Name: 遺伝的関連の機能的基準をテストするための対立遺伝子特異的遺伝子発現アッセイ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-11-03T16:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 17 s
Description: 学ぶ対立遺伝子特異的遺伝子発現アッセイを用いて、疾患関連DNA変異が遺伝子発現に与える影響を評価する方法です。MALDI-TOF質量分析により、ヘテロ接合細胞におけるアレル特異的発現を正確に定量し、遺伝的関連の機能的基盤を解明します。

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この作品は、APM [076566/Z/05/Z]、JCK [074318]と人類遺伝学[075491/Z/04]のためのウェルカムトラストセンターへのコアの賞への補助金を通じてウェルカムトラストによって資金を供給された。

1）細胞培養<ol><li>目的の遺伝子を発現する細胞の種類を選択してください。 </li><li>両方のDNAのリスクの亜種と目的の遺伝子（図1）内で転写されたコーディングの多型のヘテロ接合体細胞株を選択してください。 </li><li>文化サプライヤーの仕様に、それぞれDNA及びRNA抽出のために2 × 10cmペトリ皿を準備応じて選択された細胞株。 </li><li>細胞が80％コンフルエントに下記の手順に従ってまたは市販のキットを使ってどちらかの収穫量の細胞への手続きを開始し、DNAとRNAを単離に到達すると。 </li></ol> 2）DNAの抽出<ol><li>料理からメディアを削除する、PBSで洗浄し、溶解液（0.6％SDS、100mMのNaCl、50mMトリス、20mMのEDTA、50μg/ mLのRNase Aを）の料理500μLに追加します。 </li><li>室温で20分間穏やかにプレートを揺らし。 </li><li> 37℃で一晩マイクロ遠心チューブやインキュベートに細胞ライセートをこすり落とす。 </li><li> 100μg/ mlの終濃度にプロテイナーゼKを追加し、37℃で一晩インキュベートする。 </li><li>フェノール - クロロホルムpHを8、繰り返し、同量のDNAを抽出し、クロロホルム/イソアミルアルコールの等量を抽出する。 </li><li> 1 / 10量の3 M NaClおよび100％エタノールを2.5倍量でDNAを沈殿させる。 </li><li> 4℃で30分間、13,000 rpmで回転して氷上で5分間のままにして、 </li><li> 70％エタノールでDNAを洗浄、空気乾燥し、TE200μlに再懸濁させることができます。 </li><li>室温で2日間に向けて出発して65℃でインキュベートする1​​0分間と。 </li><li> 4℃-20℃または長期℃に</li></ol> 3）RNA抽出<ol><li> PBSで洗い、皿からメディアを削除し、室温で10分間TRIZOLとインキュベートの1 mLを加える。 </li><li>スクレイプの細胞は、マイクロ遠心チューブに数回、転送をピペットで5分間インキュベートする。 </li><li> 4℃で10,000 rpmで10分間スピン℃に</li><li>新しいチューブに上清を移し、クロロホルム200μLを加える。 </li><li>振ると4℃10,000 rpmで10分間スピン℃に</li><li>新しいチューブに水相を移し、70％エタノールの等量を追加します。 </li><li> 1または2（ボリュームに応じて）最高速度で30秒間RNeasyカラムとスピンのソリューションを読み込みます。 </li><li>ここからRNeasyキット（キアゲン）の指示に従ってください。 </li></ol> 4）核酸試料の調製<ol><li>光度計分光光度計（Thermo Scientific社）を用いてDNAとRNAの濃度を定量化する。 </li><li>製造元の指示に従ってランダムdecamersとのSuperScript III逆転写酵素（Invitrogen）を用いてRNAの500から1000 ngからcDNAを準備します。 </li></ol> 5）PCRとプライマー伸長アッセイ<ol><li>各DNAマーカーのためのPCRプライマーの設計つのペアを、ゲノムDNAの増幅とcDNAの増幅（ 図2）のための他のペアに対して1つのペア。前方に配置し、ゲノムの混入を避けるために、異なるエクソンにcDNAの増幅用のプライマーを逆に。 100から500 bpの長さの範囲でPCR産物を得るための設計プライマー。 </li><li> 0.5 U Immolase Taqポリメラーゼ（Bioline）0.8 mMのdNTPsを、2mMのMgCl 2、0.2Mの各プライマーとcDNAまたはDNAのいずれかの20ngのを含む10μLのPCR反応を準備する。つの独立した反応で各サンプルを増幅する。 </li><li>増幅の線形位相でサイクル数を保ち、各プライマーのペア用に最適化された条件下でのPCR反応を実行します。 </li><li>エキソヌクレアーゼでPCR産物を培養することにより過剰なPCRプライマーおよびdNTPを除去する私、37でエビアルカリホスファターゼ（SAP）℃で20分間。 </li><li> 8測定は各サンプルに対して使用可能になるように、384ウェルプレートに二回、各PCR産物を見つける。 </li><li>同じプライマーがゲノムおよびcDNAの両方のPCR産物のために使用できるように、アッセイデザイン（シーケノム）ソフトウェアと拡張子のプライマーを設計します。 