メチルトランスフェラーゼのプロファイリングおよびその他の S -アデノシル- _{L -ホモシステイン結合タンパク質}

本実験の全体的な目的は、キャプチャー化合物質量分析法（CCMS）を用いて、複雑なタンパク質混合物からメチル基転移酵素をプロファイリングすることです。メチル基転移酵素は、汎用的なメチル基転移酵素生成物阻害剤であるS-アデノシル-L-ホモシステイン（SAH）を選択性機能として持つ三機能性キャプチャー化合物によって機能的に単離されます。ここに示すワークフローにおいて、まず細胞溶解液をキャプチャー化合物とともにインキュベートし、キャプチャー化合物の選択性機能と標的タンパク質との間に可逆的な結合平衡を確立させることで、機能的な単離を行います。次に、キャプチャーボックス内で混合物をUV光で照射します。

照射光により、捕捉化合物の反応性機能が活性化されます。これにより、捕捉化合物と標的タンパク質との間に不可逆的な共有結合的な架橋が形成されます。次に、捕捉化合物のタンパク質複合体をライセートから分離し、十分に洗浄して固体支持体から脱離させ、トリプシン消化を行います。これにより、トリプシン消化されたペプチドの質量分析によって捕捉されたタンパク質を同定します。その結果、捕捉化合物を用いた質量分析に基づき、E. coliの細胞ライセートからメチルトランスフェラーゼを簡便に単離し、同定できることが示されました。

こんにちは。生化学科CaTECH研究室のThomas Lentzです。同じくCapTech生化学研究室のMathias Regaです。分析部門のMer Linskyです。

本日は、等量化した細胞溶解液からメチル基転移酵素をオンビードでキャプチャする手順を説明します。当研究室では、低分子化合物とタンパク質の相互作用を研究するためにこの手順を用いています。この手順により、キナーゼ、メタロプロテイナーゼ、GTPaseなどの機能的なサブプロテオームの単離および同定が可能になります。

また、この手法を薬物標的の探索にも利用します。それでは、始めましょう。キャプチャ実験には、snail L ホモシステインキャプチャーキットおよび短鎖 SAH キャプチャーキットを使用します。

本キットには、SAHキャプチャー化合物および競合剤としての遊離SAHが含まれています。また、直径1 µmのストレプトアビジンコート磁気ビーズ、5倍濃縮キャプチャーバッファー、および5倍濃縮洗浄バッファーが含まれています。200 µL PCRチューブストリップの各チューブを用い、10 mg/mLのストレプトアビジンコート磁気ビーズ50 µLと100 µMのSAHキャプチャー化合物25 µLを混合し、激しく撹拌して、SAHキャプチャー化合物がロードされたストレプトアビジンコート磁気ビーズを調製します。

得られた懸濁液を室温で2分間振とうし、キャプチャー化合物のビオチン部位を磁性ビーズ表面のストレプトアビジンに結合させます。次に、capra magを用いてPCRチューブの蓋部分にcapraビーズを磁気的に回収し、上清を廃棄して、得られたcapraビーズを200 µLの1倍洗浄バッファーに再懸濁します。再度、PCRチューブストリップの蓋部分にcapraビーズを磁気的に回収し、上清を廃棄します。

次に、ビーズの乾燥を防ぐため、チューブを閉じます。続いて、キャプチャーアッセイおよび競合コントロールを含む必要なコントロール用の新しいチューブにラベルを貼ります。プルダウンの競合コントロール、およびプルダウンとキャプチャーアッセイを組み合わせたチューブを用意し、ラベルを貼ったチューブをキャプチャーボックスに入れ、温度を0〜4°Cに調節します。

次に、最終反応容量が100 µLになるように計算した量のmilli Q水と、5倍濃度のキャプチャーバッファー20 µLをピペッティングします。各反応につき、E. coli DH5α全細胞ライセート0.26 mgを各チューブに加え、転倒混和により穏やかに混ぜ合わせます。コンペティションコントロールおよびプルダウンのコンペティションコントロールには、10 mM SAHコンペティター溶液20 µLを加えます。

キャプチャーアッセイ、およびキャプチャーアッセイとプルダウンの併用においては、SAH溶液の代わりに20 µLのmilli Q水を加え、すべてのチューブを転倒混和して穏やかに混ぜた後、短時間遠心分離します。次に、Capraビーズをそれぞれのライセートに懸濁させ、4 °Cで3時間インキュベートします。ビーズを回転させて懸濁状態に保つことで、SAH結合タンパク質がSAHキャプチャー化合物のSAH選択的機能に可逆的に結合できるようにします。

インキュベーション後、短時間遠心分離し、懸濁液をcapra boxに入れる。チューブを分け、プルダウンおよびプルダウンのコンペティションコントロールに使用する懸濁液を取り出して氷上に置く。残りの懸濁液は、キャプチャアッセイのコンペティションコントロールおよび複合キャプチャアッセイに使用するためそのままにする。

