ダイナミッククランプ法を用いたラット中脳ドーパミン作動性ニューロンにおけるNMDA受容体のコンダクタンスのアプリケーション

神経科学者は、脳内のニューロンがどのように通信しているかを調べることで、脳の機能を研究しています。ここでは、ダイナミッククランプ法を用いて、実験的に制御されたコンダクタンスを適用することにより、単一ニューロンの電気活動の変化を誘発します。まず、薄い脳切片を作成し、人工脳脊髄液で満たしたインキュベーションチャンバーに保存します。

その後、切片をパッチクランプ記録装置に移します。ニューロンを選択し、記録増幅器に接続されたダイナミッククランプコンピュータを用いて、記録電極でパッチを行います。そして、細胞内にNMDA受容体コンダクタンスを印加します。

得られた記録では活動電位のバーストが見られ、NMDA受容体の活性化が、ドーパミン作動性ニューロンがバーストを生成できる細胞メカニズムの一つであることが示唆されました。直流注入や薬理学的処理といった現在の手法に対する本手法の主な利点は、実験的に定義された受容体の活性化が生存ニューロンの電気活動に及ぼす影響を正確に決定できることです。麻酔をかけたBragg dollyラットから脳を迅速に摘出し、振動ミクロトームを用いて240 µmの水平脳切片を作成しました。

スライスを切り出した後、記録実験を行うまで、人工脳脊髄液を満たした32 °Cのインキュベーションチャンバーに転送ピペットを用いて移します。細胞内記録装置は、勾配コントラストイメージング用に設定された対物レンズを備えた顕微鏡、モニター、灌流システム、Multi Clamp 700 Bアンプ、A/Dコンバータ、マイクロマニピュレーター、およびヘッドステージで構成されています。データ収集ソフトウェアであるAxoGraph XおよびMulti Clamp Commanderソフトウェアは、Mac Proコンピュータで動作させています。細胞内記録装置とMac Proコンピュータの隣には、ダイナミッククランプ法に使用するA/Dコンバータを備え、リアルタイムLinuxを搭載したSun Microsystems社製コンピュータを配置しています。

細胞内記録装置では、約35°Cの人工脳脊髄液を還流させておく必要があります。記録に用いるスライスが水平に作製されている場合は、転送ピペットを使用して人工脳脊髄液を入れたペトリ皿に配置し、切断ツールを用いてスライスを正中線に沿って二分します。次に、電気生理学的記録を行うため、ピペットを用いてスライスを細胞内記録装置へ移します。

40倍の対物レンズを使用して、ここにある標的ニューロンを可視化します。黒質ドパミン作動性ニューロンが1個確認できます。2本の樹状突起が伸びている楕円形の細胞体に注目してください。電子式P 97マイクロピペットプラーを用いて、先端抵抗が4～10 MΩの電極を製作します。

次に、マイクロフィルシリンジの針を用いて、電極に内部溶液を満たします。アンプのヘッドステージに接続されたハーフセルに、短いチューブでハーフセルに接続したシリンジを用いて、溶液を満たした電極を挿入します。記録電極にわずかな正圧をかけます。

視覚的なガイドに従い、電極を標的ニューロンに降ろします。細胞表面にディンプル（くぼみ）が確認できます。少量の陰圧をかけ、目的のニューロンにギガシールを形成します。

口で吸引してシールを破ります。これにより、ホールセル記録が行われます。シールを破った後、Multi Clamp Commanderソフトウェアインターフェースを使用して、電流を注入しない電流クランプモードにアンプを設定します。

この細胞にNMDAコンダクタンスを適用するには、まずダイナミッククランプ用コンピュータでRTXIソフトウェアを実行します。次に、NMDA受容体を含むカスタム作成のモデルをメモリにロードします。モデルがRTXメモリにロードされると、ここに示した方程式を用いて、細胞に注入する電流をリアルタイムで計算します。ここでG-N-M-D-Aは、0 nSに設定された目的のコンダクタンス（単位：nS）です。

Semensにおいて、デフォルトのMGはマグネシウム濃度です。E-N-M-D-AはNMDA受容体の逆転電位であり、0 mVに設定されています。VMはアンプから測定された細胞の膜電位（mV）です。次に、標準的なBNCケーブルを使用して、ダイナミッククランプコンピュータの出力を、アナログ-デジタルコンバータを介してアンプのコマンド入力に接続します。

Multi Clamp Commanderソフトウェアインターフェースを使用して、アンプを標準的な電流クランプモードicに設定します。RTXIは、Axo Graph Xデータ収集ソフトウェアからの電圧信号によって、目的のコンダクタンスGFTを受信するように設定されています。ここでは、細胞に1秒間の40 nano Siemensのコンダクタンスステップを適用する単純なAXO Graph Xプロトコルを実行します。

本ビデオで説明するセットアップを用い、中脳黒質緻密部のドーパミン作動性ニューロンから全細胞体記録を行うことで、コンダクタンスステップに応答した活動電位のバーストを誘発します。ドーパミン作動性細胞は通常、ペースメーカーのようなパターンで低頻度に自発的に発火します。ダイナミッククランプを用いてNMDA受容体コンダクタンスを位相的に適用することで、活動電位のバーストを誘発することが可能です。

このビデオを視聴することで、隔離脳スライス内の生存ドーパミン作動性ニューロンにNMDAコンダクタンスを適用する方法について十分な理解を得ることができるはずです。ただし、この手法は標準的な電気生理学的手法で記録可能なあらゆる細胞型に使用できます。同様に、ダイナミッククランプは、広範囲の受容体タイプの電気的効果を模倣するように拡張することが可能です。

このビデオが、ダイナミッククランプ法の概要および当研究室での活用方法をご理解いただくのに役立ったことを願っております。ご視聴ありがとうございました。