Name: 抗原特異的インビボでのキリングアッセイ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-11-09T17:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 49 s
Description: 学ぶCFSE標識を用いたマウスインビボ細胞傷害アッセイで、抗原特異的CD8+T細胞の機能的質を評価する方法。フローサイトメトリー解析により細胞傷害活性を定量化し、免疫応答の質を正確に測定できます。

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私は免疫学的アッセイやマウス操作に私を導入するためビアンカMOTHE、カルラOseroff、とマリー=フランスDelGuercioに感謝したいと思います。 GAスプリッタのラボでの作業は、NIHの助成金1 - RO1 - AI - 073558、GLRCE助成1 - U54 - AI - 057153、およびBARD US - 3829から06によって運営されている。

1。予防接種によってターゲット固有のエフェクターCTLを誘発する（0日） <ol><li>ターゲットシステム：開始する前に、特定のエフェクターを決定するとき。 in vivoで CTLアッセイにおける古典のこの例では、我々は特異的CD8 + T細胞を誘発するために精製されたペプチドの予防接種を使用します。ターゲットシステム：同ペプチドは特定のエフェクターを作成し、同系の標的細胞をパルスするために使用されます。また、あなたの特定のエフェクタと目標を得るために全体の病原体やタンパク質を使用することもできます。 </li><li>注射の無菌性を確保するためにバイオセーフティフードの作業面の内側を除染。最初の2 mL試験管に含まれているPBS /マウスに100μLの10％DMSOにペプチドを精製した50μgのを配置することにより、ペプチド免疫を準備します。次に、混合するための1ミリメートルビーズで、最大0.2 mLのマークに非常に冷たい不完全フロイントアジュバントを等量を追加し、。この点から、注入するまで氷上に免疫を保つ。パラフィルムでふたを固定します。 </li><li>速やかに混合後、氷上に戻って乳剤を配置、3分間エマルジョンを混合するために最大のRPMに設定ビーズビーターを使用してください。得られたエマルジョンは、一貫性のマヨネーズのようになります。エマルジョンは、任意の分離が明記されている場合、さらにミキシング、（最大週まで）時間が許せば℃で一晩4℃で座ってすることができます。 </li><li>どんなビーズをプルアップしないように注意して乳剤をプルアップするために1 mLの注射器と20ま​​たは20.5ゲージの針を使用してください（ビーズは針のゲージよりも大きくなるが、それでも知っておく必要があります）。 </li><li>尾の基部に皮下注射のための安全なマウス。我々は安全に優しく注射のためにマウスを固定化するように変更プラスチック50 mLコニカルチューブを使用してください。エマルジョンの0.2 mLでマウスを注入する。 </li></ol> 2。収穫標的細胞（8日目） <ol><li>あなたの標的細胞に対してナイーブ同系マウスが必要になります。 AAALACの基準にしたがってナイーブマウスを安楽死させる。 </li><li>マウスの毛や他の外部の汚染物質からの汚染の可能性を最小限に抑えるために70％エタノールを噴霧することにより、マウスを消毒する。 </li><li>解剖鋏を使用すると、マウスの左側に皮膚を通して小さなスニップを行います。腹膜嚢と内臓を明らかに皮膚のフラップを上に引き出します。 </li><li>腹膜を介して切り取り、基盤となる臓器のいずれかを妥協しないように注意している。脾臓は、表面に近く、色の肝臓（暗赤色）に似ていますが、小さいと形でより多くの腎臓のBeanです。感染マウスは、一般的に感染していないコントロールよりも顕著に大きい脾臓を示しています。 </li><li>慎重になるよう最大の細胞数を回復するために複数の断片に脾臓を壊さないように穏やかなものに注意しながら、脾臓を引き出します。すぐに氷上に準備したメディアの10 MLSを含む15 mLコニカルに脾臓を置きます。残りのマウスに進みます。 </li><li>ガラスの組織グラインダーに15 mLコニカルチューブ（メディアおよび脾臓）の内容を注ぐ。アッパーアームの強度を十分に使用して脾臓を挽く。すべての組織がその色を失ったときは、結合組織の外のすべてのセルを回復していると仮定してよい。 </li><li> 50 mLコニカルチューブに70μmのセルのフィルターを通してグラインダーの内容を注ぐ。新鮮な培地でグラインダーをすすぎ、セルストレーナーを通して注ぎます。 </li><li> 4℃遠心° C、7分1300 RPM。上清を捨て。 </li><li> 7分37℃で調製した溶解試薬とインキュベート10 MLSに再懸濁します。 </li><li>上記と同じ、新鮮な培地と遠心で50 MLSまで追加。 </li><li> （洗浄ステップ）上記と同じ、50mlの新鮮な培地と遠心分離機で懸濁します。 *注：純粋な標的細胞の集団が、レシピエントマウスへの伝達のために望まれている場合は、この時点で、特定の細胞型（すなわちマクロファージ）のための磁気細胞分離を行うことができます。また、この時点では、セル固有の殺害にその治療の影響を研究するために、文化に実験的治療を導入することもできます。 </li><li>プレート治療を96ウェル丸底の組織培養で100μLに1ウェルあたりの細胞とプレート1 × 10 7を数える。 *これは、細胞/ウェルの高濃度ですが、アッセイは迅速なものであるため、我々はこの濃度で細胞の生存率には損失を見たことがありません。 </li></ol> 3。標的細胞の治療とラベリング<ol><li>パルス適切な細胞と病原体の特定のペプチドまたは無関係なペプチドの制御と複製すると、1μg/ mlのペプチドを追加。 1.5時間4℃でインキュベートする。最後の30分間37℃のインキュベーターに移動​​します。この時間の間にCFSEの試薬を準備する。 </li><li>製造業者の仕様に従ってCFSEを準備し、0.5〜25μMの間に仕事上の濃度に希釈する。 "高"濃度CFSEよりも低い"低"濃度が10倍にします。たとえば、[低]に10 MLS PBSに0.5μLCFSEを追加し、[高]のために、10mlのPBSに5μLCFSEを追加。 37〜暖かい準備CFSE ° Cラベリングの前に。 </li><li>インキュベーターとpからの細胞のプレートを取り外します室温での高速遠心分離機、7分1300 RPMでエレト。上清を除去するフリック。 </li><li> 37℃で15分間対応するウェルでインキュベートするための適切な試薬200μLを加えることによってどちらかの[低]または[高] CFSE℃で再懸濁し、細胞</li><li> 7分間、室温、1300 RPMのインキュベーターと再びペレットからの細胞のプレートを取り外します。上清を除去するフリック。 </li><li> 37℃で30分間、200μL/ウェル暖め新鮮な培地とインキュベートで再懸濁し、細胞を℃に</li><li> 7分間、室温、1300 RPMでのインキュベーターとペレットからの細胞のプレートを取り外します。上清を除去するフリック。 </li><li> 100μL/ウェルのPBSに再懸濁し、細胞。 </li><li>養子移入のために、うまくつのマウスごとにも[高]標識された細胞への[低]というラベルの付いたセルを追加します。注入の結果は、0.2 MLSの50％具体的な目標と50％無関係のセルでなければなりません。 </li><li> （図1を参照）データの解析中に、フローサイトメーターで実行されているため、非転送コントロールとして動作するいくつかの標識された細胞を取っておくことを忘れないでください。 </li></ol> 4。養子免疫伝達<ol><li>以前にペプチド免疫したマウスを麻酔（このプロトコールの一部＃1から）AAALACの基準によると。 </li><li>レシピエントマウスに眼窩経路を介して標識した標的細胞の0.2 MLSを注入する。 </li><li>レシピエントマウスを安楽死する前に6時間または他の所定の最適な時間を待つ。 </li></ol> 5。収穫標識細胞 *注：5.11を介してステップ5.1ステップ2.11を介して2.1と同じである<ol start="12"><li> 96ウェル丸底の組織培養処理されたプレートに100μLの1 × 1ウェルあたり10 6で細胞とプレートを数える。 </li><li>すべてのウェルに1％パラホルムアルデヒドの最終濃度に100μLの2％のパラホルムアルデヒドを添加することにより回収し、非導入細胞を修正。 </li></ol> 6。フローサイトメトリーおよびデータ解析<ol><li>フローサイトメーターでサンプルを実行し、データを分析する。 </li></ol> 7。代表的な結果結果として得られるヒストグラム上で逓減エピトープの特定のピークは、細胞特異的殺（図1）の指標です。細胞特異的溶解の実際の値を決定するには、次の式を（表1に適用される）を使用します。 比=関連性のない割合：エピトープ特異的割合（[低]ピーク：[高]ピーク）、 パーセント特異的溶解= [1 - （非転送制御率/実験比）] × 100 <img src="/files/ftp_upload/2250/2250fig1.jpg" alt="図1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図1"> 図1。 BALB / cマウスの脾細胞を回収した。番号のCFSEのプロファイルは、ハイまたはローCFSEの表現型の細胞の割合を示している。 A）コントロールを非譲渡。 [低] CFSEのピークは無関係のペプチドをパルスしたターゲットを表す一方、すべての[高] CFSEのピークは、エピトープの特定の標的細胞を表しています。 B）CFSE標識された細胞は、PBS免疫レシピエントマウス（コントロール）から回収。 C）二つの異なるペプチドの特定のレシピエントマウスから回収したCFSE標識された細胞は、減少したエピトープの特定のピークに注意してください。 <img src="/files/ftp_upload/2250/2250fig2.jpg" alt="図2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図2"> 図2。分析したデータのグラフィカル表現。3つのデータ点は、マウスの各グループ、PBS、ペプチドA、およびペプチドBで示すように<table border="1"><tbody><tr><td> サンプル </td><td> CFSE HIGH％のエピトープは、パルス </td><td> 無関係なCFSE LOW％ </td><td> 高：低比 </td><td> パーセントのエピトープ特異的殺害 </td></tr><tr><td> PBS </td><td> 42.8 </td><td> 57.2 </td><td> 1.34 </td><td> 16.97 </td></tr><tr><td> PBS </td><td> 43.1 </td><td> 56.9 </td><td> 1.32 </td><td> 15.94 </td></tr><tr><td> PBS </td><td> 44.3 </td><td> 55.7 </td><td> 1.26 </td><td> 11.74 </td></tr><tr><td>ペプチド</td><td> 39.7 </td><td> 60.3 </td><td> 1.52 </td><td> 32.56 </td></tr><tr><td>ペプチド</td><td> 38.6 </td><td> 61.4 </td><td> 1.59 </td><td> 35.61 </td></tr><tr><td>ペプチド</td><td> 40.6 </td><td> 59.4 </td><td> 1.46 </td><td> 29.99 </td></tr><tr><td>ペプチドB </td><td> 38.7 </td><td> 61.3 </td><td> 1.58 </td><td> 24.68 </td></tr><tr><td>ペプチドB </td><td> 38.5 </td><td> 61.5 </td><td> 1.60 </td><td> 25.32 </td></tr><tr><td>ペプチドB </td><td> 39.3 </td><td> 60.7 </td><td> 1.54 </td><td> 22.76 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> PBS NTのコントロール</td><td> 47.4 </td><td> 52.6 </td> 1.11 <td></td></tr><tr><td>ペップNTのコントロール</td><td> 49.4 </td><td> 50.6 </td><td> 1.02 </td><td></td></tr><tr><td>ペップB NTのコントロール</td><td> 45.6 </td><td> 54.4 </td><td> 1.19 </td><td></td></tr></tbody></table> 表1。代表的なデータの分析。"NT"は、非転送です。

