Name: 蚊と感染症の表現型決定における熱帯熱マラリア原虫の感染症のためのプロトコル (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-07-04T00:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 10 s
Description: 学ぶ 熱帯熱マラリア原虫による蚊の感染プロトコル。ゲームトサイト培養の調製と膜給餌法を用いて、蚊の中腸における感染表現型を決定する方法を解説。マラリア伝播動態の研究に有用です。

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生殖母体の文化のA.の調製 ： <ol><li>水浴中で37℃に新鮮なヒト血液および血清をもたらす。 </li><li>滅菌条件下、ピペットエッペンドルフチュー​​ブに暖かい血液1mL下換気フード、で。 2200 rpmで5分間、遠心分離で血液を回転させる。赤血球をペレットにする必要があります。明確な血清を除去し捨てる。 gametocytesのための全血を得るために新たな血清3倍等量のerythocytesを洗ってください。 </li><li> CO 2インキュベーターやキャンドルの瓶から生殖母体文化を取得。この文化は文化の16日目に蚊にRPMI培地と供給に維持されるべきである。 gametocytemiaの％を決定するために（文化の日16）一滴の血でスライドガラス上に薄層塗抹標本を作成し、Geimsa染色行います。寄生虫文化の分野における配偶子の数を決定します。それは2の範囲である - 4％。あなたが希望する最終的な％のgametocytemia（0.3 -1％）を達成するために必要な全血の量を計算する。 </li><li> （メディアは赤/ピンクの光になる間、寄生虫が黒として表示される）寄生虫を妨害したり吸うように注意しながら、ピペットを使用して、生殖母細胞培養液からのメディアのほとんどを削除します。 15ミリリットルのファルコンチューブにピペットでメディアや寄生虫の残りを。 2200 rpmで5分間、遠心分離でスピン。寄生虫と赤血球はペレット、削除、および妨害の寄生虫のない上清のメディアを破棄します。 </li><li>あなたの前の計算によれば、所望の最終gametocytemiaを与えるために準備した全血の量（ステップA2から）で寄生虫を組み合わせる。完全に混合するピペット。 （〜1分） </li></ol>これは、今、あなたの蚊に供給されるサンプルです。水浴で37℃で保管してください。 B.は、蚊を食べさせる 。 <ol><li>カップに付属のゴムバンドやボール紙のふたによって保護されたネッティングメッシュで覆われているワックスが並ぶ段ボールのコップにあなたのハマダラカ蚊（〜30から50）を置く。我々は、このステップのためにバッテリ駆動アスピレーターを使用してください。 </li><li>ゴム管にガラスフィーダの両側にノズルを挿入することにより、循環水浴を準備。あなたが直列に必要な数のフィーダとして接続します。一連の一端が水浴（フィーダーを通して水をプッシュする部分）のサーキュレータにチューブで接続する必要が、シリーズのもう一方の端はゴムチューブで構成する必要があります風呂に空の背面に循環水を可能にするために風呂に沈め。水が約37 ° Cの水と餌を循環し、戻ってお風呂にされるようになるまでお風呂に入れます。これは、血液を暖かく保つと寄生虫が生き続けるために不可欠です。 </li><li>フィーダの開口部にしっかりとシールするために圧力を使用して、ガラス膜のフィーダの周りに延伸して膜を（我々は、ストレッチパラフィルムの小さな四角を使用）準備。この膜は、皮膚を模倣します。 </li><li>場所ごとに蚊のカップとクランプまたはテープを使用して、安全なフィーダー上に1フィーダ膜面を下に。蚊は、カップの内側からそれにアクセスできるように膜がネットと同じ高さに座ってください。 </li><li>慎重にピペット寄生虫血の食事（ステップA5から）フィーダの首に、蚊が血にアクセスできるように膜を接触させ、血液が貯留中に首を介してすべての道を行くことを確認して。我々は、フィーダあたりの血液の約200μlを使用していますが、これは変わることができる。 </li><li>蚊が供給することができます。我々は彼らが≈30分間供給することができます（theexperimentに応じて、変数を、ほとんどの実験のために、時折何がすでに腹部の血液の含有量を調べることで食事を取った監視。） </li><li>授乳後は、蚊カップからフィーダを取り外します。水浴の電源を切り、チューブからフィーダを取り外してください。 </li><li>メンブレンを外し、除染と水で洗浄して10％の漂白剤でフィーダを浸す。大規模なバイオハザード容器内の小さなバイオハザードバッグや預金に汚染された物質（膜、紙タオル、手袋、等）を配置します。 </li><li>冷蔵庫や低温室でカップを置くことによって、蚊を麻酔。一度蚊が完全に麻酔ですが、氷のバケツに埋め込まれたペトリ皿に移す。ソートの蚊は、血液の食事のいずれかの符号のための腹部を注意深く見て、そして食べていないものを捨てる​​。他の人が摂取した血液の狭い帯域を表示しますが、一部の蚊は完全に充血され、すべては&quot;供給&quot;として受け入れられます。段ボールカップに供給蚊を元に戻します。 </li><li>蚊に砂糖の食事を（10％ショ糖に浸した綿の部分）を提供し、7日間、通常の昆虫館の条件下でインキュベートする。毎日、蚊は、死亡率を監視する必要があります。また、綿は、それらが食物を奪われないように、ショ糖とウェットなされるべきである。それは、蚊は湿った保つために、蒸留水に浸したペーパータオルを追加するには、まだ、良いです。これらの蚊は、P.ですfalcipraumが感染し、そのすべてのケアはない蚊がESCAPできないように注意する必要がありますカップからE。小さなcagefor二重保護にカップを置くことが最良です。 </li></ol> C.は、蚊midgutsを解剖し、オーシストの負荷を推定する。 <ol style="margin-top: 0in"><li style="tab-stops: list .5in">バッテリ駆動アスピレーターを使用して段ボールカップから吸引蚊（ステップBから）。寒い部屋に移動したり、少なくとも5分間、氷中に貯水池を埋めてたり、蚊が移動して停止するまで、取り外し可能な吸引器のタンクの内側にある麻酔蚊、。 </li><li style="tab-stops: list .5in">貯水池からの氷の中に埋め込まれたガラスのペトリ皿に麻酔蚊を転送する。単層に蚊を広げて、プラスチックシャーレの蓋でカバーしています。皿に対応できない蚊は寒い部屋や氷に戻される、タンク内に残ります。 </li><li style="tab-stops: list .5in">先の細いピンセットを使用して、解剖顕微鏡下にマウントスライドガラス上に含まれる100μlのPBSに皿から単一の蚊を転送する。チルドペトリ皿で​​覆われた他人のままにしておきます。 </li><li style="tab-stops: list .5in">先の細いピンセットを用いて、胸部と後腹部で蚊を開催。腸が露出するまで離れて身体を引っ張る。 gut.The腸からの過剰な組織を除去するために鉗子を使用すると白、袋状のボディのように見えます。 gut.Mountからマーキュロクロム0.2％の5〜10μlの12ウェルスライドガラスと浸すの1つのウェルで腸の過剰な組織を削除します。スカッシュ他の蚊の湿った紙towel.Continueで死体と破棄を12ウェルスライドが一杯になるまで。ガラスのカバースリップでマウントされている内臓をカバーしています。 </li><li style="tab-stops: list .5in">かすかな/クリアピンクの腸組織に対する明るいピンクに染色ラウンドオーシストを探して、光学顕微鏡下で内臓を調べる。 、オーシストを数えて記録し、次のサンプルに進んでください。すべての実験的な治療から、蚊のすべてのために継続する。 </li><li style="tab-stops: list .5in">終わったら、ペーパータオルできれいにスライドさせ拭いてください。小さなバイオハザードバッグに、ガッツとペーパータオル、と死骸とペーパータオルを置き、ゴミ箱に捨てます。手袋は、作業中は身に着けられている。ケアは、感染蚊のエスケープを聞かせしないように注意しています。 </li></ol>

