Name: メチルトランスフェラーゼのプロファイリングおよびその他の S -アデノシル- L -ホモシステイン結合タンパク質 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-20T16:20:00.000+00:00
Duration: 17 min 12 s
Description: 学ぶメチルトランスフェラーゼのプロファイリング法。CCMSを用いて大腸菌細胞溶解液から標的タンパク質を分離・同定する手法です。光架橋反応と質量分析により、複雑なタンパク質混合物から機能的サブプロテオームを効率的に解析できます。

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この作品は、ヒューマンフロンティアサイエンスプログラム推進機構（HFSPアワード2007、RGP0058/2007-C）によってサポートされていました。我々はプロジェクトを開始するためと有意義な議論のための教授リチャードロバーツに感謝。

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ThomasLenz、OliviaGrabner、MirkoGlinski、MathiasDreger、そしてこの記事で使用する試薬の一部を生成するcaprotec bioanalytics社、株式会社に雇用さHubertKosterare。

記述されたプロトコルを以下のときは、次の注意事項とコメントは役に立つかもしれません：これは、その後の厳しい洗浄条件を許可するようにCCの）主要な利点は、CCとMTase間の共有結合の形成にある。共有結合架橋は、UV光（310 nmの最大）によって引き起こされる光反応によって達成される。通常のオーバーヘッドの光は紫外線のごく一部が含まれている、しかし、上caproBoxの制御と冷却照射のオーバーヘッド、あるいは太陽の光に長く曝露によるSAH - CCを保護する。 B）MTasesが分離される元となる生体試料が変性を起こしやすいタンパク質を含む可能性がある、従ってそれは、試料を低温に保つため、常に泡を避けるために必須です。 C）caproBoxが0〜4にサンプルを冷却° C、UV光を発するランプは、しかし、また熱を発する。したがって、それは一時的に照射する前にバイアルを遠心分離する必要があるので、キャップやバイアルの壁に付着したタンパク質は、降水量の種子を形成することはできません。 D）磁性ビーズの再懸濁が（洗浄溶液などにおいて）手で不可能な場合は、すぐに超音波浴中に試料を配置することにより、超音波を適用する。 e）の新鮮な0.2パーセントTFA/60％のACN溶液を調製。我々は、そうでなければ捕捉されたタンパク質がビーズから切断されていない可能性がありますことを発見。 f）に捕捉されたタンパク質の最終的な分析は、LC-MS/MSにより実施される。質量分析法は高​​感度な方法です。それは最後のステップ（ステップ2.11とさらに）で排他的にLC - MSグレード試薬を使用する必要があります。外部のタンパク質源、ほこりからまたは実験者からの発信などのケラチンでの実験のコンタミネーションを避ける。特に最終的な消化のステップの間に、それは、清潔な作業スペースに注意を払うために手袋を着用すると白衣と多分ヘアネットまたは理想的にはクリーンベンチの下に最終的な手順を実行することをお勧めします。フィルタ、分注し、-20℃で保存し、汚染を避けるために一度だけ各アリコートを使用して0.22μmのフィルター、LC MSグレードの水の中でトリプシン消化物に使用する50mMの重炭酸アンモニウムバッファを準備します。