機械的にダイナミックな細胞培養のための微細加工プラットフォーム

本実験の全体的な目的は、2次元および3次元の培養環境において細胞に機械的刺激を与えるためのデバイスを微細加工することです。これは、多層サンドイッチ成形および積層技術を用いて、垂直方向に作動するマイクロポストアレイを作製することで達成されます。第2のステップとして、この垂直作動マイクロポストアレイを修飾して培養フィルムを伸展させ、フィルム上で培養された細胞に高度に制御された歪みを加えます。

あるいは、細胞に機械的刺激を与えるために、マイクロパターン化されたバイオマテリアル構築物を圧縮するようにアレイを修正することも可能です。3次元ハイドロゲルのアレイで培養し、蛍光フィデューシャルマーカーの画像解析を行うことで、アレイ全体に2次元のエコー双軸方向および3次元の圧縮歪みが同時に適用されている結果が得られます。こんにちは。トロント大学の機械工業学部およびバイオマテリアル・生物医学工学研究所のCraig Simmons教授とU Sun教授の研究室に所属しているChris Mariahsです。

本日は、細胞に機械的な刺激を与えるためのマイクロデバイスを作製する手順をご紹介します。当研究室では、in vitro培養において細胞がさまざまな機械的力にどのように反応するかを研究するために、この手法を用いています。それでは、始めていきましょう。

サンドイッチモールドの作製プロセスでは、SU-8マスター上の未硬化ポリジメチルシロキサン（PDMS）の上にOHPフィルムを配置します。このサンドイッチ構造をフォームガラスと金属の積層体に入れ、オーブン内で加圧状態で硬化させます。最後に、積層体を分解してOHPフィルムを剥がすことで、パターン形成されたPDMS層を保持します。

この工程を開始するために、PDMS、モノマー、および架橋剤を十分に混合します。標準的な10:1の比率で、未硬化のPDMS混合液3 mLを、あらかじめ作製したSU-8マスター上に滴下し、真空チャンバー内でポリマーを脱気します。次に、フォームパッドとSU-8マスターをプレキシガラス製ベースプレート上に配置します。

気泡が混入しないように注意しながら、インクジェット用透過フィルムの平滑な面を未硬化のPDMSの上に慎重に載せます。次に、透過フィルムの上にシリコン処理を施したガラススライドを置き、2つ目のフォームパッドとプレキシガラス製トッププレートの下に配置します。Cクランプを使用して、これらを重ね合わせた状態で固定します。

PDMSサンドイッチを80°Cのオーブンで少なくとも4時間硬化させます。硬化後、サンドイッチをオーブンから取り出して冷却します。冷却後、クランプを取り外し、サンドイッチを分解します。

SU-8マスターから、パターン化したPDMSフィルムを保持したまま、透明フィルムを慎重に剥がします。パターンフィルムの端をトリミングして余分なPDMSを取り除き、使用するまでパターン層を防塵環境で保管します。本プロトコルの次のセクションでは、垂直駆動ポストのマイクロファブリケーションアレイの作製について説明します。

マイクロポストのアレイを作製するには、多層化プロセスが必要です。最下層のパターン化されたPDMS層は、サンドイッチ型モールド作製法によって準備します。本実験では、直径600から1,200 µmの円形パターンを使用しました。

PDMS層を清潔なガラススライドに転写するために、コロナ放電装置を用いてPDMS表面とガラス表面を酸素プラズマ処理します。次に、これら2つの表面を互いに接触させます。積層したものを80 °Cのホットプレートで10分間加熱し、接合工程を完了させます。

透明フィルムを剥がして廃棄します。この工程により、パターン形成されたPDMSフィルムが硬い基板から一度も離れないため、個々の層の収縮を防ぐことができます。2つ目のサンドイッチ成形層は、目的のダイアフラムおよびポスト構造のネガレプリカモールドとして形成されます。

