexメッシュが乾燥汚点。 </li><li>滅菌絵筆でホモジナイザーに胚を移す。 </li><li>すべての胚が中断されるまで、チューブの底に達することなく緩い乳棒を使用して、短いストロークで軽くホモジナイズ。ゆっくり、しかししっかりと、8個のフルストロークでホモジナイズする。それが上下に移動と乳棒をねじってはいけません。 </li><li>注ぐまたはピペッティングにより、滅菌50mlのコニカル遠心チューブにホモジネートを転送し、チューブをキャップ。 </li><li> 40グラム、ペレットに室温組織の破片、大規模な細胞塊と卵黄の膜で10分間遠心する。きれいなチューブに細胞と卵黄を含有する上清を移し、5分間の遠心分離のステップを繰り返します。 </li><li>慎重にペレットに、360グラムで10分間清浄なチューブやスピンに注ぐまたはピペッティングにより細胞を室温に上清を移す。上清を捨てる。培養液10ml中の細胞ペレット（RNAi実験のための無血清培地）を再懸濁します。 </li><li>細胞密度を推定する血球計数器を用いて生細胞を数える。一方、細胞をペレットに4.10を繰り返します。 </li><li>所望の濃度に細胞を再懸濁します。起動するには、1.7〜2.5 × 10 5細胞/ cm 2で1の範囲〜5 × 10 6細胞/ mlとプレートを試してみてください。 </li></ol> 5。 384ウェルプレートで培養した細胞のための主要な細胞のRNAi <ol><li> 384ウェルプレートにウェルあたり〜250 ngの最終濃度で各ウェルにdsRNAの5μlを分注する。 </li><li>マルチチャンネルピペットを使用して、各ウェルに異なるdsRNAを含む384ウェルプレートでの無血清M3培地中でウェル当たりの一次細胞を10ml（1〜4x106細胞/ ml）を分注する。また、細胞は、共焦点イメージングのための8ウェルガラスチャンバースライド上で培養することができます。 </li><li> 300グラム、室温で1分間プレートを遠心する。 25無血清培地での培養は、細胞℃で22時間または18でC ° 1-2のC D. </li><li>各ウェルに血清を含む培養液30mlを追加します。 </li> 300グラム、室温で1分間プレートを遠心する。 <li> 〜7日25を追加5の湿度の高い室と文化初代細胞℃でプレートを置きます</li><li>画像セルは、ライブまたは免疫蛍光染色した後。 </li></ol> 6。代表的な結果： 最適な条件で、培養中の細胞は丸い形態と健康になります。文化は小さな細胞の破片を持っており、初期のメッキ後の50〜80％コンフルエントになります。これらの細胞は、長期間培養後形態学的変化を受けることになる。それは通常、完全に25℃に分化する培養中の細胞のために約5-8日かかる℃に良質初代培養は、通常、細胞 - の - の関心が文化の中で区別されているかどうかによって判断される。例えば、一次筋肉細胞は、多くの場合、枝のような形態を持っているし、サルコメアのシリーズで構成される筋原線維状のストライプと多核筋管となる。完全に分化した筋管は、通常、自発的に文化に移動します。対照的に、差別化された一次ニューロンは、それらの細胞体を持つクラスタを形成し、その軸索のケーブルと他のクラスタと接続する。 <img src="/files/ftp_upload/2215/2215fig1.jpg" alt="図1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図1"> 図1。初代細胞は、培養に播種された後、形態学的変化を受ける （A）384ウェルプレートのウェルに播種された後、右の初代培養細胞の明視野像。細胞の大部分はラウンドと無傷とうまく区切られている。 （B）初代培養細胞の明視野像めっき後の20時間。初代細胞は、すでに枝のような形態（長い矢印）を持つクラスタ（大きな矢印）と筋肉、この段階で認識することができますを形成する。 （C）5日間めっき後の初代培養の位相コントラスト画像を。文化は、神経細胞の拡張子（小矢印）、神経細胞のクラスター（ビッグ矢頭）と筋肉（中型矢印）で、はるかに高度に見えます。 <img src="/files/ftp_upload/2215/2215fig2.jpg" alt="図2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図2"> 図2。 dsRNAは治療を受けた初代細胞の例としては、384ウェルプレートで培養 初代細胞はDmef2 - GAL4を運ぶ胚、D42 - GAL4、UAS -水戸- GFPの導入遺伝子、これでDmef2 - GAL4と筋肉と運動神経の水戸- GFPのD42 - Gal4の駆動式、それぞれから単離された。細胞は、lacZの（AC）または膨張（あれば）（DF）のどちらかをターゲットにdsRNAは処理した。主な筋肉と神経細胞の両方は、GFP（A、C、D、F）で見ることができます。白い矢印は神経細胞の拡張子を指している。アクチンのファロイジン染色は（矢頭）のlacZ dsRNAは（BとC）で処理した培養での枝のような筋肉の構造を明らかにするのですが、それdsRNAは（EとF）で処理した培養でのラウンドアップ筋肉の形態。マージされた画像（C、F）で、筋肉は（白矢印）黄色の染色、しかし、赤色の負のショーのニューロンとその拡張されています。 <img src="/files/ftp_upload/2215/2215fig3.jpg" alt="図3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図3"> 図3。ヒトビトロネクチンコートしたカバーガラスをスライド上で培養した一次筋肉の共焦点顕微鏡写真 主な筋肉はimmunofluorescently抗ショウジョウバエタイチン（KZ）（マージの赤）とし、アクチンのファロイジン（マージの緑）で染色した。トップパネルには、野生型コントロールの筋肉であり、底部のものは、SAL（CG31374）短縮筋節とRNAiの筋肉です。