<ol><li>Blattman, J. N., Wherry, E. J., Ha, S. J., van der Most, R. G., Ahmed, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+epitope+escape+on+PD-1+expression+and+CD8+T-cell+exhaustion+during+chronic+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Impact of epitope escape on PD-1 expression and CD8 T-cell exhaustion during chronic infection.</a> J Virol. 83 (9), 4386-4394 (2009).</li>
<li>Jenkins, M. R., Tsun, A., Stinchcombe, J. C., Griffiths, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+strength+of+T+cell+receptor+signal+controls+the+polarization+of+cytotoxic+machinery+to+the+immunological+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">The strength of T cell receptor signal controls the polarization of cytotoxic machinery to the immunological synapse.</a> Immunity. 31 (4), 621-631 (2009).</li>
<li>Ingulli, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracing+tolerance+and+immunity+in+vivo+by+CFSE-labeling+of+administered+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Tracing tolerance and immunity in vivo by CFSE-labeling of administered cells.</a> Methods Mol Biol. 380, 365-376 (2007).</li>
<li>Durward, M. A., Harms, J., Magnani, D. M., Eskra, L., Splitter, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discordant+Brucella+melitensis+antigens+yield+cognate+CD8%2B+T+cells+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Discordant Brucella melitensis antigens yield cognate CD8+ T cells in vivo.</a> Infect Immun. 78 (1), 168-176 (2010).</li>
<li>Lyons, A. B., Parish, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+lymphocyte+division+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Determination of lymphocyte division by flow cytometry.</a> J Immunol Methods. 171 (1), 131-137 (1994).</li>
<li>Weston, S. A., Parish, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+fluorescent+dyes+for+lymphocyte+migration+studies.+Analysis+by+flow+cytometry+and+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">New fluorescent dyes for lymphocyte migration studies. Analysis by flow cytometry and fluorescence microscopy.</a> J Immunol Methods. 133 (1), 87-97 (1990).</li>
<li>Akondy, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+yellow+fever+virus+vaccine+induces+a+broad+and+polyfunctional+human+memory+CD8%2B+T+cell+response%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">The yellow fever virus vaccine induces a broad and polyfunctional human memory CD8+ T cell response.</a> J Immunol. 183 (12), 7919-7930 (2009).</li>
<li>Wallace, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+antigen-driven+responses+by+flow+cytometry%3A+monitoring+proliferation+by+dye+dilution%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Tracking antigen-driven responses by flow cytometry: monitoring proliferation by dye dilution.</a> Cytometry A. 73 (11), 1019-1034 (2008).</li>
<li>Labadi, A., Balogh, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+preferences+in+serosal+homing+and+distribution+of+peritoneal+B-cell+subsets+revealed+by+in+situ+CFSE+labeling%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Immunol%22%5BJournal%5D)">Differential preferences in serosal homing and distribution of peritoneal B-cell subsets revealed by in situ CFSE labeling.</a> Int Immunol. 21 (9), 1047-1056 (2009).</li>
<li>Suffner, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+cells+support+homeostatic+expansion+of+Foxp3%2B+regulatory+T+cells+in+Foxp3.LuciDTR+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Dendritic cells support homeostatic expansion of Foxp3+ regulatory T cells in Foxp3.LuciDTR mice.</a> J Immunol. 184 (4), 1810-1820 Forthcoming.</li>
</ol>

