蚊と感染症の表現型決定における熱帯熱マラリア原虫の感染症のためのプロトコル

私はジョンズ・ホプキンス大学公衆衛生大学院マラリア研究所のジョージ・ディモプロスですが、ここからは、ガンビアの蚊にマラリア原虫と寄生虫を感染させる方法と、蚊のミッドガットの感染表現型を決定する方法の手順をお見せします。この手順では、寄生虫培養用のCO2インキュベーターが必要な基本的な機器が必要です。また、CO2インキュベーターがない場合は、キャンドルジャーを使用することもできます。

もちろん、昆虫、解剖顕微鏡、光学顕微鏡などの標準的な分子生物学および細胞生物学機器も必要です。ウォーターバスが必要です。蚊の膜フィーダーシステムと遠心分離機が必要です。

こんにちは、私の名前はISHで、ジョージ・デポス博士の研究室にいます。私はポスドクです。私の名前はリンゼイ・ガーバーで、博士課程の学生です。

形質感染の最初のステップは、形質培養物を準備することです。二酸化炭素インキュベーターがない場合は、キャンドルキャンドルジャーを用意でき、そこに6ウェルプレートを置き、ガトーセットカルチャーをセットし、キャンドルに火をつけてから、ジャーを密封することができます。最初のステップは、人間、新鮮な、人間の血液と血清を持ち、最初に水浴で37歳にして解凍し、本当に温かい血液と温かい血清が必要なので、それらを暖かくすることです。

血液を準備するには、新鮮な人間の血液の1匹の動物を一度に割り当てる必要があります。はい、新鮮な血液は赤血球を剥がすために2000RPMで5分間回転する必要があります。スピンが終わったら、透明なスープを捨て、赤血球である赤いペレットをヒト血清で3回洗う必要があります。

ペレットに等量のヒト血清を加え、それらを混合し、2000 RPMで5分間再度回転させます。この手順は 3 回繰り返されます。最後に、赤血球ペレットをガノーテ培養物に追加する準備ができています。

さて、CO2インキュベーターにあるマラリア原虫培養物は、RPMA培地で16日間維持する必要があり、16日目には感染の準備が整います。私たちはマラリア原虫を扱っているため、培養、すべてのステップで注意を払う必要があります。最初のステップは、寄生虫をBC 2の研究室で育て、フードで実施することです。

すべてのピペットチップとすべての追加オフ、すべてがバイオハザードボックスに廃棄されなければならず、他の解決策は私たちのパイプピットマンのようでなければなりません。彼らは10%漂白剤で洗う必要があり、手袋を着用する必要があります。16日目の培養から白衣は、スライドガラスに少量の血液を採取し、塗抹標本を作成し、汚れに対して行う必要があり、もう一つは、光学顕微鏡です。

GAMMATの割合は、16日齢の配偶子細胞培養から決定できます。簡単に底にある寄生虫を邪魔したり吸い上げたりしないように注意しながら、ほとんどのメディアを取り外し、残りのメディアと寄生虫をしっかりとパイプでつなぎます。赤血球の寄生虫をペンに混ぜると、寄生虫のペンに付着したものが、その後、遠心分離機に入れられ、2000RPMで5分間回転します。

スピン後、寄生虫は赤血球でペレット状になります。仰臥位はRPMI培地であり、底部にはペレットに寄生虫がいます。RBCを使用して、RPMIであるスープを取り除きます。

寄生虫や赤血球を乱さないようにメディアに注意する必要があります。GIMs 10によって決定されるGATOTの割合は、通常2〜4%の範囲にあり、その後、赤血球と寄生虫がスピン後に準備ができたとき、それらは一緒に混合され、追加する必要がある血液の量は最終的なGATOTの割合によって決定されます。それは急性である必要があり、通常は0.3〜1%の範囲であり、これがphys蚊の摂食に使用されるものです。

Presidium S Infectionの場合、これはガラスフィーダーで、蚊の膜給餌に使用します。ご覧の小さな穴から血液を入れて、その中に血液を入れます。側面の下部には2つのノズルがあり、これらは37度で言及されている私たちの水の誕生に接続されています。

給餌用のフィーダーを準備するために、私たちは小さなアフィールを取ります。両端から4つの側面すべてから伸ばし、それをガラスフィーダーの開いた側に置いて、皮膚を模倣するような薄い膜のシートを作ります。これがメンブレンフィーディングと呼ばれるものです。

これは循環水浴であり、水を37に維持し、さらにガラスフィーダーを介して水を循環させることで、血液が37で暖かく保たれます。そこで、ガラスフィーダーを小さな毛細管で接続し、それを循環水浴に接続し、水浴をオンにすることで、水が循環し、水と血液が2つの別々のチャンバーにあるため、水と血液が混ざり合うことはありません。これはフィスガンビの蚊が入った小さなカップです。