<ol><li>Avila, S. L., Ferreira, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Malaria+diagnosis%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Braz+J+Med+Biol+Res%22%5BJournal%5D)">Malaria diagnosis: a review.</a> Braz J Med Biol Res. 29 (4), 431-443 (1996).</li>
<li>Bell, A. S., Ranford-Cartwright, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+real-time+PCR+assay+for+quantifying+Plasmodium+falciparum+infections+in+the+mosquito+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Parasitol%22%5BJournal%5D)">A real-time PCR assay for quantifying Plasmodium falciparum infections in the mosquito vector.</a> Int J Parasitol. 34 (7), 795-802 (2004).</li>
<li>Collins, K. M., Hochberg, L. P., Ryan, P. R., Collins, W. E., Wirtz, R. A., Ryan, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+Plasmodium+malariae+infection+in+mosquito+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Trop+Med+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Quantification of Plasmodium malariae infection in mosquito vectors.</a> Ann Trop Med Parasitol. 98 (5), 469-472 (2004).</li>
<li>Czeher, C., Labbo, R., Djibrilla, A., Here, L., Arzika, I., Duchemin, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ELISA+study+of+oocyst-sporozoite+transition+in+malaria+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Parasite%22%5BJournal%5D)">ELISA study of oocyst-sporozoite transition in malaria vectors.</a> Parasite. 13 (3), 257-261 (2006).</li>
<li>Haghdoost, A. A., Mazhari, S., Bahadini, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparing+the+results+of+light+microscopy+with+the+results+of+PCR+method+in+the+diagnosis+of+Plasmodium+vivax%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vector+Borne+Dis%22%5BJournal%5D)">Comparing the results of light microscopy with the results of PCR method in the diagnosis of Plasmodium vivax.</a> J Vector Borne Dis. 43 (2), 53-57 (2006).</li>
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<li>Osta, M. A., Christophides, G. K., Kafatos, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+mosquito+genes+on+Plasmodium+development%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Effects of mosquito genes on Plasmodium development.</a> Science. 303 (5666), 2030-2032 (2004).</li>
<li>Srinivasan, P., Abraham, E. G., Ghosh, A. K., Valenzuela, J., Ribeiro, J. M., Dimopoulos, G., Kafatos, F. C., Adams, J. H., Fujioka, H., Jacobs-Lorena, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+Plasmodium+and+Anopheles+transcriptomes+during+oocyst+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Analysis of the Plasmodium and Anopheles transcriptomes during oocyst differentiation.</a> J Biol Chem. 279 (7), 5581-5587 (2004).</li>
</ol>

さまざまな手法に従うことがマラリアの感染症や感染症表現型の決定と異なるラボでのいくつかのバリエーションがある場合もあります。

蚊と感染症の表現型決定における熱帯熱マラリア原虫の感染症のためのプロトコル

Protocol for Plasmodium falciparum Infections in Mosquitoes and Infection Phenotype Determination

遺伝子がマラリアのための潜在的に耐火として識別されると、それは蚊の中マラリア原虫の感染症の予防にその役割を評価する必要があります。このプロトコルは、蚊のマラリア原虫の感染の程度をアッセイする方法を示します。生殖母体の文化、膜の給餌蚊ヒト血液、及び蚊の中腸におけるウイルス力価を測定することを準備するための技術が実証されています。

ある遺伝子がマラリアに対して耐性を持つ可能性があると特定された場合、...内におけるプラスモディウム（Plasmodium）感染の防止におけるその役割について評価しなければなりません。