3ddNTPsの組み合わせ（図2）を含めて14から18塩基対と拡張ミックスの範囲内にプライマーの長さを指定します。 </li><li>メーカーの指示に従ってMassARRAYシステム（シーケノム）を使用して、プライマー伸長反応とMALDI-TOF/MS分析を行う。 </li><li>典型的なプライマー伸長反応は94℃で開始するステップ℃で2分間、5秒、52℃で5秒と72℃、94℃の40サイクルが続く5秒のために含まれています</li><li>プライマー伸長産物はSpectroCLEAN樹脂を用いて洗浄し、SpectroPOINTナノリットルディスペンサーによるマイクロアレイ（チップ）上に転写されています。 </li><li>拡張されたオリゴヌクレオチドはMALDI - TOFはSpectroREADER質量分析計を用いて定量化されています。 </li></ol> 6）統計解析<ol><li>実験の一般的な品質のためのMassARRAYのタイパーソフトウェアとのMALDI-TOF/MSの結果を確認してください。 </li><li>ピーク面積のデータを含むアレロタイプ化のレポートを抽出します。 </li><li>個々のスペクトルで計算アレル1およびアレル2のピーク面積（ピーク面積比）の比率。 </li><li>各cDNAサンプルは8測定を越え、Excelで対応する関数を使用して、ピーク面積比の平均値と標準偏差を導出する。 </li><li>ゲノムDNAのための8 measurmentsで同じ平均ピーク面積比を求めよ。 </li><li>予想される1:1の比率に偏差を評価するためにゲノムの平均の比によりcDNAの平均比率を割ります。 </li></ol> 7）実験のコントロール<ol><li>実験的なアーティファクトを除外するために、少なくとも3回の実験を繰り返す。 </li><li>追加のDNAマーカーの可能な限り、設計のアッセイ。 </li><li>順方向および逆方向の両方の鎖にアニーリング複数のPCRのプライマーペアと拡張子のプライマーを設計します。 </li><li>可能な限りのDNAマーカーのヘテロ接合体であるが表現型に関連付けられているDNAのリスクの亜種を運ぶしないネガティブコントロールの細胞株などのテスト（図1及び図3） </li></ol> 8）代表の結果アレル特異的発現解析の例は、質量分析のトレースの例を図3に示します。図は、4つの異なるテンプレートで実施4対立遺伝子特異的プライマー伸長産物の分析結果を示しています。上部のグラフは、転写されたコーディングの多型についてヘテロ両方とも二つの異なる細胞株のゲノムDNAの解析から得られた結果を表します。しかし、唯一の細胞株は、リスクのDNAの変異体（図1）のヘテロ接合体である。下のグラフは、同じ細胞株から生成されたcDNAの解析から得られた結果を表します。実験的なアーティファクトの結果として、最初のピークは常にさえゲノム分析の第2ピークよりも高いです。そのため、ゲノム解析の結果を、cDNAのデータを正規化するために使用されます。正規化した後、アレル比は細胞株で1から有​​意に異なっている（第二のピークは他のスペクトルに比べて低く表示される場所）、データはそのセルの行を示唆B.それは、細胞株では1に非常に近いしている間には大電流が流れる解析で遺伝子の発現を減少させる番目のピークで測定された対立遺伝子との相におけるDNAの変異、。セルラインBは、非常に便利な負の制御を提供します。 <img src="/files/ftp_upload/2279/2279fig1.jpg" alt="図1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図1"> 図1。細胞株の選択の戦略。細胞株とBのリスクのDNAバリアント（丸）のヘテロ接合体である転写コーディングマーカー（三角形）だけ細胞株に対してヘテロ接合されています。リスクバリアントの青対立遺伝子は、転写レベルが低いと（実際の機能的変異体との密接な相関関係に直接的な影響を持つため、またはどちらか）られています。 <img src="/files/ftp_upload/2279/2279fig2.jpg" alt="図2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図2"> 図2。対立遺伝子特異的プライマー伸長アッセイ。この図は、cDNA（左）とゲノムDNA（右）テンプレートの両方を搭載し、実験手順の作業の流れを示す。 PCRプライマーは（灰色の長方形）ヘテロ接合体をコードする多型（三角形）を増幅するように設計されています。ゲノムコンタミネーションPCRプライマーは、増幅はcDNAを鋳型に行われている異なるエクソン（水色のバー）に配置されたシーケンスをアニール避けるために。 PCR産物は、多型の隣に一つの基地をアニーリング、エクステンションのプライマーを用いて行ったプライマー伸長反応の鋳型として使用され、3つのジデオキシヌクレオチドの適切な組合せ（ddNTPsは）ターミネーター（四角）一デオキシヌクレオチド（円が）延長にそれぞれ1つまたは2つの基礎の入門書。結果として得られるプライマー伸長産物はMALDI - TOF質量分析法による分離と定量化を可能にするさまざまな質量を持っている。 DNAマーカーの青対立遺伝子に対応する製品の量は、赤対立遺伝子の相対的に低くなります。 <img src="/files/ftp_upload/2279/2279fig3.jpg" alt="図3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図3"> 図3。対立遺伝子特異的発現アッセイの結果。図は、分析から質量分析の結果は、ゲノムDNAと細胞株のcDNAおよび細胞株のB（図1）で実施を示す。