トリプシン溶液（クエンシンググレード、ロシュ、凍結乾燥したトリプシンに1mMのHClを添加、0.5μg/μLの溶液を調製）を、4℃で数週間保存することができます。 g）を信頼性の高いマススペクトルを得るためには、ESI-MS/MS分析で安定したスプレーを持つことが不可欠です。 H）本研究で使用したもの以外のLC-MS/MSシステムでは、測定パラメータとペプチド同定アルゴリズムを個別に調整する必要があります。 次の変更を説明するプロトコルに関して可能です：60％ACN/0.2％TFA（ステップ2.11）でビーズからタンパク質を放出する代わりに）、タンパク質は直接trypticallyビーズ懸濁液（同じボリュームなどの内で消化することができます。ステップ5.1）でまたは、SDS - PAGEのために、タンパク質を95ステップ2.9の後に収集されたビーズを懸濁し、加熱することによって解除することができます℃のSDSサンプルバッファーで10分（両方とも、全体の停止または上清のみをロードすることができるためゲルのポケットに）。我々は、ビーズがゆっくりであっても、いくつかの水系洗浄ステップの後で、ビーズトリプシン消化物中に水性のトリプシン消化物の溶液中にポリマーの少量を解放することを発見。ポリマーの汚染は、MSペプチドの同定と干渉し、80％ACNを（少なくとも3回）を使用してビーズから洗浄することができます。 80％ACNの洗浄ステップの後、ビーズを前に、オンビーズトリプシン消化物に水で1回洗浄してください。 B）ストレプトアビジン- horseraddishペルオキシダーゼおよびECL基質を用いたウェスタンブロットはまた、タンパク質にビオチンを含むCCの成功架橋を可視化するために使用することができます。したがって、ステップ3.2の後に得られるいずれのゲルをブロットすることができるまたは、感度が10倍程度であるため、ステップ2.7の後に10μlのサンプルを、ゲルの銀染色よりも高いにもウェスタンブロットで分析することができます。後者の場合にendogeneouslyビオチン化タンパク質はまた、人為的にSAH - CCによるビオチン化タンパク質のほかに検出されることに留意。 c）我々は、架橋反応が溶液4で自由CCとタンパク質の間で行われる&quot;オフビード&quot;の構成、どうか、（ライセート、標的タンパク質、選択性と彼CCの反応性の機能を対処）それは特殊なシステムに依存することを見出したまたは現在説明&quot;上のビーズ&quot;の構成（図1B）は、パフォーマンスが向上します。 一般的には、この方法はまた、あらゆる最先端の安定同位体の蛋白質またはペプチドの標識技術、または2次元ゲル電気泳動によるキャプチャのサンプルの評価と互換性があります。 &quot;オフ - ビーズ&quot;構成では、全細胞（未発表結果）内のタンパク質をキャプチャすることも可能です。さらに、薬剤またはタンパク質の補因子結合部位は、MSペプチド配列決定によりタンパク質配列内にCCのすぐ近くの架橋の位置を決定することにより説明することができます。蛋白質への小分子の結合様式は異なるC言語を使用して調べることができます選択性の機能と異なるリンカー長でhemical取り付け位置。として選択する機能によってアドレスのタンパク質のタンパク質結合パートナー（PRMAの基質としてRplK）また、本研究で示されているか、または未知の小分子のタンパク質の相互作用（GlnAにSAH）を識別することができます。要約、CCの追加機能、光架橋反応は、高感度で、複雑なタンパク質混合物から低濃度タンパク質や機能性タンパク質のファミリーの分離と同定を可能にし、低分子化合物を研究するための追加のツールを科学者を提供 - タンパク質相互作用。