利害の衝突は宣言されません。動物実験は、ウィスコンシン大学マディソン校の動物実験使用委員会（IACUC）によって定められたガイドラインおよび規制に準拠して行った。

CFSEは子孫10,11の間で比較的均等に分割するので、このアッセイは、クローン性増殖を含む細胞の増殖能を調査するように変更することができます。また、CFSE標識と組み合わせることができる例の四量体および生物発光13あなたの仮説に応じてより適切な方法をトレースし、他のセルが、、ありますがそれは、細胞遊走6,12を調査するためにラベル付けCFSEを使用することも可能です。 PEも同様に動作しない可能性があります中には、表面マーカーのために共同で染色する場合、それはそう、フローサイトメーター上で複数のチャネルに介してそのCFSEの出血に注意することが重要である、PeCy7は、蛍光団のを選ぶとよいでしょう。

<table><tbody><tr><td>1 mm ガラスビーズ</td><td>Biospec Products</td><td>11079110</td><td></td></tr><tr><td>70 &amp;mu;m セルストレイナー</td><td>BD Biosciences</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>96ウェルプレート</td><td>Costar</td><td>3799</td><td></td></tr><tr><td>Adjulite 不完全フロイント&amp;rsquo;s アジュバント</td><td>Pacific Immunology</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D-5879</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>16000-077</td><td></td></tr><tr><td>FC 500 フローサイトメーター</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Kontes ガラス組織ホモジナイザー</td><td>Kontes Corp</td><td>885300-0015</td><td></td></tr><tr><td>Mini Beadbeater</td><td>Biospec Products</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>針</td><td>BD Biosciences</td><td>305175</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm &quot;M&quot;</td><td>Pechiney Plastic Packaging</td><td>PM992</td><td></td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>157-8</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>PharmLyse 溶血試薬</td><td>BD Biosciences</td><td>555899</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>シリンジ</td><td>BD Biosciences</td><td>309602</td><td></td></tr><tr><td>Vybrant CFSE キット</td><td>Invitrogen</td><td>V12883</td><td></td></tr></tbody></table>

