抗原特異的インビボでのキリングアッセイ

本実験の全体的な目的は、in vivoにおける標的細胞の殺傷能力を調べることにより、特定の抗原に反応するCD8陽性T細胞の機能的な質を評価することです。まず、レシピエントマウスに免疫を行うことで、抗原特異的なエフェクターCD8陽性T細胞を誘導します。次に、一次標的細胞に特異性を付与するか、あるいはその他の処理を施すことで、特異的なエフェクター・ターゲットシステムを構築します。

次に、ターゲット細胞を後眼窩経路による養子移入でレシピエントマウスに投与します。in vivoでのエフェクターによる殺傷能を調べるため、CFSE染色細胞のフローサイトメトリー分析に基づき、エフェクターがターゲット細胞を殺傷したかどうかの結果を得ました。こんにちは、マリーナ・ウォードです。

私はウィスコンシン大学マディソン校のGary Splitter研究室の大学院生です。本手法は、CTLによる殺傷能に関する知見を提供し、細胞の増殖や生存の解析にも適用可能です。養子移入の手順については、当研究室の研究員であるDr. Jerome Harmsが実演します。まず、戦略的に特定のエフェクター標的システムを定義することから始めてください。

例えば、古典的なin vivo CTLアッセイでは、精製ペプチド免疫を用いて特異的なCD8陽性T細胞を誘導し、同一のペプチドを用いて同系標的細胞をパルスすることで、標的系に対する特異的な効果を構築します。注射の無菌性を確保するため、バイオセーフティキャビネットの作業面を汚染除去してください。まず2 mLチューブに準備し、ペプチド免疫液を作成します。

マウス1匹につき、精製ペプチド50 µgをPBSで調製した10%DMSO 100 µLに加えます。次に、混合用に1 mmビーズを含む、極低温の不完全フリーアンジュを同量加えます。チューブの蓋をパラフィルムで固定し、注射まで免疫原を氷上で保存します。

ビーズミルを最大回転数に設定してエマルションを3分間混合し、混合後すぐにエマルションを氷上に置きます。得られたエマルションは、マヨネーズに近い粘性である必要があります。エマルションを4 °Cで一晩から最大1週間静置させ、免疫的に分離が認められた場合はさらに混合してください。

本実験のこの工程で使用するマウスを特定します。1 mLシリンジと20G針を用いて、エマルジョンを吸い上げます。標的細胞を調製するため、ビーズを吸い込まないように注意してください。

ナイーブな同系マウスを用い、A-A-A-L-A-C承認基準に従ってこれらのナイーブマウスを安楽死させます。マウスの被毛やその他の外部汚染物質による汚染の可能性を最小限に抑えるため、マウスの該当部位に70% ethanolをスプレーします。解剖用ハサミを使用して、マウスの左側の皮膚に小さな切り込みを入れます。

皮膚フラップを引っ張り、腹膜嚢と内臓を露出させます。下層の臓器を傷つけないように注意しながら、腹膜を切開します。体表に近い位置にある暗赤色の脾臓を確認します。

脾臓を慎重に取り出し、直ちに氷上に置いた10 mLの調製済みRPMI培地 containing 15 mLコニカルチューブに入れる。残りのマウスについても同様に行う。その後、脾臓と培地をガラス製組織ホモジナイザーに移す。

脾臓の組織がすべて脱色するまで摩砕します。均質化された産物を70 micronのセルフィルターでろ過し、50 milliliterのコニカルチューブに回収します。ホモジナイザーを新鮮な培地で一度すすぎ、フィルターを通して脾臓ホモジネートと合わせてから、4 °C、1,300 rpmで遠心分離します。

7分間遠心分離した後、上清をデカンテーションで除いて廃棄します。細胞ペレットを10 mLの溶解試薬で再懸濁し、37 °Cで7分間インキュベートします。新鮮な培地を加えて50 mLにし、遠心分離によって細胞を回収します。

この洗浄工程を繰り返します。細胞数をカウントし、96ウェル丸底組織培養プレートの各ウェルに1,000万個ずつ分注します。

4 °Cで1.5時間インキュベートします。最後の30分間は37 °Cのインキュベーターに移します。メーカーの指示に従って新鮮なCFSE試薬を調製し、使用濃度が0.5から25 µMになるように希釈します。

濃度の異なる2種類のCFSE溶液（10倍の濃度差）を調製します。ラベル付けを行う前に、これら低濃度および高濃度のCFSE溶液を37°Cで平衡化させます。標的細胞が入った96ウェルプレートをインキュベーターから取り出し、遠心分離によって細胞をペレット化します。

室温でプレートを軽く叩き、上清を除去します。細胞を200 µLの低濃度または高濃度のCFSE溶液に再懸濁し、37 °Cのインキュベーターで15分間インキュベートします。室温で遠心分離して細胞をペレット化し、プレートを軽く叩いて上清を除去します。細胞を200 µLの新鮮な培地に再懸濁し、37 °Cで30分間インキュベートします。再度遠心分離して細胞をペレット化し、上清を廃棄した後、ペレットを50 µLのPBSに再懸濁します。ラベル化した細胞の一部を、データ解析時の非移入コントロール用、および養子移入のためのフローサイトメーターでの解析用に分けておきます。

マウス1匹あたり、低濃度CFSE標識細胞を1ウェル分と高濃度CFSE標識細胞を1ウェル分を混合します。これにより、最終的な注入液は0.1 milliliter中に50%の特異的ターゲット細胞と50%の非関連細胞で構成されます。養子転移を容易にするため、ペプチド免疫マウスを麻酔し、標識したターゲット細胞0.1 milliliterを後眼窩経路でレシピエントに注入します。

6時間後、レシピエントマウスを安楽死させて細胞を回収し、マウスの脾臓を摘出して、同様のプロトコルを用いて細胞集団を精製します。ターゲット脾細胞を調製する際は、96ウェル丸底組織培養プレートに1ウェルあたり100万個の細胞を播種し、回収された非転移細胞をパラホルムアルデヒドで固定し、フローサイトメーターでサンプルを測定してデータを解析します。細胞特異的な殺傷結果の典型的な提示方法は、2つの形式で示されています。

FACSヒストグラムにおけるエピトープ特異的なピークの減少、およびその算出値が細胞特異的溶解（cell specific lysis）となります。ここでの数値は、PBS免疫したレシピエントマウスから回収したCFSE標識コントロール細胞、および2種類の異なるペプチド特異的レシピエントマウスから回収したCFSE標識細胞における、高または低CFSE表現型を示す細胞の割合を示しています。細胞特異的な殺傷を示す、エピトープ特異的なピークの減少に注目してください。

あるいは、マウスの各群（PBS、ペプチドA、およびペプチドB）における細胞特異的溶解をグラフで提示することも可能です。このビデオを視聴することで、マウスを用いた独自のin vivo CTL殺傷アッセイの開発方法について十分な理解を得られるはずです。