ジョンズ・ホプキンス公衆衛生大学院マラリア研究所のジョージ・ディモプロスです。今回は、アノフェレス・ガンビア蚊にPlasmodium falciparum原虫を感染させる手順と、蚊の中腸における感染表現型を判定する方法について説明します。本手順で必要となる基本設備は、原虫培養用のCO2インキュベーターです。CO2インキュベーターがない場合は、キャンドルジャーで代用可能です。もちろん、昆虫飼育室に加え、解剖顕微鏡や光学顕微鏡などの標準的な分子生物学および細胞生物学の設備も必要です。また、恒温水槽、蚊用膜給餌システム、および遠心機が必要です。こんにちは、私はGeorge Depos博士の研究室でポストドクターを務めているISHです。そして私は、博士課程の学生であるLindsay Garverです。プラスマ感染の最初のステップは、プラスマ培養液を準備することです。二酸化炭素インキュベーターがない場合は、キャンドルジャーを使用できます。6ウェルプレートにガトセット培養液を入れてジャーに入れ、キャンドルに点火してからジャーを密閉してください。最初のステップとして、新鮮なヒト全血と血清を用意し、まず37°Cの水槽に入れて融解させるとともに、十分な温度に温めておきます。血清と血液は十分に温まっている必要があるためです。血液を準備するには、新鮮なヒト血を適切な容器に分注します。次に、新鮮血を2000 RPMで5分間遠心分離し、赤血球を沈殿させます。遠心分離後、上清を廃棄し、赤血球（RBC）である赤色ペレットをヒト血清で3回洗浄します。ペレットに等量のヒト血清を加え、混合した後、2000 RPMで5分間再び遠心分離します。この工程を3回繰り返します。最終的に、ガノート培養液に添加可能な赤血球ペレットが準備でき、完了となります。CO2インキュベーター内にあるプラスモジウム培養物は、RPMI培地で16日間維持し、16日目に感染させる準備が整います。プラスモジウム培養物を扱うため、すべての工程で細心の注意を払う必要があります。まず、寄生虫はBSL-2ラボで培養し、作業はフード内で行わなければなりません。ピペットチップおよびアペンドチューブのすべてはバイオハザード廃棄箱に廃棄し、その他の溶液やピペットマンなどは10%漂白剤で洗浄してください。また、必ず手袋と白衣を着用してください。16日目の培養では、ガラススライド上に血液を少量滴下して塗抹標本を作成し、ギムザ染色を行い、光学顕微鏡で観察します。16日目のガメトサイト培養液からGAMMATパーセンテージを決定できます。寄生虫を乱したり吸い込んだりしないよう注意して培地の大部分を除去します。寄生虫は容易にウェルの底に沈殿するため、残りの培地と寄生虫をピペッティングします。赤血球中の寄生虫を混合し、寄生虫を分離させます。その後、遠心分離機にかけ、2000 RPMで5分間遠心分離します。遠心分離後、寄生虫は赤血球とともにペレット（沈殿物）になります。上清はRPMI培地であり、底部のペレットに寄生虫が含まれています。RPMIである上清を除去し、赤血球とともに回収します。寄生虫と赤血球を乱さないよう、培地の取り扱いに注意してください。GIMs 10によって決定されるGATOTの割合は、通常2〜4%の範囲になります。その後、遠心分離後に赤血球と寄生虫の準備が整ったら、これらを混合し、最終的なGATOTの割合に基づいて添加すべき血液量を決定します。これは急性である必要があり、通常0.3〜1%の範囲となり、これがphys蚊の吸血に使用されます。Presidium S感染において、これはガラス製フィーダーであり、蚊の膜給餌に使用します。見える小さな穴から血液を注入し、内部に保持させます。底面の両側には2つのノズルがあり、これらは37 °Cに設定されたウォーターバスに接続されています。給餌用のフィーダーを準備するため、小さなアフィル（affil）片を用意します。両端および4つの側面からそれぞれ伸ばし、それをガラスフィーダーの開口部に装着して、皮膚を模した薄い膜状のシートを作成します。これが膜給餌（membrane feeding）と呼ばれる手法です。これは循環式恒温水槽であり、水温を37°Cに維持すると同時に、ガラスフィーダーに水を循環させることで、血液を37°Cの温かい状態に保ちます。そのため、小さなキャピラリーを介してガラスフィーダーを循環式恒温水槽に接続し、水槽の電源を入れることで水を循環させます。水と血液は別々のチャンバーに入っているため、混ざり合うことはありません。こちらはphis Gambi蚊が入った小さなカップです。まず、ガラス製フィーダーをケージに設置し、膜（フィルム）がメッシュネットと面一になるようにガラスフィーダーの上に重りを置きます。