抗原特異的インビボでの</emcfse標識した標的細胞を用いた>キリングアッセイ

Antigen Specific In Vivo Killing Assay using CFSE Labeled Target Cells

カルボキシフルオレセインジアセテートスクシンイミジルエステル（CFSE）を容易かつ迅速に生体内での調査のための関心の細胞集団を標識するために使用することができます。この標識は、古典的な増殖と移動を研究するために使用されています。ここで紹介した方法では、我々は、エピトープの特定のCFSE標識した標的細胞を4-6の生存と殺害を見に養子移入した後にタイムラインを短縮している。その量は、誤解を招く可能性があるとしてCD8 + T細胞クローンの特定の殺害のレベルは、応答の質を示すことができます。特定のCD8 + T細胞はサイトカイン産生と7,8を殺すの低下と時間をかけて機能的に枯渇することができます。また、特定のCD8 + T細胞クローンは、異なるTCRの特異性9と同様に他人を殺すしないことがあります。効果的な細胞性免疫（CMI）の場合、抗原はT細胞の応答の適切な数字だけでなく、機能的に堅牢な応答性T細胞だけを作り出すことを識別する必要があります。ここでは、BALB / cマウスに2つのペプチド特異的T細胞クローンのパーセントの細胞特異的殺傷を評価する。

多くの感染症は、強力なCTL応答を誘発するが、時折、応答する細胞の量は、病原体の制御に相関しない<sup&gt; 1</sup&gt;。 CTLの質の1つの尺度は具体的に死滅させる能力です。<sup&gt; 2</sup&gt;。標的細胞のCFSE標識は、このCTL応答の品質を調査するために使用することができます<em&gt; in vivoで</em<sup&gt; 3,4</sup&gt;。

抗原特異的インビボでの</emCFSE標識した標的細胞を用いた>キリングアッセイ

カルボキシフルオレセインジアセテート・スクシンイミジルエステル（CFSE）を用いることで、in vivoでの解析に向け、目的の細胞集団を簡便かつ迅速に標識させることができます。