<ol><li>Cookson, W., Liang, L., Abecasis, G., Moffatt, M., Lathrop, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+complex+disease+traits+with+global+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Mapping complex disease traits with global gene expression.</a> Nat Rev Genet. 10, 184-194 (2009).</li>
<li>Singer-Sam, J., LeBon, J. M., Dai, A., Riggs, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sensitive%2C+quantitative+assay+for+measurement+of+allele-specific+transcripts+differing+by+a+single+nucleotide%5BTitle%5D)+AND+%22PCR+Methods+Appl%22%5BJournal%5D)">A sensitive, quantitative assay for measurement of allele-specific transcripts differing by a single nucleotide.</a> PCR Methods Appl. 1, 160-163 (1992).</li>
<li>Yan, H., Yuan, W., Velculescu, V. E., Vogelstein, B., Kinzler, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Allelic+variation+in+human+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Allelic variation in human gene expression.</a> Science. 297, 1143-11 (2002).</li>
<li>Ding, C., Cantor, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+gene+expression+analysis+technique+using+competitive+PCR+and+matrix-assisted+laser+desorption+ionization+time-of-flight+MS%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">A high-throughput gene expression analysis technique using competitive PCR and matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight MS.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 3059-3064 (2003).</li>
<li>Gabriel, S., Ziaugra, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SNP+genotyping+using+Sequenom+MassARRAY+7K+platform%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Hum+Genet+Chapter%22%5BJournal%5D)">SNP genotyping using Sequenom MassARRAY 7K platform.</a> Curr Protoc Hum Genet Chapter. Chapter 2 (Unit 2), 12-12 (2004).</li>
<li>Lo, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Allelic+variation+in+gene+expression+is+common+in+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Allelic variation in gene expression is common in the human genome.</a> Genome Res. 13 (8), 1855-1862 (2003).</li>
<li>Liu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression-based+discovery+of+variation+in+the+human+glutathione+S-transferase+M3+promoter+and+functional+analysis+in+a+glioma+cell+line+using+allele-specific+chromatin+immunoprecipitation%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Expression-based discovery of variation in the human glutathione S-transferase M3 promoter and functional analysis in a glioma cell line using allele-specific chromatin immunoprecipitation.</a> Cancer Res. 65, 99-104 (2005).</li>
<li>Knight, J. C., Keating, B. J., Rockett, K. A., Kwiatkowski, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+characterization+of+regulatory+polymorphisms+by+allele-specific+quantification+of+RNA+polymerase+loading%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">In vivo characterization of regulatory polymorphisms by allele-specific quantification of RNA polymerase loading.</a> Nat Genet. 33 (4), 469-475 (2003).</li>
<li>Pastinen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+survey+of+genetic+and+epigenetic+variation+affecting+human+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Genomics%22%5BJournal%5D)">A survey of genetic and epigenetic variation affecting human gene expression.</a> Physiol Genomics. 16 (2), 184-193 (2004).</li>
<li>Francks, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+77-kilobase+region+of+chromosome+6p22.2+is+associated+with+dyslexia+in+families+from+the+United+Kingdom+and+from+the+United+States%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">A 77-kilobase region of chromosome 6p22.2 is associated with dyslexia in families from the United Kingdom and from the United States.</a> Am J Hum Genet. 75 (6), 1046-1058 (2004).</li>
<li>Paracchini, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chromosome+6p22+haplotype+associated+with+dyslexia+reduces+the+expression+of+KIAA0319%2C+a+novel+gene+involved+in+neuronal+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">The chromosome 6p22 haplotype associated with dyslexia reduces the expression of KIAA0319, a novel gene involved in neuronal migration.</a> Hum Mol Genet. 15 (10), 1659-1666 (2006).</li>
</ol>

