Name: から初代細胞培養ショウジョウバエ原腸胚 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-28T17:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 55 s
Description: 学ぶショウジョウバエ原腸胚からの初代細胞培養法。RNAi導入と免疫蛍光顕微鏡による細胞イメージング解析により、細胞・発生生物学研究における遺伝子機能解析を効率的に行う手法を解説します。

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JBは、デイモンラニヨンがん研究財団フェローシップDRG - 1716 - 02サポートされていました。 JZは、NIH / NIGMSフェローシップF32 GM082174 - 02によってサポートされていました。 NPは、ハワードヒューズ医学研究所の研究者でもある。

1。フライケージの準備<ol><li>例えば32オンスの昆虫のカップとして便利な容器にショウジョウバエを （そのようなオレゴン- Rまたは遺伝子型などの野生型株）成長する。 </li><li>大胚コレクションケージに新しくeclosedハエを転送したり、人口のケージを飛ぶ。 </li><li> 〜25℃、湿度〜光12時間と暗12時間のサイクルで65％の同期胚の収集を容易にするための温度と部屋にケージを移動します。 </li><li>それらは糖蜜のプレートにストリーク酵母ペーストを殺した供給することによりケージ内のハエを維持する。 2-3日に一度糖蜜プレートを（殺した酵母ペーストで）変更するD. </li></ol> 2。同期胚のコレクション<ol><li>主細胞の準備の日に、1〜2時間プレレイアウト期間貼り殺さ酵母でコーティングWTH新鮮なプレートを飛ぶ餌。 </li><li>ちょうど12時間の明暗サイクルの前に、酵母ペーストの最小限の縞新鮮な糖蜜のプレートにあらかじめレイアウトプレートを交換してください。非同期古い胚を含むプレ素人のコレクションを、捨てる。 </li><li> 1〜2時間の期間のための胚を収集する</li><li> 5〜6時間にわたって25℃で胚や店舗の比較的同期人口を含むプレート° Cを削除します。胚は、この時点で高度な原腸胚の段階でとなります。 </li></ol> 3。胚の回収と洗浄<ol><li>胚は、下部の最高級のメッシュのふるいで収集するように、ウェットブラシでプレートから胚を緩め、そしてふるいの積み上げセットを介してなまぬるい水道水ですすぐ。できるだけ多くの酵母とハエの残骸として削除するには、数分間洗い流してください。 </li><li>ヒントは、胚が一面に蓄積するようにふるい、ゆっくりとdechorionationバスケットにふるいか​​らそれらを洗い流してください。 </li><li>胚を乾燥させることなく、組織培養のフードエリアに移動します。 </li></ol> 4。胚の均質化と細胞のプレーティング<ol><li> 5〜10分間50％（vol / vol）の漂白剤でそれらを浸漬することにより胚を滅菌しdechorionate。 70％（vol / vol）のエタノールでバスケットの壁から胚を洗浄します。また、エタノール処理の前に蒸留水で胚から漂白剤を洗浄する。この時点から以降の胚を滅菌条件下で組織培養フードで処理する必要があります。 </li><li>オートクレーブした蒸留水で漂白剤及び/またはエタノールを除去するために徹底的に胚を洗浄します。 </li><li> dechorionationステップの間、胚の量に基づいて、室温のM3媒体の適切な音量でダウンスホモジナイザーを埋める。胚の体積の間に、メディアのその比は0.5 mlの胚を超えることはできません：40 mlの培地（または〜100から200まで胚/ ml）を。 </li><li>水没胚のに十分なM3メディアの量を滅菌ビーカーでリンス胚を置きます。胚は2〜5分間浸してみましょう。 </li><li> dechorionationバスケットを分解して滅菌ペーパータオルでNitexメッシュが乾燥汚点。 </li><li>滅菌絵筆でホモジナイザーに胚を移す。 </li><li>すべての胚が中断されるまで、チューブの底に達することなく緩い乳棒を使用して、短いストロークで軽くホモジナイズ。ゆっくり、しかししっかりと、8個のフルストロークでホモジナイズする。それが上下に移動と乳棒をねじってはいけません。 </li><li>注ぐまたはピペッティングにより、滅菌50mlのコニカル遠心チューブにホモジネートを転送し、チューブをキャップ。 </li><li> 40グラム、ペレットに室温組織の破片、大規模な細胞塊と卵黄の膜で10分間遠心する。きれいなチューブに細胞と卵黄を含有する上清を移し、5分間の遠心分離のステップを繰り返します。 </li><li>慎重にペレットに、360グラムで10分間清浄なチューブやスピンに注ぐまたはピペッティングにより細胞を室温に上清を移す。上清を捨てる。