機械的にダイナミックな細胞培養のための微細加工プラットフォーム

本実験の全体的な目的は、2次元および3次元の培養環境において細胞を機械的に刺激するために使用されるデバイスを微細加工することです。これは、多層サンドイッチ成形および積層技術を用いて、垂直に作動するマイクロポストのアレイを作製することで達成されます。第二のステップとして、垂直作動マイクロポストアレイを модиfy し、培養フィルムを伸展させることで、フィルム上で培養された細胞に高度に制御された歪みを適用します。

あるいは、アレイを改造してマイクロパターン化されたバイオマテリアル構造体を圧縮し、細胞に機械的刺激を与えることも可能です。3次元ハイドロゲルのアレイ内で培養し、蛍光フィデューシャマーカーの画像解析を行うことで、アレイ全体に2次元の等方性二軸方向および3次元の圧縮ひずみの範囲を同時に適用できることが示されています。こんにちは。トロント大学の機械・産業工学科およびバイオマテリアル・生物医学工学研究所のCraig Simmons研究室およびU Sun研究室のChris Mariahsです。

本日は、細胞に機械的な刺激を与えるためのマイクロデバイスを製作する手順をご紹介します。当研究室では、in vitro培養において細胞がさまざまな機械的な力にどのように反応するかを研究するために、この手法を用いています。それでは、始めていきましょう。

サンドイッチモールドの作製工程では、SU-8マスター上の未硬化ポリジメチルシロキサン（PDMS）の上にオーバーヘッド transparencies（OHPフィルム）を配置します。このサンドイッチ構造をフォームガラスと金属のスタックに挟み、オーブン内で圧縮しながら硬化させます。最後に、スタックを分解してOHPフィルムを剥がすことで、パターン形成されたPDMS層が得られます。

この工程を開始するために、PDMSモノマーと架橋剤を十分に混合します。標準的な10対1の比率で、未硬化のPDMS混合液3 mLを、あらかじめ作製したSU-8マスター上に滴下し、真空チャンバー内でポリマーを脱ガスします。次に、フォームパッドとSU-8マスターをプレキシガラス製ベースプレート上に配置します。

インクジェット用透明フィルムの平滑な面を、気泡が混入しないように注意しながら、未硬化のPDMS上に慎重に載せます。次に、透明フィルムの上にシルラン化したガラススライドを配置し、2枚目のフォームパッドとプレキシガラス製トッププレートの下にセットします。Cクランプを用いて、このサンドイッチ構造を固定します。

PDMSサンドイッチをオーブンに入れ、80 °Cで少なくとも4時間硬化させます。硬化後、サンドイッチをオーブンから取り出し、冷却します。冷却後、クランプを外してサンドイッチを分解します。

SU-8マスターから透明フィルムを慎重に剥がし、パターン形成されたPDMSフィルムを保持します。パターンフィルムの端をトリミングして過剰なPDMSを除去し、使用するまでパターン層をクリーン環境で保管します。本プロトコルの次のセクションでは、垂直駆動ポストのマイクロファブリケーションアレイの作製について説明します。

マイクロポストのアレイを作製するには、多層積層プロセスが必要です。最下層のパターン化されたPDMS層は、サンドイッチ型金型による作製法で準備します。本実験では、直径600から1,200µmの円形パターンを使用しました。

PDMS層を清潔なガラススライドに転写するために、コロナ放電装置を用いてPDMS表面とガラス表面を酸素プラズマで処理します。次に、2つの表面を互いに接触させます。積層したものを80 °Cのホットプレート上に10分間置き、接合プロセスを完了させます。

透明フィルムを剥がして廃棄します。この工程により、パターン形成されたPDMSフィルムが硬い基板から外れることがなくなり、各層の収縮を防ぐことができます。2番目のサンドイッチ成形層は、目的とするダイアフラムおよびポスト構造のネガレプリカ金型として形成されます。