本デモンストレーションでは、直径500 µmの円柱状ポストを使用してこの層を形成しました。まず、二面テープを用いてネガレプリカモールドをガラススライドに一時的に固定し、真空デシケーター内でシリコナイズした後、サンドイッチ状のモールド層上に未硬化のPDMSを堆積させます。脱泡後、1000 rpmで45秒間スピンコートし、厚さ60 µmの作動ダイヤフラムを作成します。スピンコートしたPDMS層を80 °Cで約20分間、あるいはPDMSに触れた際に粘着性はあるが永久変形しない状態になるまで部分的に硬化させます。その後、部分的に硬化させたPDMS層からガラススライドと二面テープを取り除き、透明フィルムを介して一対のガラスハンドリングスライドに固定し、プラズマ処理を行います。

部分硬化したPDMSを処理し、PDMSを反転させてカスタムメイドのアライナーに設置します。このアライナーは、マイクロマニピュレーターに取り付けられた真空チャックで構成されています。次に、1層目のPDMSをプラズマ処理し、真空チャックの下にある回転ステージ上に配置します。

アバター12倍ズームマシンビジョンシステムを用いて、2つの層の整合性を観察します。マニピュレーターを使用して層を合わせ、注意深く接触させます。指で軽く圧力をかけ、層を密着させます。

次に、アライナーからサンドイッチを取り出します。ガラスハンドリングスライドを取り除き、各層が完全に密着していることを確認します。80 °Cのオーブンでさらに30分間キュアリングを行います。

30分後、透明なシロキサン処理済みのレプリカPDMSモールドをデバイスから剥離して廃棄します。次に、変形する二次元基質上で培養された細胞を用いて実験を行うため、デバイスを80°Cで少なくとも4時間完全に硬化させます。その後、3層目のPDMS層をデバイスに接合して、マイクロアクチュエータアレイを修飾します。

3層目のPDMS層は、2つの層からなる構造で構成されています。下の円は、駆動マイクロポストの下にあるアクチュエーションキャビティのサイズと一致しています。上の円の直径は、ローディングポストの直径よりも100 µm大きくなっています。

幅 200 micron のマイクロチャネルがこれらの構造を接続領域に結びつけており、ローディングポストと培養フィルムの潤滑に使用されます。2D培養用にデバイスを改造するには、まず書面によるプロトコルに従ってコネクタを作製し、デバイスに接合します。次に、透明フィルムの平滑な面に 10 to 15 micron の厚さの PDMS をスピンコートし、硬化させます。

薄いPDMSフィルムを80°Cで少なくとも4時間加熱します。次のステップは、アクチュエータに真空を印加し、PDMS層をデバイスに接合することです。これを実現するために、

まず、アクチュエータに低真空をかけ、プラズマ処理および接合を行ったポストアレイを下降させます。記述されたプロトコルに従ってスピンコートされたPDMSフィルムを駆動マイクロデバイスに接合すると、ポストと培養フィルムは短時間親水性を維持します。その後、潤滑剤シリンジをデバイスに接続し、潤滑チャネルを脱イオン水で希釈した90% glycerol溶液で満たします。

この処方は、潤滑に加えて、PDMSの親水性を永続的に維持し、摩擦係数を低減させます。デバイスを40 °Cのホットプレート上に置き、チャンネルに潤滑剤を注入し続け、わずかに圧力を上昇させます。数分後、気泡がPDMS内に拡散し、すべての表面が潤滑されます。

最終ステップとして、メスを用いてポストを固定している陰圧を解除します。薄いPDMSフィルムの周囲を切り離します。デバイスのプラズマ接合部から、透明な支持フィルムを慎重に剥がしてください。

デバイスの培養領域の周囲に、手で切り出したPDMSガスケットを配置します。デバイスを70% ethanolに5分間浸漬し、その後バイオセーフティーキャビネット内で殺菌用UVライトを45分間照射して滅菌します。表面をプラズマ処理し、100 µg/mLのコラーゲンとともに4 °Cで一晩インキュベートします。

一晩インキュベートした後、デバイスを滅菌したリン酸緩衝生理食塩水（PBS）で洗浄し、1平方センチメートルあたり10,000～15,000個の細胞を播種します。標準的な細胞培養プロトコルに従い、このマイクロアクチュエータアレイを改変して、3次元光パターニングハイドロゲル構造体内で培養した細胞の実験を行うことができます。まず、多層PDMSベースのプラットフォームを作製します。