<table><tbody><tr><td>SAH caproKit&amp;#8482;</td><td>caprotec bioanalytics GmbH</td><td>1-1010-050 (50反応分) 1-1010-010 (10反応分)</td><td>SAH-CC、SAHコンペティター、ストレプトアビジンコート磁気ビーズ、キャプチャーバッファー、および洗浄バッファーを含む</td></tr><tr><td>caproBox&amp;#8482;</td><td>caprotec bioanalytics GmbH</td><td>1-5010-003 (110 V) 1-5010-004 (230 V)</td><td>サンプルを冷却しながら、再現性のある光活性化を行うための装置</td></tr><tr><td>caproMag&amp;#8482;</td><td>caprotec bioanalytics GmbH</td><td>1-5100-001</td><td>ピペッティングなしで磁性粒子を容易に操作するための装置</td></tr></tbody></table>

メチルトランスフェラーゼのプロファイリングおよびその他の s -アデノシル- l</subキャプチャの複合質量分析法（ccms）別> -ホモシステイン結合タンパク質

Profiling of Methyltransferases and Other S-adenosyl-L-homocysteine-binding Proteins by Capture Compound Mass Spectrometry (CCMS)

アフィニティークロマトグラフィーなど1または活動ベースのタンパク質プロファイリング2のような機能性小分子とタンパク質の相互作用に基づいてプロテオームの複雑さを軽減するためのさまざまなアプローチがあります。三官能キャプチャ化合物（CCS、図1A）3は 、一般的なアプローチの基礎とされている初期の平衡駆動型の低分子プローブ（ここで選択性の機能、S -アデノシル- L -ホモシステイン、SAH、図1A）との間の相互作用と標的タンパク質は、不可逆的にCCの独立した光活性化反応の機能（ここでphenylazide）と標的蛋白質の表面との間の光架橋により固定されています。固相（ここでストレプトアビジン磁気ビーズ）の助けを借りて、複雑な生物学的な混合物からタンパク質複合体 - ソート関数（ここでビオチン）は、CCを分離するのに役立つ。実験の二つの構成が可能です：&quot;オフビーズ&quot;4または現在説明&quot;上のビーズ&quot;の構成（図1B）。選択性の機能は、関心のあるほぼすべての小分子（基質、阻害剤、薬物分子）があります。 （SAM、図1A）S -アデノシル- L -メチオニンは、おそらくATP、自然5、6で最も広く使用されている因子に2番目です。それはDNA 7メチル化SAM依存メチルトランスフェラーゼ（MTases）、、RNA 8、蛋白質9、または小分子10で触媒される化学反応を持つすべての生物の主要なメチル基供与体として使用されます。多様な生理学的なシナリオでのメチル化反応の重要な役割（遺伝子制御、エピジェネティクス、代謝）を考えると、MTasesのプロファイリングは、キナーゼのプロファイリングなど、機能的プロテオミクスにおける同様の重要性になることを期待することができます。彼らのプロファイリングのための分析ツールは、しかし、利用されていない。我々は最近、この技術格差（図1A）を埋めるために選択性のグループとしてSAHとCCを導入しました。 SAH、メチル転移後のSAMの製品は、既知の一般的なMTase製品の阻害剤11です。このような理由から、天然補酵素SAMが原因で、その化学的不安定性の12因子の他の部分を転送するかだけでなく、ラジカル反応を開始、さらに酵素で使用されているため、SAHは、ターゲットMTasesへのCCの理想的な選択性の関数です。ここで、我々は、 大腸菌の株DH5α（ 大腸菌 ）からMTasesと他のSAH結合タンパク質をプロファイリングすることによって好ましいモデルを務めている最高の特徴と原核生物、のいずれかをSAH - CCとCCMSのユーティリティを報告する数え切れないほどの、生化学、生物学、およびバイオテクノロジーの研究で生物。写真活性化架橋は、実験の収量と感度を向上させ、特異性は容易に自由SAHの過剰を使用して競合実験のためにテストすることができます。

キャプチャ化合物は、光架橋および精製に続いて​​機能的な可逆小分子 - タンパク質相互作用により、プロテオームの複雑さを軽減するために三官能性低分子化合物です。ここでは、使用してキャプチャーコンパウンドを使用<em&gt; S</em&gt; -アデノシル-<sub&gt; L</sub&gt; -ホモシステイン結合選択性の関数としてのメチルトランスフェラーゼを分離する<em&gt;大腸菌</em&gt;全細胞は、溶解液とMSでそれらを識別する。

メチルトランスフェラーゼのプロファイリングおよびその他の S -アデノシル- L</subキャプチャの複合質量分析法（CCMS）別> -ホモシステイン結合タンパク質