培養液10ml中の細胞ペレット（RNAi実験のための無血清培地）を再懸濁します。 </li><li>細胞密度を推定する血球計数器を用いて生細胞を数える。一方、細胞をペレットに4.10を繰り返します。 </li><li>所望の濃度に細胞を再懸濁します。起動するには、1.7〜2.5 × 10 5細胞/ cm 2で1の範囲〜5 × 10 6細胞/ mlとプレートを試してみてください。 </li></ol> 5。 384ウェルプレートで培養した細胞のための主要な細胞のRNAi <ol><li> 384ウェルプレートにウェルあたり〜250 ngの最終濃度で各ウェルにdsRNAの5μlを分注する。 </li><li>マルチチャンネルピペットを使用して、各ウェルに異なるdsRNAを含む384ウェルプレートでの無血清M3培地中でウェル当たりの一次細胞を10ml（1〜4x106細胞/ ml）を分注する。また、細胞は、共焦点イメージングのための8ウェルガラスチャンバースライド上で培養することができます。 </li><li> 300グラム、室温で1分間プレートを遠心する。 25無血清培地での培養は、細胞℃で22時間または18でC ° 1-2のC D. </li><li>各ウェルに血清を含む培養液30mlを追加します。 </li> 300グラム、室温で1分間プレートを遠心する。 <li> 〜7日25を追加5の湿度の高い室と文化初代細胞℃でプレートを置きます</li><li>画像セルは、ライブまたは免疫蛍光染色した後。 </li></ol> 6。代表的な結果： 最適な条件で、培養中の細胞は丸い形態と健康になります。文化は小さな細胞の破片を持っており、初期のメッキ後の50〜80％コンフルエントになります。これらの細胞は、長期間培養後形態学的変化を受けることになる。それは通常、完全に25℃に分化する培養中の細胞のために約5-8日かかる℃に良質初代培養は、通常、細胞 - の - の関心が文化の中で区別されているかどうかによって判断される。例えば、一次筋肉細胞は、多くの場合、枝のような形態を持っているし、サルコメアのシリーズで構成される筋原線維状のストライプと多核筋管となる。完全に分化した筋管は、通常、自発的に文化に移動します。対照的に、差別化された一次ニューロンは、それらの細胞体を持つクラスタを形成し、その軸索のケーブルと他のクラスタと接続する。 <img src="/files/ftp_upload/2215/2215fig1.jpg" alt="図1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図1"> 図1。初代細胞は、培養に播種された後、形態学的変化を受ける （A）384ウェルプレートのウェルに播種された後、右の初代培養細胞の明視野像。細胞の大部分はラウンドと無傷とうまく区切られている。 （B）初代培養細胞の明視野像めっき後の20時間。初代細胞は、すでに枝のような形態（長い矢印）を持つクラスタ（大きな矢印）と筋肉、この段階で認識することができますを形成する。 （C）5日間めっき後の初代培養の位相コントラスト画像を。文化は、神経細胞の拡張子（小矢印）、神経細胞のクラスター（ビッグ矢頭）と筋肉（中型矢印）で、はるかに高度に見えます。 <img src="/files/ftp_upload/2215/2215fig2.jpg" alt="図2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図2"> 図2。 dsRNAは治療を受けた初代細胞の例としては、384ウェルプレートで培養 初代細胞はDmef2 - GAL4を運ぶ胚、D42 - GAL4、UAS -水戸- GFPの導入遺伝子、これでDmef2 - GAL4と筋肉と運動神経の水戸- GFPのD42 - Gal4の駆動式、それぞれから単離された。細胞は、lacZの（AC）または膨張（あれば）（DF）のどちらかをターゲットにdsRNAは処理した。主な筋肉と神経細胞の両方は、GFP（A、C、D、F）で見ることができます。白い矢印は神経細胞の拡張子を指している。アクチンのファロイジン染色は（矢頭）のlacZ dsRNAは（BとC）で処理した培養での枝のような筋肉の構造を明らかにするのですが、それdsRNAは（EとF）で処理した培養でのラウンドアップ筋肉の形態。マージされた画像（C、F）で、筋肉は（白矢印）黄色の染色、しかし、赤色の負のショーのニューロンとその拡張されています。 <img src="/files/ftp_upload/2215/2215fig3.jpg" alt="図3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図3"> 図3。ヒトビトロネクチンコートしたカバーガラスをスライド上で培養した一次筋肉の共焦点顕微鏡写真 主な筋肉はimmunofluorescently抗ショウジョウバエタイチン（KZ）（マージの赤）とし、アクチンのファロイジン（マージの緑）で染色した。トップパネルには、野生型コントロールの筋肉であり、底部のものは、SAL（CG31374）短縮筋節とRNAiの筋肉です。