寄生虫を規定のガムボット比率で含有させた血液を約200 µLフィーダーに添加し、血液が底まで行き渡り、蚊が血液に到達できる状態であることを確認します。フィッティングを約30分間継続します。フィッティングが完了したら、ガラスフィーダーを10%漂白剤で十分に洗浄し、残りのメンブレンとテープをすべて剥がしてバイオハザード廃棄箱に廃棄します。吸血フィッティング後、吸血しなかった蚊を吸血した個体から取り除きます。この操作を行うため、吸血後の蚊が入った小型カップをコールドルームに5～10分間置き、蚊をノックダウンさせました。見ての通り、蚊は低温によって既に動かなくなっています。蓋を開け、蚊を小型のシャーレに移します。この際、蚊が常に低温に保たれ、逃げ出さないようにシャーレを氷バケツの上に置いておきます。これらの蚊はプラスモジウムに感染しているため、絶対に逃がさないよう細心の注意を払ってください。蚊をコールドルームに移動させた後、室温で維持されている通常の昆虫飼育室へ移します。ただし、蚊は常に氷バケツに入れたペトリ皿に入れておくことで、活動性を抑制し、常にダウンさせた状態に保ちます。ここで、給餌済みの蚊を未給餌の蚊からどのように分離できるかを確認してください。吸血済みの個体には血液が含まれています。これらは完全に膨満した状態です。一部の個体は部分的に吸血しているため、完全には膨満していません。腹部に少量の血液を持つ個体もいれば、大量の血液を持つ個体もいます。一方、未吸血の個体は腹部に血液を全く持っていないため、吸血個体と未吸血個体を非常に簡単に区別することができます。こちらが吸血済みの成雌蚊です。これらの蚊をペトリ皿からワックスライナー付きの紙コップに移します。吸血させた蚊をカップに入れた後、その後7日間のインキュベーション期間中に10% sucroseを摂取できるよう、10% sucroseに浸した小さな綿を入れます。また、カップ内の湿度を維持するために小さく折りたたんだペーパータオルを入れ、ペトリ皿で蓋をします。プラスモジウムに感染した蚊は別の小さなケージに入れ、二重の保護措置を講じた上で、27 °C、湿度80%に維持されたBSL-3ラボに設置します。吸血から7日後、昆虫飼育室の二重ケージボックス内で飼育していた蚊を回収し、ノックダウンさせるためにコールドルームへ移動させます。蚊をダウンさせた後、氷バケツの上に置いたペトリ皿に移します。これで蚊を解剖する準備が整いました。中腸を解剖し、シストを探します。最初のステップは、解剖顕微鏡にセットしたガラススライド上にPBSを100 µL添加することです。次のステップでは、ピンセットを使用します。ペトリ皿から蚊を1匹、解剖顕微鏡にセットしたガラススライド上のPBSへと移します。残りの個体は、冷却したペトリ皿に残しておきます。蚊を解剖するには、一方のピンセットで胸部を、もう一方のピンセットで後腹部を固定します。次に、中腸が露出するまで、ゆっくりと体を引っ張ります。白い袋状の組織のように見えます。ピンセットを使用して、過剰な組織やその他の部位を取り除きます。これが中腸です。白い袋のような形状をしており、内部に卵があります。この中腸を12ウェルガラススライドに移し、5～10 µLの0.2% microproに浸して中腸を固定し、スライドを回収します。カバーガラスを用いて、すべての感染蚊に対してこの操作を行います。中腸は明るいピンク色に見えます。このスライドを光学顕微鏡に移し、oocyst負荷量をカウントします。現在、感染蚊から摘出した中腸を観察しています。中腸は滑らかな形状をしており、ロマン染色（rom stain）を施すとごく淡いピンク色を呈します。O SSTは、淡いピンク色の中腸組織に対して鮮やかなピンク色に見えるはずです。これらの中腸は感染させた蚊から採取したものですが、SSTが認められないため、感染していない可能性があります。もし中腸が感染していれば、Sは小さな鮮やかなピンク色の円として現れ、単一の中腸内に22～500個もの多数のものが認められる場合もあります。本手順では、ヒト血液を plasmodium rum 原虫で感染させ、その感染血を Gambian mosquito に吸血させ、その後、蚊の中腸を摘出し、感染した中腸内の OSIS 数を測定しました。この手法は、実験室で再現可能なヒトマラリア伝播に最も近い近似モデルであるため、非常に重要です。

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生物学

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