遺伝的関連の機能的基準をテストするための対立遺伝子特異的遺伝子発現アッセイ
November 3rd, 2010
遺伝的関連は、多くの場合、機能レベルで解明されないままである。このメソッドは、転写されたSNPについてヘテロ接合体の細胞を分析することによって遺伝子発現の表現型に関連する遺伝子マーカーの効果を評価することを目的とする。技術は、アレル特異的なプライマー伸長産物を定量化するためにMALDI - TOF質量分析法による正確な測定が可能になります。
次の実験の全体的な目標は、疾患に関連するものなどの特定のDNA変異体が特定の遺伝子の発現に影響を与えるかどうかをテストすることです。これは、このバリアントと目的遺伝子のコードスニップの両方に対してヘテロ接合性である細胞株を選択することによって達成されます。第2のステップとして、DNAとRNAを細胞から抽出し、対立遺伝子特異的な一次伸長反応のテンプレートとして使用します。
次に、一次伸長産物を質量分析法で分析し、2つの対立遺伝子の相対的な存在量を定量化します。質量分析による定量的対立遺伝子特異的測定に基づいて、疾患に関連する元のDNA変異体が遺伝子発現の違いにも関連しているかどうかを示す結果が得られます。この技術の主な利点は、ルシフェラーゼで報告された遺伝子アッセイとは異なり、分子操作を必要とせず、遺伝子発現の内因性レベルを測定することです。
さらに、2つの対立遺伝子間の発現レベルを内部制御された方法で比較できるため、実験のばらつきの一部が排除されます。この手法は、遺伝的関連性の根底にある分子メカニズムなど、人類遺伝学の分野における重要な疑問に答えるのに役立ちます。この方法のアイデアは、3つの遺伝子にまたがる遺伝的関連性を特定し、シグナルを1つの遺伝子に絞り込むことができなかったときに最初に設定しました。
より遠くの遺伝的マッピングによって。このアッセイに使用する細胞は、目的の遺伝子を発現するだけでなく、2つの基本的な遺伝子型の要件を満たす必要があります。それらは、疾患に関連するDNA配列およびDNAマーカーの両方についてヘテロ接合性でなければならず、DNAマーカーは、それらの染色体起源に基づいて転写物を区別することができる ここに示される細胞株選択戦略では、細胞株AおよびB、三角形で表される転写されたコードマーカーのためのヘテロ接合体である。
しかし、オムニセル株Aは、円で表されるリスクDNA変異体と呼ばれる疾患に関連するDNA配列に対してヘテロ接合体です。リスクバリアントの青色対立遺伝子は、転写の低レベルと関連しています 細胞株の培養を選択した後、サプライヤーの仕様に従ってフラスコ内の細胞、このデモンストレーションでは線維芽細胞を使用します。このアッセイは、初代細胞を含む他の細胞タイプにも同様に適用できますが、DNAおよびRNA抽出用にそれぞれ10cmのシャーレを2枚調製します。
細胞が80%のコンフルエントに達すると、選択した細胞タイプに適した市販のキットを含む標準的な方法を使用して、DNAおよびRNA抽出のために細胞を回収できます。I このアッセイを実行する前に、各DNAマーカーに対して2対のPCRプライマーを設計し、1対はゲノムDNA増幅用、もう1対はCDNA増幅用の1組、ゲノム汚染を避けるために異なるエクソンでのCDNA増幅用のフォワードおよびリバースプライマーを配置し、各細胞株について長さが100〜500塩基対の範囲のPCR産物を得るためのプライマーを設計し、8マイクロリットルのPCR反応を準備しました。ゲノムDNA増幅のための4つの独立した反応と、CDNA増幅のための4つの独立した反応。
PCR反応に関連するマイクロには、MLAのタックdn、NTPプライマー、塩化マグネシウム、およびゲノムDNAまたはCD NAが含まれています。各プライマーペアに最適化された条件下でPCR反応を実行し、サイクル数を増幅の線形フェーズに保ちます。PCR反応が完了したら。各PCR産物にエキソヌクレアーゼ1とエビアルカリホスファターゼSAPを添加し、摂氏37度で20分間インキュベートし、続いて摂氏85度で15分間インキュベートすることにより、PCRプライマーと過剰なDN TPSを除去します。
各PCR産物を384ウェルプレートに2回スポットし、各サンプルで8回の測定が可能になるようにします。プライマリーエクステンションアッセイでは合計16スポット。アッセイデザインソフトウェアを使用してエクステンションプライマーを設計し、ゲノム製品とC-D-N-A-P-C-R製品の両方に同じプライマーを使用できるようにします。
プライマーの長さは、14 から 18 塩基対の範囲で指定します。3つのデオキシヌクレオチドターミネーターと1つのデオキシヌクレオチドの適切な混合物で一次伸長反応を行います。典型的な一次伸長反応には、摂氏94度で2分間の開始ステップ、続いて摂氏94度で5秒間、摂氏52度で5秒間、摂氏72度で5秒間の40サイクルが含まれます。
最後に、拡張されたオリゴヌクレオチドは、スペクトロリーダー質量分析計を使用したマトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間質量分析によって定量されます。このプロトコルの重要なポイントは、いくつかの戦略を使用して実験的なノイズを制御し、アーティファクトをロールアウトすることです。少なくとも3回は実験を繰り返すことが本当に大切です。
この実験の最良の制御は、一次伸長のためのコーティングスニップアッセイに細胞株ヘテロ接合体を使用することですが、これは疾患に関連する対立遺伝子を保有しません。さらに、代替DNA転写コードマーカーのアッセイを設計します。これらが利用できない場合は、一次伸長アッセイの異なるエクソンを標的とする代替PCRプライマーペアによって追加のコントロールを提供できます。
内部制御は、エクステンションプライマーの設計と、フォワードストランドとリバースストランドの両方にひざまずくことで提供できます。ここでは、対立遺伝子特異的発現解析の例を、質量分析トレースの例とともに示します。この図は、4つの異なるテンプレートで実施された4つの対立遺伝子特異的一次伸長製品の分析結果を示しています。
上の2つのグラフは、転写されたコード多型のヘテロ接合体である2つの異なる細胞株のゲノムDNAの分析から得られた結果を表しています。ただし、細胞株AのみがリスクDNA分散に対してヘテロ接合体です。これらの下の2つのグラフは、実験アーティファクトの結果として同じ細胞株から生成されたCDNAの分析から得られた結果を表しています。