<ol><li>Sullivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAshburner%2C+M+%22Laboratory+culture+of+Drosophila%22">Laboratory culture of Drosophila</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. 588-599 (1999).</li>
<li>Bai, J., Hartwig, J. H., Perrimon, N. S. A. L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((a+WH2-domain-containing+protein%2C+promotes+sarcomeric+actin+filament+elongation+from+pointed+ends+during+Drosophila+muscle+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">a WH2-domain-containing protein, promotes sarcomeric actin filament elongation from pointed ends during Drosophila muscle growth.</a> Dev. Cell. 13, 828-842 (2007).</li>
<li>Bai, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+interference+screening+in+Drosophila+primary+cells+for+genes+involved+in+muscle+assembly+and+maintenance+%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">RNA interference screening in Drosophila primary cells for genes involved in muscle assembly and maintenance .</a> Development. 135, 1439-1449 (2008).</li>
<li>Sepp, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+neural+outgrowth+genes+using+genome-wide+RNAi%5BTitle%5D)+AND+%22PloS.+Genet%22%5BJournal%5D)">Identification of neural outgrowth genes using genome-wide RNAi.</a> PloS. Genet. 4, e1000111-e1000111 (2008).</li>
<li>Donady, J. J., Fyrberg, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+culturing+of+Drosophila+embryonic+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22TCA+Manual%22%5BJournal%5D)">Mass culturing of Drosophila embryonic cells in vitro.</a> TCA Manual. 3, 685-687 (1977).</li>
<li>Seecof, R. L., Alleaume, N., Teplitz, R. L., Gerson, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+neurons+and+myocytes+in+cell+cultures+made+from+Drosophila+gastrulae%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Differentiation of neurons and myocytes in cell cultures made from Drosophila gastrulae.</a> Exp. Cell Res. 69, 161-173 (1971).</li>
<li>Bai, J., Sepp, K. J., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+of+Drosophila+primary+cells+dissociated+from+gastrula+embryos+and+their+use+in+RNAi+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Culture of Drosophila primary cells dissociated from gastrula embryos and their use in RNAi screening.</a> Nature Protocols. 4, 1502-1512 (2009).</li>
</ol>

利害の衝突は宣言されません。

ショウジョウバエの細胞の初代培養の発達パターンは、一次細胞調製の過程でいくつかの変数が原因の可能性が、大きく異なります。まず第一に、ハエ産卵のために使用される（古い週間以内）と健康（ウイルス性または細菌感染の自由）若いはずです。彼らは無用であり、それらの胚に由来する細胞が分化することができず、わずか1〜2日間、存続するとして、未受精卵または感染した胚は、避けなければならない。第二に、均質化の過程で、それはあまりにも多くの胚を使用するオーバーロードホモジナイザーをすることが重要です。あまりにも多くの胚をホモジナイザーをオーバーロードすると、破片の量と、最終的に細胞分化が損なわれる死細胞の数は、増加の原因となります。最後に、細胞は主細胞の良好な分化を確保するための適切な密度でプレートしてください。我々は、一次電池は高すぎる高密度で最初に播種しているときに神経細胞や筋肉細胞の両方の分化を劇的に低減されることがわかった。 表現型解析のために、384ウェルプレートは、通常より低い倍率でスクリーニングや画像解析のための主要な細胞を成長させるために使用されます。はるかに高い倍...