さらに、サンプルを冷却しながら同時にUV光を照射するため、capra boxをプルダウンします。0〜4°Cの閉管状態で、2.5分間の照射間隔を設けて、合計30分間サンプルに照射します。この工程により、SAH捕捉化合物の反応性基とSAH結合タンパク質との間に共有結合による架橋が形成されます。

2.5分間の照射間隔が経過後、懸濁液をCapra boxから取り出します。氷水で約15秒間冷却し、転倒混和を数回行います。次に、サンプルを短時間遠心分離して蓋に残った懸濁液を落とし、次の照射間隔のために再びCapra boxに戻します。

次に、プルダウン用の懸濁液およびプルダウンの競合コントロール用の懸濁液を加え、キャプチャーアッセイの競合コントロール、プルダウンの競合コントロール、およびキャプチャーアッセイとプルダウンを組み合わせたものには、10 millimolarのSAH溶液を20 µL加えます。また、プルダウンの競合コントロールには、milli Q水を20 µL加えます。キャプチャーアッセイでは回転させてビーズと懸濁液を混合したまま、懸濁液を4 °Cで10分間インキュベートします。これにより、SAHキャプチャー化合物に架橋されていないSAH結合タンパク質が置換されます。

インキュベーション後、Capra Magを用いて懸濁液からCapraビーズを回収し、上清を捨てます。次に、1×洗浄バッファー200 µLに再懸濁し、磁気分離によってビーズを回収することで洗浄します。この洗浄操作を5回繰り返し、その後、Milli-Q水200 µLに再懸濁し、磁気分離によってビーズを回収します。

ビーズを 200 µL の 60% アセトニトリルに再懸濁し、CapriMag を用いてビーズを回収します。このアセトニトリルによる洗浄を 2 回繰り返します。ビーズを容易に再懸濁できない場合は、超音波処理を行ってください。

次に、調製したばかりの60%アセトニトリル、0.2%トリフルオロ酢酸を200 µL加え、室温で10分間激しく振盪しながらインキュベートし、ビーズから捕捉したタンパク質を溶出させます。ビーズが容易に再懸濁できない場合は、再度超音波処理を行ってください。

最後に、磁石でビーズを回収して廃棄します。チューブストリップを個別のチューブに切り分け、蓋に穴を開けて上清を乾固させます。この段階で回収されたタンパク質は、遠心濃縮機を用いてSDS pageに供するか、あるいは次節に述べる質量分析用に処理します。磁気ビーズから放出された回収タンパク質を10 µLの50 mM重炭酸アンモニウムに溶解させます。

サンプルを超音波洗浄機に入れ、その後、ボルテックスで撹拌します。次に、1 mM HClに溶解した0.5 µg/µLのtrypsinを1 µL加え、短時間遠心分離した後、溶液を37 °Cで一晩インキュベートします。一晩のインキュベーション後、捕捉したタンパク質のtrypsin消化ペプチドを含む溶液を、メーカーの指示に従い、ProteOmix Biosystems社の20 µLステージチップなどのC18材料を用いて脱塩します。その後、10 µLの50% methanol、5% formic acidでペプチドを2回溶出します。

次に、遠心濃縮機を用いて溶媒を蒸発させ、脱塩したペプチドを乾燥させます。超音波バスでの超音波処理およびボルテックスを用いて、0.1% formic acid 5.5 µLにペプチドを溶解させます。最後に、書面でのプロトコルに記載されている通り、タンデム質量分析法を組み合わせたナノフロー液体クロマトグラフィーによりサンプルを分析します。MS/MSデータの解析には、bioworks browser version 3.3 0.1に実装されているseaquestなどのタンパク質同定アルゴリズム、およびscaffold threeソフトウェアに実装されているSPoneおよびXtandemを使用します。

最新のユニバーサルプロテインリソースナレッジベースに対して、自動データベース検索が行われます。調査対象生物のSwiss Proデータベース（www.uniprot.org）を利用します。

本研究で使用したデータベースは、 coli 株 K12 release 57-11 です。Seaquest を用いて、前駆体許容誤差 5 ppm、フラグメントイオン許容誤差 1 amu、完全な trypsin 特異性（最大 2 回のミスクリーベージを許容）で自動データベース検索を行いました。

セリン、トレオニン、チロシンのリン酸化、メチオニンの酸化、アスパラギンおよびグルタミンの脱アミド化、リシンのアセチル化、リシンのホルミル化、そしてアルギニン、リシン、セリン、トレオニン、アスパラギンのメチル化を許可するように可変修飾を設定します。データベース検索において固定修飾は使用しないでください。Sequestで生成されたDTAまたはSRFファイルをScaffold 3ソフトウェアにロードします。Scaffoldは、SequestとX!Tandemのデータベース検索を組み合わせることで、ペプチド割り当てとタンパク質同定の確率評価を行います。Scaffoldは、複数のサンプルのタンパク質リストを容易に比較、検証、および可視化するのに有用です。

Scaffold 3ソフトウェア内で、タンパク質同定のみを許可し、個別のヒットとして報告するようにパラメータを設定します。ヒットには、確率検証を通過した識別ペプチドが少なくとも1つ含まれているように設定してください。Scaffold 3の解析に基づき、Scaffold内のPeptide Prophetアルゴリズムによって指定された確率が95%以上のペプチドのみを考慮します。