アフィニティなどの機能的な低分子-タンパク質相互作用に基づいてプロテオームの複雑性を低減させるための、さまざまなアプローチが存在します。

本実験の全体的な目的は、キャプチャー化合物質量分析法（CCMS）を用いて、複雑なタンパク質混合物からメチル基転移酵素をプロファイリングすることです。メチル基転移酵素は、汎用的なメチル基転移酵素生成物阻害剤であるS-アデノシル-L-ホモシステイン（SAH）を選択性機能として持つ三機能性キャプチャー化合物によって機能的に単離されます。ここに示すワークフローにおいて、まず細胞溶解液をキャプチャー化合物とともにインキュベートし、キャプチャー化合物の選択性機能と標的タンパク質との間に可逆的な結合平衡を確立させることで、機能的な単離を行います。次に、キャプチャーボックス内で混合物をUV光で照射します。照射光により、捕捉化合物の反応性機能が活性化されます。これにより、捕捉化合物と標的タンパク質との間に不可逆的な共有結合的な架橋が形成されます。次に、捕捉化合物のタンパク質複合体をライセートから分離し、十分に洗浄して固体支持体から脱離させ、トリプシン消化を行います。これにより、トリプシン消化されたペプチドの質量分析によって捕捉されたタンパク質を同定します。その結果、捕捉化合物を用いた質量分析に基づき、E. coliの細胞ライセートからメチルトランスフェラーゼを簡便に単離し、同定できることが示されました。こんにちは。生化学科CaTECH研究室のThomas Lentzです。同じくCapTech生化学研究室のMathias Regaです。分析部門のMer Linskyです。本日は、等量化した細胞溶解液からメチル基転移酵素をオンビードでキャプチャする手順を説明します。当研究室では、低分子化合物とタンパク質の相互作用を研究するためにこの手順を用いています。この手順により、キナーゼ、メタロプロテイナーゼ、GTPaseなどの機能的なサブプロテオームの単離および同定が可能になります。また、この手法を薬物標的の探索にも利用します。それでは、始めましょう。キャプチャ実験には、snail L ホモシステインキャプチャーキットおよび短鎖 SAH キャプチャーキットを使用します。本キットには、SAHキャプチャー化合物および競合剤としての遊離SAHが含まれています。また、直径1 µmのストレプトアビジンコート磁気ビーズ、5倍濃縮キャプチャーバッファー、および5倍濃縮洗浄バッファーが含まれています。200 µL PCRチューブストリップの各チューブを用い、10 mg/mLのストレプトアビジンコート磁気ビーズ50 µLと100 µMのSAHキャプチャー化合物25 µLを混合し、激しく撹拌して、SAHキャプチャー化合物がロードされたストレプトアビジンコート磁気ビーズを調製します。得られた懸濁液を室温で2分間振とうし、キャプチャー化合物のビオチン部位を磁性ビーズ表面のストレプトアビジンに結合させます。次に、capra magを用いてPCRチューブの蓋部分にcapraビーズを磁気的に回収し、上清を廃棄して、得られたcapraビーズを200 µLの1倍洗浄バッファーに再懸濁します。再度、PCRチューブストリップの蓋部分にcapraビーズを磁気的に回収し、上清を廃棄します。次に、ビーズの乾燥を防ぐため、チューブを閉じます。続いて、キャプチャーアッセイおよび競合コントロールを含む必要なコントロール用の新しいチューブにラベルを貼ります。プルダウンの競合コントロール、およびプルダウンとキャプチャーアッセイを組み合わせたチューブを用意し、ラベルを貼ったチューブをキャプチャーボックスに入れ、温度を0〜4°Cに調節します。次に、最終反応容量が100 µLになるように計算した量のmilli Q水と、5倍濃度のキャプチャーバッファー20 µLをピペッティングします。各反応につき、E. coli DH5α全細胞ライセート0.26 mgを各チューブに加え、転倒混和により穏やかに混ぜ合わせます。コンペティションコントロールおよびプルダウンのコンペティションコントロールには、10 mM SAHコンペティター溶液20 µLを加えます。キャプチャーアッセイ、およびキャプチャーアッセイとプルダウンの併用においては、SAH溶液の代わりに20 µLのmilli Q水を加え、すべてのチューブを転倒混和して穏やかに混ぜた後、短時間遠心分離します。次に、Capraビーズをそれぞれのライセートに懸濁させ、4 °Cで3時間インキュベートします。ビーズを回転させて懸濁状態に保つことで、SAH結合タンパク質がSAHキャプチャー化合物のSAH選択的機能に可逆的に結合できるようにします。インキュベーション後、短時間遠心分離し、懸濁液をcapra boxに入れる。チューブを分け、プルダウンおよびプルダウンのコンペティションコントロールに使用する懸濁液を取り出して氷上に置く。残りの懸濁液は、キャプチャアッセイのコンペティションコントロールおよび複合キャプチャアッセイに使用するためそのままにする。さらに、サンプルを冷却しながら同時にUV光を照射するため、capra boxをプルダウンします。0〜4°Cの閉管状態で、2.5分間の照射間隔を設けて、合計30分間サンプルに照射します。この工程により、SAH捕捉化合物の反応性基とSAH結合タンパク質との間に共有結合による架橋が形成されます。