本実験の全体的な目的は、in vivoにおける標的細胞の殺傷能力を調べることにより、特定の抗原に反応するCD8陽性T細胞の機能的な質を評価することです。まず、レシピエントマウスに免疫を行うことで、抗原特異的なエフェクターCD8陽性T細胞を誘導します。次に、一次標的細胞に特異性を付与するか、あるいはその他の処理を施すことで、特異的なエフェクター・ターゲットシステムを構築します。次に、ターゲット細胞を後眼窩経路による養子移入でレシピエントマウスに投与します。in vivoでのエフェクターによる殺傷能を調べるため、CFSE染色細胞のフローサイトメトリー分析に基づき、エフェクターがターゲット細胞を殺傷したかどうかの結果を得ました。こんにちは、マリーナ・ウォードです。私はウィスコンシン大学マディソン校のGary Splitter研究室の大学院生です。本手法は、CTLによる殺傷能に関する知見を提供し、細胞の増殖や生存の解析にも適用可能です。養子移入の手順については、当研究室の研究員であるDr. Jerome Harmsが実演します。まず、戦略的に特定のエフェクター標的システムを定義することから始めてください。例えば、古典的なin vivo CTLアッセイでは、精製ペプチド免疫を用いて特異的なCD8陽性T細胞を誘導し、同一のペプチドを用いて同系標的細胞をパルスすることで、標的系に対する特異的な効果を構築します。注射の無菌性を確保するため、バイオセーフティキャビネットの作業面を汚染除去してください。まず2 mLチューブに準備し、ペプチド免疫液を作成します。マウス1匹につき、精製ペプチド50 µgをPBSで調製した10%DMSO 100 µLに加えます。次に、混合用に1 mmビーズを含む、極低温の不完全フリーアンジュを同量加えます。チューブの蓋をパラフィルムで固定し、注射まで免疫原を氷上で保存します。ビーズミルを最大回転数に設定してエマルションを3分間混合し、混合後すぐにエマルションを氷上に置きます。得られたエマルションは、マヨネーズに近い粘性である必要があります。エマルションを4 °Cで一晩から最大1週間静置させ、免疫的に分離が認められた場合はさらに混合してください。本実験のこの工程で使用するマウスを特定します。1 mLシリンジと20G針を用いて、エマルジョンを吸い上げます。標的細胞を調製するため、ビーズを吸い込まないように注意してください。ナイーブな同系マウスを用い、A-A-A-L-A-C承認基準に従ってこれらのナイーブマウスを安楽死させます。マウスの被毛やその他の外部汚染物質による汚染の可能性を最小限に抑えるため、マウスの該当部位に70% ethanolをスプレーします。解剖用ハサミを使用して、マウスの左側の皮膚に小さな切り込みを入れます。皮膚フラップを引っ張り、腹膜嚢と内臓を露出させます。下層の臓器を傷つけないように注意しながら、腹膜を切開します。体表に近い位置にある暗赤色の脾臓を確認します。脾臓を慎重に取り出し、直ちに氷上に置いた10 mLの調製済みRPMI培地 containing 15 mLコニカルチューブに入れる。残りのマウスについても同様に行う。その後、脾臓と培地をガラス製組織ホモジナイザーに移す。脾臓の組織がすべて脱色するまで摩砕します。均質化された産物を70 micronのセルフィルターでろ過し、50 milliliterのコニカルチューブに回収します。ホモジナイザーを新鮮な培地で一度すすぎ、フィルターを通して脾臓ホモジネートと合わせてから、4 °C、1,300 rpmで遠心分離します。7分間遠心分離した後、上清をデカンテーションで除いて廃棄します。細胞ペレットを10 mLの溶解試薬で再懸濁し、37 °Cで7分間インキュベートします。新鮮な培地を加えて50 mLにし、遠心分離によって細胞を回収します。この洗浄工程を繰り返します。細胞数をカウントし、96ウェル丸底組織培養プレートの各ウェルに1,000万個ずつ分注します。4 °Cで1.5時間インキュベートします。最後の30分間は37 °Cのインキュベーターに移します。メーカーの指示に従って新鮮なCFSE試薬を調製し、使用濃度が0.5から25 µMになるように希釈します。濃度の異なる2種類のCFSE溶液（10倍の濃度差）を調製します。ラベル付けを行う前に、これら低濃度および高濃度のCFSE溶液を37°Cで平衡化させます。標的細胞が入った96ウェルプレートをインキュベーターから取り出し、遠心分離によって細胞をペレット化します。室温でプレートを軽く叩き、上清を除去します。細胞を200 µLの低濃度または高濃度のCFSE溶液に再懸濁し、37 °Cのインキュベーターで15分間インキュベートします。室温で遠心分離して細胞をペレット化し、プレートを軽く叩いて上清を除去します。細胞を200 µLの新鮮な培地に再懸濁し、37 °Cで30分間インキュベートします。再度遠心分離して細胞をペレット化し、上清を廃棄した後、ペレットを50 µLのPBSに再懸濁します。ラベル化した細胞の一部を、データ解析時の非移入コントロール用、および養子移入のためのフローサイトメーターでの解析用に分けておきます。マウス1匹あたり、低濃度CFSE標識細胞を1ウェル分と高濃度CFSE標識細胞を1ウェル分を混合します。これにより、最終的な注入液は0.1 milliliter中に50%の特異的ターゲット細胞と50%の非関連細胞で構成されます。養子転移を容易にするため、ペプチド免疫マウスを麻酔し、標識したターゲット細胞0.1 milliliterを後眼窩経路でレシピエントに注入します。6時間後、レシピエントマウスを安楽死させて細胞を回収し、マウスの脾臓を摘出して、同様のプロトコルを用いて細胞集団を精製します。ターゲット脾細胞を調製する際は、96ウェル丸底組織培養プレートに1ウェルあたり100万個の細胞を播種し、回収された非転移細胞をパラホルムアルデヒドで固定し、フローサイトメーターでサンプルを測定してデータを解析します。細胞特異的な殺傷結果の典型的な提示方法は、2つの形式で示されています。FACSヒストグラムにおけるエピトープ特異的なピークの減少、およびその算出値が細胞特異的溶解（cell specific lysis）となります。ここでの数値は、PBS免疫したレシピエントマウスから回収したCFSE標識コントロール細胞、および2種類の異なるペプチド特異的レシピエントマウスから回収したCFSE標識細胞における、高または低CFSE表現型を示す細胞の割合を示しています。細胞特異的な殺傷を示す、エピトープ特異的なピークの減少に注目してください。あるいは、マウスの各群（PBS、ペプチドA、およびペプチドB）における細胞特異的溶解をグラフで提示することも可能です。このビデオを視聴することで、マウスを用いた独自のin vivo CTL殺傷アッセイの開発方法について十分な理解を得られるはずです。