<ol><li>Sullivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAshburner%2C+M+%22Laboratory+culture+of+Drosophila%22">Laboratory culture of Drosophila</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. 588-599 (1999).</li>
<li>Bai, J., Hartwig, J. H., Perrimon, N. S. A. L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((a+WH2-domain-containing+protein%2C+promotes+sarcomeric+actin+filament+elongation+from+pointed+ends+during+Drosophila+muscle+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">a WH2-domain-containing protein, promotes sarcomeric actin filament elongation from pointed ends during Drosophila muscle growth.</a> Dev. Cell. 13, 828-842 (2007).</li>
<li>Bai, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+interference+screening+in+Drosophila+primary+cells+for+genes+involved+in+muscle+assembly+and+maintenance+%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">RNA interference screening in Drosophila primary cells for genes involved in muscle assembly and maintenance .</a> Development. 135, 1439-1449 (2008).</li>
<li>Sepp, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+neural+outgrowth+genes+using+genome-wide+RNAi%5BTitle%5D)+AND+%22PloS.+Genet%22%5BJournal%5D)">Identification of neural outgrowth genes using genome-wide RNAi.</a> PloS. Genet. 4, e1000111-e1000111 (2008).</li>
<li>Donady, J. J., Fyrberg, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+culturing+of+Drosophila+embryonic+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22TCA+Manual%22%5BJournal%5D)">Mass culturing of Drosophila embryonic cells in vitro.</a> TCA Manual. 3, 685-687 (1977).</li>
<li>Seecof, R. L., Alleaume, N., Teplitz, R. L., Gerson, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+neurons+and+myocytes+in+cell+cultures+made+from+Drosophila+gastrulae%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Differentiation of neurons and myocytes in cell cultures made from Drosophila gastrulae.</a> Exp. Cell Res. 69, 161-173 (1971).</li>
<li>Bai, J., Sepp, K. J., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+of+Drosophila+primary+cells+dissociated+from+gastrula+embryos+and+their+use+in+RNAi+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Culture of Drosophila primary cells dissociated from gastrula embryos and their use in RNAi screening.</a> Nature Protocols. 4, 1502-1512 (2009).</li>
</ol>

利害の衝突は宣言されません。

ショウジョウバエの細胞の初代培養の発達パターンは、一次細胞調製の過程でいくつかの変数が原因の可能性が、大きく異なります。まず第一に、ハエ産卵のために使用される（古い週間以内）と健康（ウイルス性または細菌感染の自由）若いはずです。彼らは無用であり、それらの胚に由来する細胞が分化することができず、わずか1〜2日間、存続するとして、未受精卵または感染した胚は、避けなければならない。第二に、均質化の過程で、それはあまりにも多くの胚を使用するオーバーロードホモジナイザーをすることが重要です。あまりにも多くの胚をホモジナイザーをオーバーロードすると、破片の量と、最終的に細胞分化が損なわれる死細胞の数は、増加の原因となります。最後に、細胞は主細胞の良好な分化を確保するための適切な密度でプレートしてください。我々は、一次電池は高すぎる高密度で最初に播種しているときに神経細胞や筋肉細胞の両方の分化を劇的に低減されることがわかった。 表現型解析のために、384ウェルプレートは、通常より低い倍率でスクリーニングや画像解析のための主要な細胞を成長させるために使用されます。はるかに高い倍...