本実演では、直径500 µmの円柱状のポストを用いてこの層を形成しました。まず、ネガレプリカ金型を両面テープでガラススライドに一時的に固定し、真空デシケーター内で脱気しながら、金型層となるサンドイッチ状の構造上に未硬化のPDMSを堆積させます。45秒間、1000 rpmでスピンコートし、厚さ60 µmの作動ダイヤフラムを形成します。スピンコートしたPDMS層を80 °Cで約20分間、またはPDMSが粘着性を持ちつつも触れた際に永久変形しない状態になるまで部分的に硬化させます。その後、部分的に硬化したPDMS層からガラススライドと両面テープを取り除き、透明フィルムを介して一対のガラスハンドリングスライドに固定してプラズマ処理を行います。

部分的に硬化したPDMSを処理し、PDMSを反転させてカスタムメイドのアライナーに配置します。アライナーは、マイクロマニピュレーターに取り付けられた真空チャックで構成されています。次に、1層目のPDMSをプラズマ処理し、真空チャック下の回転ステージ上に配置します。

アバター12倍ズームマシンビジョンシステムを用いて、2つの層のアライメントを確認します。マニピュレーターを使用して層を整列させ、慎重に接触させます。指で軽く圧力を加え、層を密着させます。

次に、アライナーからサンドイッチを取り出します。ガラス製ハンドリングスライドを取り除き、各層が完全に密着していることを確認してください。80 °Cのオーブンでさらに30分間キュアリング（硬化）させます。

30分後、透明なシリコン化したレプリカPDMSモールドをデバイスから剥がして廃棄します。その後、変形する二次元基板上で培養された細胞を用いて実験を行うため、デバイスを80 °Cで少なくとも4時間完全に硬化させます。マイクロアクチュエータアレイは、デバイスに3層目のPDMS層を接合することで修飾します。

3層目のPDMSレイヤーは、2層構造で構成されています。下の円は、駆動マイクロポストの下にある駆動キャビティのサイズと一致させてください。上の円の直径は、ローディングポストの直径よりも100 microns大きく設定します。

幅 200 micron のマイクロチャネルがこれらの構造を接続領域へと結んでおり、ローディングポストと培養フィルムの潤滑に使用されます。デバイスを 2D 培養用に変更するには、まず書面によるプロトコルに従ってコネクタを作製し、デバイスに接合します。次に、透明フィルムの平滑な面に 10 to 15 micron の PDMS 層をスピンコートし、硬化させます。

薄いPDMSフィルムを80 °Cで少なくとも4時間加熱します。次のステップは、アクチュエータに真空を印加し、PDMS層をデバイスに接合することです。これを達成するために、

まず、アクチュエータに低真空を印加し、プラズマ処理および接合を行うポストアレイを下降させます。記述プロトコルに従って、アクチュエータ付きマイクロデバイスにPDMSフィルムをスピンコートすると、ポストと培養フィルムは短時間、親水性を維持します。次に、潤滑剤用シリンジをデバイスに接続し、潤滑チャネルを90% glycerol（脱イオン水溶液）で満たします。

この処方は、潤滑作用に加えてPDMSの親水性を永続的に維持し、摩擦係数を低減させます。デバイスを40 °Cのホットプレートに置き、チャンネル内に潤滑剤を注入し続け、わずかに圧力を上昇させます。数分後、気泡がPDMS中に拡散し、すべての表面が潤滑されます。

最終ステップとして、メスを用いてポストの陰圧を解除します。薄いPDMSフィルムの周囲を切り離します。デバイスのプラズマ接合部から、透明なバッキング材を慎重に剥がしてください。

デバイスの培養領域の周囲に、手で切り出したPDMSガスケットを配置します。デバイスを70% ethanolに5分間浸漬して滅菌し、続いて生物学的安全キャビネット内で殺菌用UVライトを用いて45分間処理します。表面をプラズマ処理し、100 µg/mLのcollagenとともに4 °Cで一晩インキュベートします。

一晩インキュベートした後、デバイスを滅菌リン酸緩衝生理食塩水（PBS）で洗浄し、1平方センチメートルあたり10,000〜15,000個の細胞を播種します。標準的な細胞培養プロトコルに従い、マイクロアクチュエータアレイを改変することで、3次元フォトパターニング・ハイドロゲル構造体で培養した細胞の実験を行うことができます。まず、多層PDMSベースのプラットフォームを作製します。