3つのソフトウェアを用いて、プロテインプロフィット（protein profit）アルゴリズムに基づき、複数のペプチドが割り当てられたタンパク質の同定確率を95%以上に設定しました。単一のペプチドによるタンパク質同定については、タンパク質の確率を任意に50%以上に設定し、対応するペプチドを手動で確認しました。Ms MSスペクトルにおいて、類似のペプチドで構成され、Ms MS解析のみでは区別できないタンパク質は、簡潔性の原理を満たすようソフトウェアによってグループ化されました。

ペプチド同定の推定偽発見率は、リバースプロテインデータベース法を用いて決定することができ、1%未満である必要があります。キャプチャアッセイにおける、キャプチャされた完全タンパク質のSDS-PAGEおよび銀染色分析の結果を示します。光反応機能によってキャプチャ化合物が共有結合したタンパク質のみが単離されるように、UV照射ステップの後に過剰量の遊離SAHを添加しました。

Ingel Triptych Digest後、切り出したタンパク質ゲルバンドからMSによりタンパク質の同定を行った。比較のため、一番左のレーンには、キャプチャーアッセイでタンパク質を単離した元となるe coli DH five alpha全細胞溶解液の0.25%を示している。この比較により、キャプチャー化合物技術によってサンプルの複雑性が劇的に低減されたことがわかる。

コントロールはゲルの中心部で実行され、アッセイの競合コントロールが含まれています。このコントロールには、UVI照射ステップの前に競合剤として過剰量の遊離SAHが含まれており、SAH選択機能によるSAHキャプチャー化合物へのタンパク質の結合を防ぎます。競合コントロールは、SAHに結合しない非特異的にキャプチャーされたタンパク質を特定するために不可欠です。

したがって、キャプチャーアッセイで同定され、競合コントロールでは同定されなかったタンパク質が、特異的なSAH結合タンパク質となります。また、UV照射および遊離SAHの添加を行わないプルダウン実験の結果も含まれています。

プルダウンの競合コントロールにおいても照射は行いませんが、競合剤としてSAHを添加します。最後に、キャプチャーアッセイとプルダウンを組み合わせた系にUV照射を行い、ワークフロー中に遊離SAHは添加しません。光架橋によって実験の収量と感度が向上することは明白であり、キャプチャーされた完全なタンパク質をSDS-PAGEで解析する代わりに、過剰量の遊離SAHを用いた競合実験によって特異性を容易に検証できます。

Triptych Digestの後、回収したタンパク質混合物全体を、タンデム質量分析法と結合したナノフロー液体クロマトグラフィーによって一度に分析できます。これが実際のCCMSアプローチであり、SDS-PAGEによる分析よりもはるかに感度が高くなります。CCMS実験によって同定されたMETHYLTRANSFERASESおよびその他の選択されたタンパク質をこの表に示します。

提示された数値は、タンパク質あたりの非加重ペプチドスペクトルカウントを示しており、プルダウン法と比較して、キャプチャアッセイではより多くのメチル基転移酵素およびその他のSAH結合タンパク質が同定されています。また、競合コントロールにおいてこれらのタンパク質がほぼ完全に消失していることから、SAH特異性が示されています。CCMSランで同定されたタンパク質の総数およびラン間のタンパク質の重複を表にまとめました。

少なくとも2本のペプチドで同定されたタンパク質の数を括弧内に示します。比較可能な実験間で、主に非特異的なタンパク質の高い重複が見られることから、本手法の高い再現性が推測されます。特に、ここでは少なくとも2本のペプチドで堅牢に同定されたタンパク質においてその傾向が顕著です。ベン図は、キャプチャーアッセイ、コンペティションコントロール、およびプルダウンにおける同定タンパク質の重複を示しており、右側には全同定タンパク質数（および括弧内に少なくとも2本のペプチドで同定されたタンパク質数）を、左側にはメチルトランスフェラーゼおよびSAHヌクレアーゼの数を示しています。

これまで、キャプチャー化合物質量分析法（CCMS）を用いて、大腸菌（e coli）の細胞溶解物やその他の組織・細胞溶解物から、メチルトランスフェラーゼやその他の機能的サブプロテオームを単離および同定する方法を説明しました。この手順を行う際は、サンプルを冷却し、キャプチャー化合物が可視光に長時間さらされるのを避けることが重要です。また、磁気ビーズから捕捉されたタンパク質を遊離させるために使用するTFAアセトニトリル溶液を調製直前に準備すること、および、塵や実験者由来のケラチンなどの外部タンパク質源による実験の汚染を防ぐことが重要です。

また、オフビート構成か、あるいはプリキャプチャー化合物とタンパク質および溶液の間で光架橋が行われる構成か、あるいは現在説明したオンビート構成のどちらがより優れた性能を示すかは、具体的なセットアップに依存することがわかりました。以上で終了です。ご視聴ありがとうございました。皆さんの実験の成功をお祈りしています。