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Immunology and Infection

免疫学と感染症

CFSEは共有結合蛍光色素、カルボキシで長寿命の細胞内分子にラベルを付けます。このように、CFSE標識細胞が分裂するときに、その子孫は、それによって細胞分裂を評価するために使用できる蛍光の半分の量を、持っている。この資料では、通常CFSEでマウスのリンパ球を標識するために使用される手続きを説明します。...

リンパ球増殖を監視するためのカルボキシフルオレセインジアセテートスクシンイミジルエステル（CFSE）の使用

機能的なT細胞アッセイにおける抗原のソースとして使用するヒト組織の抽出物を調製するための単純なプロトコルが記載されている。この方法は、組織由来の抗原に対するT細胞の反応を測定することができる...

機能アッセイのための組織抗原の抽出

このビデオでは、細胞傷害性Tリンパ球またはCTL応答における免疫優性をアッセイするためのフローサイトメトリーベースのアッセイを紹介しています。注入された蛍光標的細胞は、免疫原性エピトープに対応するさまざまな蛍光を示します。脾臓の採取と選別後、高強度蛍光細胞の減少が明らかになり、CTL応答の免疫優性が確認されました。...

細胞傷害性Tリンパ球応答における免疫優性を評価するためのアッセイ

このプロトコルは、高感度の細胞ベースの細胞毒性アッセイについて説明しています。このアッセイは、エフェクターCD8+ T細胞の数が増加している場合の生標的CD4+ T細胞の頻度の減少を列挙することにより、抗原特異的CD8+...

細胞毒性活性を測定するための細胞ベースのフローサイトメトリーアッセイ

インビボで詳細に T細胞応答をモニターする能力は、免疫応答の我々の理解の開発のために重要である。ここでは、フローサイトメトリーで同時に&gt; 250のパラメータを評価するin vivoでの T細胞アッセイにおける蛍光の標的配列（のFTA）の使用を記載している。...

T細胞応答の評価のための蛍光ターゲット配列の使用<em&gt;インビボ</em

このプロトコルの目的は、抗原特異的マウスモデルにおける標的細胞の殺害の生体内での検出を実現することです。...

生体内で予防接種モデルを用いた抗原特異的 T 細胞細胞傷害性関数の検出のための試金

ここでは、モデル腫瘍抗原に対する細胞傷害性 T リンパ球 (CTL) 応答における immunodominance...

腫瘍特異的 CD8+ T 細胞応答における Immunodominance を研究するためのインビボ細胞毒性アッセイ

ここで提示される、色素希釈を用いた抗原タンパク質またはペプチドに応答して増殖CD4+T細胞を測定するためのプロトコルである。このアッセイは、特に希少な抗原特異的T細胞に対して感受性があり、抗原特異的細胞のクローニングを容易にするために改変することができる。...

カルボキシフルオレスチンスクシニミジルエステルを用いたヒト抗原特異的CD4+T細胞の増殖の定量化

この原稿では、フローサイトメトリーを用いて腫瘍細胞由来細胞外小胞(EV)の in vivo...

インビボ 脾臓T細胞のフローサイトメトリーによる腫瘍由来細胞外小胞の免疫原性スクリーニング

このプロトコルは、生細胞イメージングとフローサイトメトリーを用いて、ヒトの自然なキメラ抗原受容体介在および抗体依存性細胞毒性を一貫して測定するための標準化された in vitro.

キメラ抗原受容体および治療用抗体によって増強されるNK細胞毒性の定量化:生細胞イメージングおよびフローサイトメトリー

学ぶCFSE標識を用いたマウスインビボ細胞傷害アッセイで、抗原特異的CD8+T細胞の機能的質を評価する方法。フローサイトメトリー解析により細胞傷害活性を定量化し、免疫応答の質を正確に測定できます。

抗原特異的インビボでのキリングアッセイ

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