ベースプラットフォームをメチル基で覆った後、関連するガラスカバースリップハイドロゲル前駆体溶液を注入します。次に、光重合可能なバイオマテリアルをアレイ内にマイクロパターニングし、残った前駆体溶液を洗浄して取り除きます。これにより、垂直方向に作動するローディングポストのアレイを用いて、3次元バイオマテリアル内で培養された細胞に圧縮機械力を加えることが可能になります。ポスト周囲の領域をスコッチテープでマスキングし、PDS 2010 LabCoater 2システムを用いてデバイスをパリレンCでコーティングします。

これにより、バイオマテリアルシステムの重合速度が向上します。コーティング後、デバイスをコーティングシステムから取り出し、スコッチテープを剥がすと、ポストの上にパリレンCのコンフォーマル層が残ります。その後、95%エタノールで希釈した2% volume per volumeのトリメトキシプロピルメタクリレート溶液に2分間浸漬し、ACRLガラスカバースリップをメタクリル化します。

カバーを洗浄します。100% ethanolに浸した後、100 °Cでベーキングし、表面にメタクリレート基を残します。厚さ200 micronのPDMSスペーサーをキャストします。

ペトリ皿内でフィルムを成形し、小さなセクションに切り分けます。これらの小さなセクションの4つを、meac関連のカバースリップの縁にプラズマ接合させます。次に、Lene Cコーティングされた領域を覆うように、これらの間隔をデバイスのPDMS領域にプラズマ接合させます。

最後に、デバイスを70%エタノールで洗浄し、バイオセーフティキャビネット内で殺菌剤またはUVライトに45分間曝露させて滅菌します。細胞含有PEGハイドロゲルをデバイス内にフォトリソグラフィでパターニングします。書面によるプロトコルに従って前駆体および光開始剤溶液を調製し、これらを十分に混合して、光開始剤濃度が0.4% w/vの溶液を得ます。

混合物を0.45 µmのシリンジフィルターでろ過して滅菌し、粒子を除去します。次に、トリプシンで細胞培養物を剥離し、目的の最終細胞濃度の2倍の濃度で培地中に細胞懸濁液を調製します。その後、細胞懸濁液とろ過済みのハイドロゲル前駆体光開始剤溶液を1:1の比率で混合します。25ゲージの長い針を用いて、この溶液をマイクロデバイスに注入します。

デバイス内に気泡が閉じ込められないように注意してください。印刷された透過マスクを、デバイス表面のアライメントマークに合わせて配置します。デバイス表面に波長365 nanometerのUVを17.5 milliwatt per square centimeterの強度で照射できるよう、UV照明システムをセットアップします。

マスクを通してハイドロゲルを195秒間光照射します。未重合のハイドロゲル前駆体溶液をPBSで洗浄し、PBSを培地に交換して、ローディングポストを動作させてハイドロゲル構造体を圧縮します。ここでは、2Dメカノ刺激培養用に完成したサンプルデバイスを示しています。

作動圧力供給チャネルのマーキングには赤色染料が、潤滑チャネルの歪み特性評価のマーキングには青色染料が使用されます。基板上の蛍光ビーズの動きを追跡することで、印加された歪み場を決定する実験を行うことができます。赤色の点はビーズの変形前の位置を、緑色の点は変形後の位置を表しています。

3次元圧縮実験用のサンプルデバイスがここに示されており、緑色の染料でアクチュエーション圧力チャネルがマークされています。マイクロポストアレイを俯瞰すると、ポスト上にパターン形成されたハイドロゲル構造体が見えます。ハイドロゲル構造体内の蛍光ビーズを再構成した側面画像により、静止状態および55 kilo pascalのアクチュエーション圧力下における、3次元培養システムでのひずみ特性評価プロセスが示されています。

以上で、2次元または3次元の培養システムにおいて細胞を機械的に刺激するために使用されるデバイスの作製方法について説明しました。この手順を行う際は、デバイスを可能な限り清潔に保ち、埃が付着しないようにすること、そして特にアライメントの工程においては根気強く取り組むことが重要です。以上となります。

ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りしております。