<table><tbody><tr><td>Shields and Sang M3培地</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3652</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清</td><td>JRH Biosciences</td><td>12103-500M</td><td></td></tr><tr><td>ウシ膵臓由来インスリン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I-6634</td><td></td></tr><tr><td>大型胚回収ケージ</td><td>Genesee Scientific</td><td>59-101</td><td></td></tr><tr><td>#25 US標準試験用ふるい</td><td>VWR international</td><td>57334-454</td><td></td></tr><tr><td>#45 US標準試験用ふるい</td><td>VWR international</td><td>57334-462</td><td></td></tr><tr><td>#120 US標準試験用ふるい</td><td>VWR international</td><td>57334-474</td><td></td></tr><tr><td>ダウンス組織ホモジナイザー、Wheaton 7 mL</td><td>VWR international</td><td>62400-620</td><td></td></tr><tr><td>ダウンス組織ホモジナイザー、Kontes 40 mL</td><td>VWR international</td><td>KT885300-0040</td><td></td></tr><tr><td>ダウンス組織ホモジナイザー、Kontes 40 mL</td><td>VWR international</td><td>KT885300-0100</td><td></td></tr><tr><td>Costar 384ウェルプレート</td><td>VWR international</td><td>29444-078</td><td></td></tr><tr><td>Lab-Tek II チャンバー付きカバーガラス</td><td>Fisher Scientific</td><td>171080</td><td></td></tr></tbody></table>

から初代細胞培養ショウジョウバエ原腸胚

Primary Cell Cultures from Drosophila Gastrula Embryos

ここでは、 ショウジョウバエの原腸胚からの解離の初代細胞を調製し、培養する方法を説明します。簡単に言えば、大量のは、若くて健康なハエから胚を上演、集め滅菌し、ガラスホモジナイザーを用いて、単一の細胞懸濁液にして物理的に解離されています。培地中の適切な密度で培養プレートまたはチャンバースライドに播種された後、これらの細胞は、さらにそれらの特定の細胞マーカーによって識別することができるいくつかの形態学的に異なる種類の細胞、に分化することができる。さらに、我々は、遺伝子ノックダウンを引き出すために二重鎖（ds）RNAをこれらの細胞を治療するための条件を提示する。 ショウジョウバエ初代細胞の効率的なRNAiは、単純にdsRNAを含有培養培地で細胞を浸すことによって達成される。他の分子、生化学、細胞イメージング解析とともに、効果的なRNAiの摂動を遂行する能力は、特にショウジョウバエ初代細胞、差別化された筋肉や神経細胞に関連するもので答えられるさまざまな質問ができるようになります。

私たちは、から解離初代細胞を調製するための詳細なプロトコルを提供<em&gt; Drosophil</em&gt;胚。その他、分子生化学的および細胞イメージング手法と一緒に、効果的なRNAiの摂動を遂行する能力は、さまざまな質問がで対処できるようになります<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;一次電池。

ここでは、ショウジョウバエ（Drosophila）の原腸胚から分離した一次細胞を調製および培養する方法について記述します。簡潔に述べると、ステージを合わせた大量の...