<table><tbody><tr><td>Shields and Sang M3培地</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3652</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清</td><td>JRH Biosciences</td><td>12103-500M</td><td></td></tr><tr><td>ウシ膵臓由来インスリン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I-6634</td><td></td></tr><tr><td>大型胚回収ケージ</td><td>Genesee Scientific</td><td>59-101</td><td></td></tr><tr><td>#25 US標準試験用ふるい</td><td>VWR international</td><td>57334-454</td><td></td></tr><tr><td>#45 US標準試験用ふるい</td><td>VWR international</td><td>57334-462</td><td></td></tr><tr><td>#120 US標準試験用ふるい</td><td>VWR international</td><td>57334-474</td><td></td></tr><tr><td>ダウンス組織ホモジナイザー、Wheaton 7 mL</td><td>VWR international</td><td>62400-620</td><td></td></tr><tr><td>ダウンス組織ホモジナイザー、Kontes 40 mL</td><td>VWR international</td><td>KT885300-0040</td><td></td></tr><tr><td>ダウンス組織ホモジナイザー、Kontes 40 mL</td><td>VWR international</td><td>KT885300-0100</td><td></td></tr><tr><td>Costar 384ウェルプレート</td><td>VWR international</td><td>29444-078</td><td></td></tr><tr><td>Lab-Tek II チャンバー付きカバーガラス</td><td>Fisher Scientific</td><td>171080</td><td></td></tr></tbody></table>

から初代細胞培養ショウジョウバエ原腸胚

Primary Cell Cultures from Drosophila Gastrula Embryos

ここでは、 ショウジョウバエの原腸胚からの解離の初代細胞を調製し、培養する方法を説明します。簡単に言えば、大量のは、若くて健康なハエから胚を上演、集め滅菌し、ガラスホモジナイザーを用いて、単一の細胞懸濁液にして物理的に解離されています。培地中の適切な密度で培養プレートまたはチャンバースライドに播種された後、これらの細胞は、さらにそれらの特定の細胞マーカーによって識別することができるいくつかの形態学的に異なる種類の細胞、に分化することができる。さらに、我々は、遺伝子ノックダウンを引き出すために二重鎖（ds）RNAをこれらの細胞を治療するための条件を提示する。 ショウジョウバエ初代細胞の効率的なRNAiは、単純にdsRNAを含有培養培地で細胞を浸すことによって達成される。他の分子、生化学、細胞イメージング解析とともに、効果的なRNAiの摂動を遂行する能力は、特にショウジョウバエ初代細胞、差別化された筋肉や神経細胞に関連するもので答えられるさまざまな質問ができるようになります。

私たちは、から解離初代細胞を調製するための詳細なプロトコルを提供<em&gt; Drosophil</em&gt;胚。その他、分子生化学的および細胞イメージング手法と一緒に、効果的なRNAiの摂動を遂行する能力は、さまざまな質問がで対処できるようになります<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;一次電池。

ここでは、ショウジョウバエ（Drosophila）の原腸胚から分離した一次細胞を調製および培養する方法について記述します。簡潔に述べると、ステージを合わせた大量の...

この手順の全体的な目的は、RNAiおよび細胞イメージング解析のために、ショウジョウバエの胚から分離した一次細胞を調製する方法を示すことです。まず、フライケージを準備します。次に、同期させた胚を回収し、洗浄し、ホモジナイズして細胞を分離します。次に、初代細胞を播種し、RNAiコンストラクトをトランスフェクションします。最終的に、免疫蛍光顕微鏡法を用いて、分化した初代細胞に対するRNAiの効果を確認することができます。私はNamoです。私はハーバード医学大学の遺伝学部の教授であり、Overuse Medical Instituteの研究員を務めております。本日は、私と、研究室のフェローであるJonathan、そして元プロフェローと共に、マウスの胚から初代細胞を作製する技術についてご紹介します。この手法は、細胞生物学や発生生物学における多くのアプリケーションにおいて重要であり、特に数年前にJanuが示したように、初代筋細胞を用いたゲノムワイドな CRISPR スクリーンに活用することができます。確立された不死化細胞株の解析などの既存の手法に対するこの技術の主な利点は、初代細胞培養の方が生物体の生物学的特性をより正確に反映している点にあります。一般的に、この手法を実践する方は、いくつかのステップが単にプロトコルを読むだけでは習得しにくいため、苦労することになります。死滅酵母ペーストを準備するには、まず粒状の生酵母をコーヒーミルで微粉末に grind し、それをビーカーに入れて20分間のドライサイクルでオートクレーブします。オートクレーブ処理後、直ちに。酵母に滅菌温水を十分に加え、歯磨き粉のような粘度のペースト状にします。ショウジョウバエ胚から分離した初代細胞を調製するには、Oregon Rなどの野生型株を新しい飼育瓶で育成し、羽化したばかりのハエを大型の胚回収ケージまたは個体群ケージに移します。次に、同調的な胚の回収を容易にするため、ケージを温度約25 °C、湿度65%、12時間明暗サイクルの室内に移動させ、ハエに餌を与えます。酵母ペーストを糖蜜プレートにストリークします。餌プレートを1日1回、2〜3日間交換してください。一次細胞調製の日には、1〜2時間の産卵前期間として、新鮮なプレートでハエに餌を与えます。12時間の暗期に入る直前に、プレレイプレートを、最小限の酵母ペーストを画線した新しい糖蜜プレートに交換します。非同期の古い胚を含むプレレイ回収分は廃棄してください。1〜2時間かけて胚を回収します。比較的同期した胚個体群を含むプレートを取り出し、25°Cで5〜6時間保存します。この時点で、胚は胚回収に適した進行した原腸胚期に達します。5〜6時間のインキュベーション後、濡れた絵筆を使用してプレートから卵を剥がします。次に、積み重ねた一連のふるいに卵を入れ、酵母やショ