まず、ガラスフィーダーをケージに置き、ガラスフィーダーに重りを置いて、フィムである膜がメッシュネットと同じ高さになるようにします。寄生虫を含む約200マイクロリットルの血液。必要なガンボットの割合をフィーダーに追加し、血液がずっと下がり、蚊が血液にアクセスできることを確認します。

フィッティングは約30分間続きます。フィッティングが完了すると、ガラスフィーダーは10%漂白剤で10回で完全に洗浄され、残りの膜とテープは追加ごとにバイオハザードボックスに廃棄されます。血液フィッティングの後、不適合な蚊はFRBの蚊から取り除く必要があります。

これを行うには、血液を与えられた蚊の入った小さなカップカップを冷蔵室に5〜10分間置いて、蚊をノックしました。ご覧の通り、蚊はすでに寒さに負けています。蓋を開けて小さなペトロ皿に移し、氷のバケツに乗せておけば、蚊はずっと冷たく保たれ、逃げられないようにします。

これらはマラリア原虫に感染した蚊であるため、それらを緩めないように細心の注意を払う必要があることを忘れないでください。蚊が冷蔵室に落ちたら、蚊を通常のインセクターに移し、室温に維持しますが、蚊は常にガソリン皿に入れ、アイスバケツに保管されているので、常にそこにいるようにしています。FRBの蚊をUNFIの蚊からどのように取り除くことができるかを見ることができます。

FRBの連中は、その中に血が流れている。彼らは完全に充血しています。彼らの中には部分的に血を食べているものもいるので、完全に充血していません。

彼らは腹部に少量の血液を持っていますが、他の人は腹部に大量の血液を持っています。UNFIのものは腹部に血液がないので、FRBと不適格なものを簡単に区別できます。表示。これが血を餌とする成虫の雌の蚊ですので、これらの蚊をペトロ皿からワックスラインの段ボールカップに移します。

血液を与えられた蚊をカップに入れた後、10%のショ糖に浸した小さな綿片を入れて、彼らが孵化しようとしている次の7日間、10%のスクロースを食べられるようにし、また、カップ内の水分を補給するために、小さな折り畳まれたコショウタオルを置き、ガソリン皿で覆います。プラズモンに感染した蚊は、別の小さなケージに入れられるので、二重の保護が必要であり、ケージをビル3ラボに入れます。これは、血液供給の7日後に27度のRogateと80%湿度に維持されます。インセクターに保管されていた蚊は、ダブルケージボックスに入れられ、インセクターから取り出され、蚊を倒すために冷蔵室に運ばれます。

蚊が落ちた後、蚊はペトロ皿に移され、氷のバケツに保管されます。今、私たちは蚊を解剖する準備をしています。腸の中央部を解剖し、嚢胞を探します。

最初のステップは、解剖顕微鏡に取り付けられたスライドガラスに100マイクロリットルのPBSを追加することです。次のステップは、原告の鉗子を使用することです。ペトロ皿から1匹の蚊をPBSに移し、PBSは解剖顕微鏡に取り付けられたスライドガラス上にあります。

他のものはまだ冷やしたペトロ皿に残っています。蚊を解剖するには、蚊を胸部に fps の 1 つで保持し、後腹部を fp で保持します。次に、中腸が露出するまで体の部分をゆっくりと引っ張ります。

それは白い袋のように見えます、体が余分な組織や他の体の部分を取り除くために鉗子を使うように。はい、これは中腸で、白い嚢のような体のように見えますが、これはOSを持っています。この中腸を12ウェルガラスライトに移し、5〜10マイクロリットルの0.2%マイクロプロに浸します。

カバースリップを使用して、感染したすべての蚊に対してこの手順を実行します。腸は明るいピンクのように見えますが、このスライドを光学顕微鏡に移してOSの負荷をカウントします。私たちは今、感染した蚊から解剖された中腸を見ています。

中腸はスライクな体のように見え、ロムの汚れがあるため、非常にわずかにピンクがかった色をしており、O SSTはかすかなピンク色の腸組織に対して明るいピンク色をしているはずです。これらの中腸は、感染した蚊からのものですが、sstを示さないため、感染していない可能性があります。しかし、もし中腸が感染していたとしたら、Sは小さくて明るいピンク色の円として表示され、1つの中腸内で22,500の間に多数の遅延が発生する可能性があります。

この手順には、マラリア原虫のラム病原虫を人間の血液に感染させ、その感染した血液をガンビアの蚊に供給し、それらの蚊から中腸を解剖し、感染した中腸内のOSIS数を決定することが含まれていました。この手法は、実験室で再現できるヒトのマラリア感染に最も近い近似値であるため、重要です。