この手順の全体的な目的は、RNAiおよび細胞イメージング解析のために、ショウジョウバエの胚から分離した一次細胞を調製する方法を示すことです。まず、フライケージを準備します。次に、同期させた胚を回収し、洗浄し、ホモジナイズして細胞を分離します。次に、初代細胞を播種し、RNAiコンストラクトをトランスフェクションします。最終的に、免疫蛍光顕微鏡法を用いて、分化した初代細胞に対するRNAiの効果を確認することができます。私はNamoです。私はハーバード医学大学の遺伝学部の教授であり、Overuse Medical Instituteの研究員を務めております。本日は、私と、研究室のフェローであるJonathan、そして元プロフェローと共に、マウスの胚から初代細胞を作製する技術についてご紹介します。この手法は、細胞生物学や発生生物学における多くのアプリケーションにおいて重要であり、特に数年前にJanuが示したように、初代筋細胞を用いたゲノムワイドな CRISPR スクリーンに活用することができます。確立された不死化細胞株の解析などの既存の手法に対するこの技術の主な利点は、初代細胞培養の方が生物体の生物学的特性をより正確に反映している点にあります。一般的に、この手法を実践する方は、いくつかのステップが単にプロトコルを読むだけでは習得しにくいため、苦労することになります。死滅酵母ペーストを準備するには、まず粒状の生酵母をコーヒーミルで微粉末に grind し、それをビーカーに入れて20分間のドライサイクルでオートクレーブします。オートクレーブ処理後、直ちに。酵母に滅菌温水を十分に加え、歯磨き粉のような粘度のペースト状にします。ショウジョウバエ胚から分離した初代細胞を調製するには、Oregon Rなどの野生型株を新しい飼育瓶で育成し、羽化したばかりのハエを大型の胚回収ケージまたは個体群ケージに移します。次に、同調的な胚の回収を容易にするため、ケージを温度約25 °C、湿度65%、12時間明暗サイクルの室内に移動させ、ハエに餌を与えます。酵母ペーストを糖蜜プレートにストリークします。餌プレートを1日1回、2〜3日間交換してください。一次細胞調製の日には、1〜2時間の産卵前期間として、新鮮なプレートでハエに餌を与えます。12時間の暗期に入る直前に、プレレイプレートを、最小限の酵母ペーストを画線した新しい糖蜜プレートに交換します。非同期の古い胚を含むプレレイ回収分は廃棄してください。1〜2時間かけて胚を回収します。比較的同期した胚個体群を含むプレートを取り出し、25°Cで5〜6時間保存します。この時点で、胚は胚回収に適した進行した原腸胚期に達します。5〜6時間のインキュベーション後、濡れた絵筆を使用してプレートから卵を剥がします。次に、積み重ねた一連のふるいに卵を入れ、酵母やショウジョウバエの破片を可能な限り除去するために十分に洗浄します。これにより、胚が一番下のふるいに集まるようにします。ふるいを傾けて胚を一方に集め、ゆっくりとふるいからデコレーションバスケットへ洗い出します。次に、胚を50% volume per volumeの漂白剤に浸し、滅菌およびコーティングを行います。胚をインキュベートさせながら、5分から10分間漂白します。室温のホモジナイザーで満たします。培地を加え、胚 0.5 mLあたり培地 40 mL以下の容量にします。その後、70% (v/v) エタノールでバスケットの壁面から胚を洗い流します。オートクレーブ滅菌水を用いて、胚を十分にすすぎ、漂白剤およびエタノールを除去します。次に、すすいだ胚をM3培地に浸します。滅菌済みのビーカー内で胚を2〜5分間浸漬させ、胚をインキュベートしている間に、デコレーションバスケットを分解し、ナイロンメッシュを滅菌ペーパータオルで拭いて乾燥させます。胚をM three培地で浸したあと、滅菌済みの筆を用いてホモジナイザーに移します。緩いペスダウン（すりこぎ）を用いて、短いストロークで静かにホモジナイズし、ペスダウンをチューブの底まで押し付けないようにしてください。すべての胚が懸濁されたら、しっかりとした8回のフルストロークで丁寧にホモジナイズします。この際、ペスダウンを上下に動かすときに回転させないでください。ホモジネートを、注ぐかピペッティングして滅菌済みの50 milliliterコニカル遠心チューブに移し、キャップを締めて室温で10分間 40 g で遠心分離し、組織残渣、大きな細胞塊、および胎児膜をペレット化させます。