2.5分間の照射間隔が経過後、懸濁液をCapra boxから取り出します。氷水で約15秒間冷却し、転倒混和を数回行います。次に、サンプルを短時間遠心分離して蓋に残った懸濁液を落とし、次の照射間隔のために再びCapra boxに戻します。次に、プルダウン用の懸濁液およびプルダウンの競合コントロール用の懸濁液を加え、キャプチャーアッセイの競合コントロール、プルダウンの競合コントロール、およびキャプチャーアッセイとプルダウンを組み合わせたものには、10 millimolarのSAH溶液を20 µL加えます。また、プルダウンの競合コントロールには、milli Q水を20 µL加えます。キャプチャーアッセイでは回転させてビーズと懸濁液を混合したまま、懸濁液を4 °Cで10分間インキュベートします。これにより、SAHキャプチャー化合物に架橋されていないSAH結合タンパク質が置換されます。インキュベーション後、Capra Magを用いて懸濁液からCapraビーズを回収し、上清を捨てます。次に、1×洗浄バッファー200 µLに再懸濁し、磁気分離によってビーズを回収することで洗浄します。この洗浄操作を5回繰り返し、その後、Milli-Q水200 µLに再懸濁し、磁気分離によってビーズを回収します。ビーズを 200 µL の 60% アセトニトリルに再懸濁し、CapriMag を用いてビーズを回収します。このアセトニトリルによる洗浄を 2 回繰り返します。ビーズを容易に再懸濁できない場合は、超音波処理を行ってください。次に、調製したばかりの60%アセトニトリル、0.2%トリフルオロ酢酸を200 µL加え、室温で10分間激しく振盪しながらインキュベートし、ビーズから捕捉したタンパク質を溶出させます。ビーズが容易に再懸濁できない場合は、再度超音波処理を行ってください。最後に、磁石でビーズを回収して廃棄します。チューブストリップを個別のチューブに切り分け、蓋に穴を開けて上清を乾固させます。この段階で回収されたタンパク質は、遠心濃縮機を用いてSDS pageに供するか、あるいは次節に述べる質量分析用に処理します。磁気ビーズから放出された回収タンパク質を10 µLの50 mM重炭酸アンモニウムに溶解させます。サンプルを超音波洗浄機に入れ、その後、ボルテックスで撹拌します。次に、1 mM HClに溶解した0.5 µg/µLのtrypsinを1 µL加え、短時間遠心分離した後、溶液を37 °Cで一晩インキュベートします。一晩のインキュベーション後、捕捉したタンパク質のtrypsin消化ペプチドを含む溶液を、メーカーの指示に従い、ProteOmix Biosystems社の20 µLステージチップなどのC18材料を用いて脱塩します。その後、10 µLの50% methanol、5% formic acidでペプチドを2回溶出します。次に、遠心濃縮機を用いて溶媒を蒸発させ、脱塩したペプチドを乾燥させます。超音波バスでの超音波処理およびボルテックスを用いて、0.1% formic acid 5.5 µLにペプチドを溶解させます。最後に、書面でのプロトコルに記載されている通り、タンデム質量分析法を組み合わせたナノフロー液体クロマトグラフィーによりサンプルを分析します。MS/MSデータの解析には、bioworks browser version 3.3 0.1に実装されているseaquestなどのタンパク質同定アルゴリズム、およびscaffold threeソフトウェアに実装されているSPoneおよびXtandemを使用します。最新のユニバーサルプロテインリソースナレッジベースに対して、自動データベース検索が行われます。調査対象生物のSwiss Proデータベース（www.uniprot.org）を利用します。本研究で使用したデータベースは、 coli 株 K12 release 57-11 です。Seaquest を用いて、前駆体許容誤差 5 ppm、フラグメントイオン許容誤差 1 amu、完全な trypsin 特異性（最大 2 回のミスクリーベージを許容）で自動データベース検索を行いました。セリン、トレオニン、チロシンのリン酸化、メチオニンの酸化、アスパラギンおよびグルタミンの脱アミド化、リシンのアセチル化、リシンのホルミル化、そしてアルギニン、リシン、セリン、トレオニン、アスパラギンのメチル化を許可するように可変修飾を設定します。データベース検索において固定修飾は使用しないでください。Sequestで生成されたDTAまたはSRFファイルをScaffold 3ソフトウェアにロードします。Scaffoldは、SequestとX!Tandemのデータベース検索を組み合わせることで、ペプチド割り当てとタンパク質同定の確率評価を行います。Scaffoldは、複数のサンプルのタンパク質リストを容易に比較、検証、および可視化するのに有用です。Scaffold 3ソフトウェア内で、タンパク質同定のみを許可し、個別のヒットとして報告するようにパラメータを設定します。ヒットには、確率検証を通過した識別ペプチドが少なくとも1つ含まれているように設定してください。Scaffold 3の解析に基づき、Scaffold内のPeptide Prophetアルゴリズムによって指定された確率が95%以上のペプチドのみを考慮します。