ゲノム解析でも、最初のピークは常に2番目のピークよりも高くなります。したがって、ゲノム解析の結果は、CDNAデータの正規化に使用されます。統計解析は、マスアレイタイプのソフトウェア内ですべてのELOタイピングレポートを抽出することによって行われます。
このレポートはピーク面積に関するデータを提供し、ここでは、2つの細胞株、細胞Aと細胞Bのヘテロ接合性(コードスニップ)に対する相対的な例を示しますが、細胞Aのみが疾患関連マーカーに対してヘテロ接合性です。「Columns lay wood in gray」はソフトウェアによって直接生成され、「Columns lay wood in green」は各セルに対して手動で取得されます。CDNAとゲノムDNAの両方について8つの測定があります。
ソフトウェアは、2つの対立遺伝子のそれぞれの存在量を表す各スペクトルピークの下の面積を計算します。対立遺伝子比は、各CDNAおよびゲノムサンプルについて、対立遺伝子1の面積を対立遺伝子2の面積で割ることによって計算されます。平均誤差と標準誤差は、8 つの測定値にわたって計算されます。
標準誤差が 0.1 より大きい場合は、測定値に一貫性がないため、無視する必要があることを示します。最後に、CDNA平均比は、ゲノムDNA平均比を使用して正規化され、対立遺伝子特異的発現に差がない場合に予想される1の比率からの偏差を推定します。正規化された比率は細胞Aのものとは異なりますが、細胞Bの1に近いデータは、細胞株Aが第2のピークで測定された対立遺伝子と位相的にDNA変異体を保有していることを示唆しており、これにより解析中の遺伝子の発現が減少します。
細胞株Bは、非常に便利なネガティブコントロールを提供します。この手順を試みる際には、有益な遺伝的変異を定義し、適切な実験的コントロールを定義することが非常に重要です この手順に続いて。ハプロタイプ、特異的クロマチン免疫沈降などの他の方法も使用でき、対立遺伝子特異的遺伝子発現の解析に使用する転写マーカーがない遺伝的変異がどこにあるかなどの質問に答えるのに役立ちます。
このビデオを見れば、対立遺伝子特異的な方法でRNAを解析する方法と、これを使用して遺伝的に重要な機能的変異を理解する方法についてよく理解できるはずです。
概要
この研究は、転写されたSNPのヘテロ接合細胞を分析することで、遺伝子発現に対する表現型関連遺伝子マーカーの影響を調査します。この方法は、MALDI-TOF質量分析を用いて、対立遺伝子特異的プライマー延長産物を正確に定量化します。
主要な研究構成要素
科学の分野
- 遺伝学
- 遺伝子発現
- 質量分析
背景
- 遺伝的関連性はしばしば機能的な説明を欠いています。
- DNA変異と遺伝子発現の関係を理解することが重要です。
- この方法は遺伝子発現レベルの直接測定を可能にします。
- 内部制御アプローチを使用することで実験結果の変動に対処します。
研究の目的
- 特定のDNA変異が遺伝子発現に与える影響を評価すること。
- 遺伝的関連性を特定の遺伝子に絞り込むこと。
- 遺伝的関連性に背後にある分子メカニズムへの洞察を提供すること。
使用された方法
- 疾患関連変異とコーディングSNPの両方に対してヘテロ接合細胞株の選択。
- 培養細胞からのDNAとRNAの抽出。
- 対立遺伝子特異的プライマー延長反応と続く質量分析。
- 実験ノイズとアーティファクトを最小限に抑えるための制御戦略。
主な結果
- 対立遺伝子特異的発現の定量測定が得られました。
- 結果はリスク変異と遺伝子発現レベルとの相関を示しました。
- 実験変動性を減少させるこの方法の有効性を示しました。
- 遺伝的関連性の背後にある分子メカニズムへの証拠を提供しました。
結論
- この方法は遺伝的変異に関連する遺伝子発現を研究するための信頼できるアプローチを提供します。
- 遺伝的関連性の機能的意味の理解を深めます。
- この技術は線維芽細胞以外にも様々な細胞タイプに適用できます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Allele-specific gene expression assays provide a direct, quantitative approach to interrogate the functional impact of genetic variants on gene regulation in disease-relevant cellular contexts. This capability is critical for de-risking target validation and clarifying the molecular basis of genetic associations, enabling more confident progression of targets through early discovery inflection points. Integrating such assays into biopharma pipelines supports portfolio decisions by linking genotype to functional consequence with high predictive value.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct testing of whether disease-associated DNA variants alter gene expression in endogenous systems.
- Supports functional target validation by quantifying allele-specific transcript abundance in heterozygous cell lines.
- Reduces mechanistic ambiguity by providing internally controlled, quantitative readouts of variant effects.