細胞と卵黄を含む上清を清潔なチューブに移し、遠心分離の手順を5分間繰り返します。次に、上清を慎重に注ぐかピペッティングで清潔なチューブに移し、室温で360 Gで10分間遠心して細胞をペレット化し、上清を捨てます。RNAi実験用に、細胞ペレットを10 millilitersの無血清培地で再懸濁します。細胞密度を推定するため、ヘモサイトメーターを用いて生細胞数をカウントします。その後、再び360 ×gで細胞を遠心分離してペレット化します。細胞を無血清M3培地を用い、1～5 × 10⁶ cells/mLの濃度で再懸濁し、384ウェルプレートの各ウェルに1.7～2.5 × 10⁵ cells/cm²の密度で播種します。ウェルプレートに、最終濃度が1ウェルあたり約250 ngとなるように、二本鎖RNAを5 µL分注します。マルチチャンネルピペットを使用し、血清不含M3培地で調製した1×10⁶～4×10⁶ cells/mLの初代細胞を、384ウェルプレートの各ウェルに10 µLずつ分注します。あるいは、共焦点イメージングを行う場合は、8ウェルガラスチャンバースライド上で細胞を培養することも可能です。プレートを室温で300 Gsで1分間遠心分離します。プレートを25 °Cで22時間、または18 °Cで1〜2日間静置します。さらに、M3培養液を含む血清を30 µLずつ各プレートに添加します。プレートを室温で300 Gsにて1分間遠心分離します。その後、一次細胞を湿潤チャンバー内で25°Cでさらに5〜7日間培養します。最後に、生細胞の状態、または免疫蛍光染色の後に細胞のイメージングを行います。最適な条件下では、細胞および培養液は健全な状態に見えます。形態は円形で、細胞碎片はほとんどなく、コンフルエンシーは50%から80%になります。初期播種後、細胞は形態変化を起こし、25°Cで約5〜8日間培養すると完全に分化します。この明視野像は、播種直後の初代細胞の例を示しています。播種から20時間後、大部分の細胞は円形で、完全な状態で互いに十分に分離しています。一次細胞はすでにクラスターを形成しており、この段階で枝分かれした形態を持つ筋肉が認められます。この段階の、5日間培養した一次細胞のコントラスト画像では、神経突起や神経クラスター、および筋肉が見られ、より進展した状態であることがわかります。これらの例では、DMF2-GAL4、D42G4、およびUAS-mitoGFPのトランスジェニック胚から一次細胞を単離しました。DMF2-GAL4およびD42G4は、それぞれ筋肉および運動ニューロンにおいてmitoGFPの発現を誘導します。これらの細胞に、LACまたはinflatedを標的とする二本鎖RNAを処理しました。この蛍光画像は、LACを標的とするコントロール二本鎖RNAを導入した培養系において、GFPを発現している分化した一次筋肉細胞とニューロンの両方を示しています。白い矢印はニューロンの突起を指し、矢印頭は分枝状の筋肉構造を指しています。分化した筋肉をPhalloidinで染色すると、半数以上の筋肉に分枝状の構造が見られ、残りの筋肉は丸みを帯びた形態を示しています。合成画像において、筋肉は黄色に、神経構造は緑色に染色されています。この蛍光画像は、inflatedを標的とする二本鎖RNAを含む培養液中で、GFPを発現している分化した一次筋肉およびニューロンの両方を示しています。phin染色で可視化した際、白い矢印は神経突起を、矢印の先端は筋肉を指しています。枝分かれした筋肉が見られる野生型コントロールとは異なり、この合成画像ではすべての筋肉が丸みを帯びており、筋肉は黄色に、神経構造は緑色に染色されています。二本鎖RNAで処理したこの培養細胞では、丸みを帯びた筋肉形態のみが見られることに注意してください。神経突起は野生型コントロールのものと同様に見えますが、これらの画像は、抗drosophila titan抗体で赤色に、アクチンを標識するPhinで緑色に蛍光染色された一次筋細胞を示しています。これらのパネルは野生型コントロールの筋肉を示しており、もう一方はRNAi処理された筋肉であり、サルコメアが短縮した筋肉へと発達したことを表しています。この手順を行う際は、実験全体で比較可能な結果を得るために、プロトコルを一貫して遵守することが重要です。習得すれば、適切に実施することで2〜4時間以内にこの手法を完了させることができます。

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