3つのソフトウェアを用いて、プロテインプロフィット（protein profit）アルゴリズムに基づき、複数のペプチドが割り当てられたタンパク質の同定確率を95%以上に設定しました。単一のペプチドによるタンパク質同定については、タンパク質の確率を任意に50%以上に設定し、対応するペプチドを手動で確認しました。Ms MSスペクトルにおいて、類似のペプチドで構成され、Ms MS解析のみでは区別できないタンパク質は、簡潔性の原理を満たすようソフトウェアによってグループ化されました。ペプチド同定の推定偽発見率は、リバースプロテインデータベース法を用いて決定することができ、1%未満である必要があります。キャプチャアッセイにおける、キャプチャされた完全タンパク質のSDS-PAGEおよび銀染色分析の結果を示します。光反応機能によってキャプチャ化合物が共有結合したタンパク質のみが単離されるように、UV照射ステップの後に過剰量の遊離SAHを添加しました。Ingel Triptych Digest後、切り出したタンパク質ゲルバンドからMSによりタンパク質の同定を行った。比較のため、一番左のレーンには、キャプチャーアッセイでタンパク質を単離した元となるe coli DH five alpha全細胞溶解液の0.25%を示している。この比較により、キャプチャー化合物技術によってサンプルの複雑性が劇的に低減されたことがわかる。コントロールはゲルの中心部で実行され、アッセイの競合コントロールが含まれています。このコントロールには、UVI照射ステップの前に競合剤として過剰量の遊離SAHが含まれており、SAH選択機能によるSAHキャプチャー化合物へのタンパク質の結合を防ぎます。競合コントロールは、SAHに結合しない非特異的にキャプチャーされたタンパク質を特定するために不可欠です。したがって、キャプチャーアッセイで同定され、競合コントロールでは同定されなかったタンパク質が、特異的なSAH結合タンパク質となります。また、UV照射および遊離SAHの添加を行わないプルダウン実験の結果も含まれています。プルダウンの競合コントロールにおいても照射は行いませんが、競合剤としてSAHを添加します。最後に、キャプチャーアッセイとプルダウンを組み合わせた系にUV照射を行い、ワークフロー中に遊離SAHは添加しません。光架橋によって実験の収量と感度が向上することは明白であり、キャプチャーされた完全なタンパク質をSDS-PAGEで解析する代わりに、過剰量の遊離SAHを用いた競合実験によって特異性を容易に検証できます。Triptych Digestの後、回収したタンパク質混合物全体を、タンデム質量分析法と結合したナノフロー液体クロマトグラフィーによって一度に分析できます。これが実際のCCMSアプローチであり、SDS-PAGEによる分析よりもはるかに感度が高くなります。CCMS実験によって同定されたMETHYLTRANSFERASESおよびその他の選択されたタンパク質をこの表に示します。提示された数値は、タンパク質あたりの非加重ペプチドスペクトルカウントを示しており、プルダウン法と比較して、キャプチャアッセイではより多くのメチル基転移酵素およびその他のSAH結合タンパク質が同定されています。また、競合コントロールにおいてこれらのタンパク質がほぼ完全に消失していることから、SAH特異性が示されています。CCMSランで同定されたタンパク質の総数およびラン間のタンパク質の重複を表にまとめました。少なくとも2本のペプチドで同定されたタンパク質の数を括弧内に示します。比較可能な実験間で、主に非特異的なタンパク質の高い重複が見られることから、本手法の高い再現性が推測されます。特に、ここでは少なくとも2本のペプチドで堅牢に同定されたタンパク質においてその傾向が顕著です。ベン図は、キャプチャーアッセイ、コンペティションコントロール、およびプルダウンにおける同定タンパク質の重複を示しており、右側には全同定タンパク質数（および括弧内に少なくとも2本のペプチドで同定されたタンパク質数）を、左側にはメチルトランスフェラーゼおよびSAHヌクレアーゼの数を示しています。これまで、キャプチャー化合物質量分析法（CCMS）を用いて、大腸菌（e coli）の細胞溶解物やその他の組織・細胞溶解物から、メチルトランスフェラーゼやその他の機能的サブプロテオームを単離および同定する方法を説明しました。この手順を行う際は、サンプルを冷却し、キャプチャー化合物が可視光に長時間さらされるのを避けることが重要です。また、磁気ビーズから捕捉されたタンパク質を遊離させるために使用するTFAアセトニトリル溶液を調製直前に準備すること、および、塵や実験者由来のケラチンなどの外部タンパク質源による実験の汚染を防ぐことが重要です。また、オフビート構成か、あるいはプリキャプチャー化合物とタンパク質および溶液の間で光架橋が行われる構成か、あるいは現在説明したオンビート構成のどちらがより優れた性能を示すかは、具体的なセットアップに依存することがわかりました。以上で終了です。ご視聴ありがとうございました。皆さんの実験の成功をお祈りしています。

profiling-methyltransferases-other-s-adenosyl-l-homocysteine-binding

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