- Facilitates prioritization of genetic associations for downstream therapeutic development.
Screening & Assay Development
- Prepares validated cellular systems for downstream screening by confirming genotype-dependent expression differences.
- Delivers reproducible, quantitative outputs using mass spectrometry-based detection of allele-specific transcripts.
- Enables assay standardization and scalability across multiple cell types and genetic backgrounds.
- Supports reliable evaluation of compound effects on gene expression in genetically defined systems.
Translational & Preclinical Research
- Aligns functional genomics data with disease-relevant biomarkers by linking risk variants to expression changes.
- Provides continuity from genetic association studies to preclinical model validation.
- Informs risk-adjusted advancement decisions by clarifying the molecular mechanism of candidate targets.
- Enhances predictive confidence for translational research by using endogenous gene regulation contexts.
Pipeline & Workflow Integration
This assay fits at the intersection of early discovery, target validation, and preclinical research, bridging genetic association findings to functional molecular evidence.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by quantifying the impact of specific variants on gene expression in relevant cell types.
- Screening: Provides standardized, quantitative allele-specific expression data for assay readiness and reproducibility.
- Analytics: Generates normalized allelic ratios and statistical outputs to compare variant and control conditions.
- Translational Research: Connects genetic risk markers to functional gene regulation, supporting biomarker alignment.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable platform for functional genomics studies across diverse targets and cell systems.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic uncertainty in target validation.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible, and scalable workflows for allele-specific expression analysis.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and capital-efficient portfolio management by clarifying variant function.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of genetically validated targets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in molecular genetics, primer design, and mass spectrometry analysis.
- Needs access to MALDI-TOF mass spectrometry and specialized software for allelic quantification.
- Demands rigorous experimental controls and replication to ensure data reliability.
- Must select cell lines heterozygous for both risk variants and coding markers, with appropriate gene expression.
- Adaptation to other cell types or genetic backgrounds may require additional marker identification and validation.