primary-cell-cultures-from-drosophila-gastrula-embryos

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

このビデオでは、後期ショウジョウバエ蛹の脳からの初代神経培養の準備を示しています。ライブ文化の景色は、フラ-2を使用してカルシウム濃度の神経突起伸長とイメージングを示す。...

後期ステージショウジョウバエ蛹の脳からの初代神経培養

このビデオはmidgastrulaステージショウジョウバエの胚からの一次ニューロン培養の準備を示しています。ライブ文化の景色は、重炭酸塩ベースの定義培地での生育の2日後に細胞を1めっき後の時間と分化した神経細胞を示す。神経細胞は電気的興奮性であり、シナプス結合を形成する。...

Midgastrulaステージショウジョウバエの胚からの神経培養の準備

開発の初期段階で始原生殖細胞に分化する胚性生殖細胞の能力は、がんと不妊についての我々の仮説に対応するために最適なモデルです。このプロトコルは、10.5から11.5日後に交尾のマウス胚での開発生殖腺から始原生殖細胞を単離する方法を示しています。...

マウスES胚細胞の単離と導出

我々は生体内での密度によって細胞小器官を分離する方法を説明します...

ショウジョウバエの胚の生体内の遠心

ショウジョウバエ S2細胞および培養されたニューロンは、インビボでの電動オルガネラ輸送のイメージングのための優れたシステムである。ここでは、両方の細胞型、それらの画像化および輸送の分析を培養するための詳細なプロトコルを記載している。...

培養中の細胞小器官輸送ショウジョウバエ細胞：S2細胞ラインと一次ニューロン。

このプロトコルは、Drosophila melanogasterの蛹からの無傷の精巣と生殖細胞系の嚢胞の解剖と栽培を説明しています。この方法により、ex...

解剖、イメージング、および薬理学的治療： ショウジョウバエ蛹精巣や独身男性生殖ライン嚢胞のex vivo培養

この作品は、高解像度その場でハイ C...

しっかりと段階的な初期のショウジョウバエの胚からゲノムワイドなクロマチン構造キャプチャ ライブラリの生成

ショウジョウバエの細胞株は、基礎・生物医学研究のための重要な試薬です。この資料では、融解、培養、研究のこれらの試薬の使用を組み込むことで研究者を支援するために一般的に使用されるショウジョウバエの細胞の凍結保存にプロトコルを提供します。...

解凍、養殖、ショウジョウバエ細胞をトウキョウ

ここで提示されるプロトコルは、プレートベースの高含有画像を使用して胚発生時に複数 のショウジョウバエ...

ショウジョウバエ胚の調製と、自動高コンテンツアナライザを用いた生細胞顕微鏡のための微小注入

ここでは、ショウ ジョウバエ...

後期胚 性ショウジョウバエ生殖腺 の解剖とライブイメージング

ショウ ジョウバエ 株の長期保存方法は、成虫のハエの生鮮食品バイアルへの頻繁な移送の代替として非常に望ましい。このプロトコルはショウ ジョウバエ...

ショウ ジョウバエ 株の原始生殖細胞凍結保存と復活

学ぶショウジョウバエ原腸胚からの初代細胞培養法。RNAi導入と免疫蛍光顕微鏡による細胞イメージング解析により、細胞・発生生物学研究における遺伝子機能解析を効率的に行う手法を解説します。

から初代細胞培養ショウジョウバエ原腸胚

さらに動画を探す