ベースプラットフォームをメッシュで覆った後、関連するガラスカバースリップハイドロゲル前駆体溶液を注入します。次に、光重合可能なバイオマテリアルをアレイにマイクロパターニングし、残りの前駆体溶液を洗い流します。これにより、垂直に作動するローディングポストのアレイを用いて、3次元バイオマテリアル内で培養された細胞に圧縮機械力を加えることができます。ポスト周囲の領域をスコッチテープでマスキングし、PDS 2010 lab COTER twoシステムを用いてデバイスをパリレンCでコーティングします。

これにより、バイオマテリアル系の重合速度が向上します。コーティング後、デバイスをコーティングシステムから取り出し、スコッチテープを剥がして、ポスト上にパリレンCのコンフォーマル層を残します。次に、ACRLガラスカバースリップを、95%エタノールで調製した2% volume per volumeのトリメトキシプロピルメタクリレート溶液に2分間浸漬してメチル化します。

カバーをすすぎます。100% ethanolに浸した後、100 °Cで加熱し、表面にメタクリレート基を残します。厚さ200 micronのPDMSスペーサーをキャストします。

ペトリ皿にフィルムを敷き、それを小さなセクションに切り分けます。これらの小さなセクションのうち4つを、meac関連のカバースリップの縁にプラズマボンドします。次に、Lene CでコーティングされたデバイスのPDMS領域を覆うように、それらの隙間をプラズマボンドします。

最後に、デバイスを70%エタノールで洗浄し、生物学的安全キャビネット内で殺菌剤またはUVライトに45分間曝露させて滅菌します。細胞含有PEGハイドロゲルをフォトリソグラフィによってデバイス内にパターン形成します。記載のプロトコルに従って前駆体および光開始剤溶液を調製し、それらを十分に混合して、光開始剤濃度が0.4% w/vの溶液を得ます。

混合物を0.45 µmのシリンジフィルターでろ過して滅菌し、微粒子を除去します。トリプシンを用いて細胞を剥離し、目的の最終細胞濃度の2倍の濃度になるよう、培養液中で細胞懸濁液を調製します。次に、細胞懸濁液とろ過済みのハイドロゲル前駆体光開始剤溶液を1:1の比率で混合します。25Gの長針を用いて、この溶液をマイクロデバイスに注入します。

デバイス内に気泡が混入しないよう注意してください。印刷された透過マスクをデバイス表面のアライメントマークに合わせて配置します。UV照射システムをセットアップし、デバイス表面に波長 365 nanometer、強度 17.5 milliwatt per square centimeter のUV線量を照射するように設定します。

照射後、マスクを通してハイドロゲルを195秒間露光します。未重合のハイドロゲル前駆体溶液をPBSで洗い流し、PBSを培地に交換して、ローディングポストを動作させハイドロゲル構造体を圧縮します。ここでは、2Dメカノ刺激培養用に完成したサンプルデバイスを示します。

駆動圧供給チャネルのマーキングには赤色染料が使用され、潤滑チャネルの歪み特性評価には青色染料が使用されます。基材上の蛍光ビーズの移動を追跡することで、印加された歪み場を決定する実験が可能です。赤色の点はビーズの変形前の位置を、緑色の点は変形後の位置を表しています。

3次元圧縮実験用のサンプルデバイスがここに示されており、緑色の染料を用いて作動圧チャンネルが標識されています。マイクロポストアレイを上から見た図では、ポストの上にパターン形成されたハイドロゲル構造体が見え、その側面の再構成画像にはハイドロゲル構造体内の蛍光ビーズが示されています。静止状態および55 kilo pascalの作動圧下での様子は、3次元培養システムにおける歪み特性評価プロセスを実証しています。

以上で、2次元または3次元の培養システムにおいて細胞を機械的に刺激するために使用するデバイスの作製方法について説明しました。この手順を行う際は、デバイスを可能な限り清潔に保ち、埃が入らないようにすること、そして特にアライメントの工程において根気強く作業することが重要です。これで完了です。

ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りいたします。