利害の衝突は宣言されません。

このメソッドは、in vivoでの対立遺伝子特異的転写レベルの違いで評価することによって、遺伝子発現に疾患関連のDNA変異体の効果の評価が可能になります。このプロトコルでは相対的な転写産物量はMALDI - TOFが、そのようなのTaqMan 6,7などのアレル特異的定量を、許可する他の技術によって測定され、使用することができます。このアプローチの主要な制限は、転写されたコーディングマーカーの可用性です。原理に基づく方法はここで説明するが、多型の異なるクラスを利用して、記載されている。 haploChipアッセイ対策の対立遺伝子特異的ポリメラーゼII 8を RNAに特異的な抗体で分離したクロマチン免疫沈降された物質中に存在するであろう遺伝子の転写開始点または終了点のサイトの1 kb以内に位置するマーカーを用いて表現。鋳型がRNA 9異種の場合に別の方法として、イントロンのSNPは、使用することができます。 特定のプロトコルは、haploChipアッセイと組み合わせて、ここで説明した失読症（または障害を読み込む）するための候補遺伝子を同定するために成功裏に使用されています。最初に遺伝的関連の研究では、失読症とつの遺伝子10をスパニングされたに関連付けられているDNA配列を同定した。対立遺伝子特異的遺伝子発現アッセイは、失読症関連DNA変異の発現変動の存在下で3つの遺伝子の一方のみが観察ではなく、他の二つの11歳のことを示した。

<table><tbody><tr><td>PBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-4417-100TAB</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0416</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>VWR international</td><td>27788.366</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503-1KG</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E5134-500G</td><td></td></tr><tr><td>RNase A</td><td>Qiagen</td><td>19101</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2308-500MG</td><td></td></tr><tr><td>フェノール：クロロホルム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>77617</td><td></td></tr><tr><td>クロロホルム</td><td>VWR international</td><td>100777C</td><td></td></tr><tr><td>エタノール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>32221-2.5L</td><td></td></tr><tr><td>Trizol</td><td>Invitrogen</td><td>15596-018</td><td></td></tr><tr><td>RNeasyキット</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript III 逆転写酵素</td><td>Invitrogen</td><td>18080-044</td><td></td></tr><tr><td>Immolase Taq</td><td>Bioline</td><td>BIO-21048</td><td></td></tr><tr><td>dNTP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DNTP100A</td><td></td></tr><tr><td>エキソヌクレアーゼ 1</td><td>New England Biolabs</td><td>M0293S</td><td></td></tr><tr><td>シュリンプアルカリホスファターゼ</td><td>GE Healthcare</td><td>E70092Z</td><td></td></tr><tr><td>SpectroCLEANレジン</td><td>Sequenom</td><td>10053</td><td></td></tr><tr><td>MassEXTEND ddNTP/dNTPミックス</td><td>Sequenom</td><td></td><td>アッセイ設計により異なる</td></tr><tr><td>MassEXTEND サーモセクエナーゼ</td><td>Sequenom</td><td>10052</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;装置&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>冷却マイクロ遠心機</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 分光光度計</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SpectroPOINT ナノリッターディスペンサー</td><td>Sequenom</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SpectroREADER 質量分析計</td><td>Sequenom</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

遺伝的関連の機能的基準をテストするための対立遺伝子特異的遺伝子発現アッセイ

An Allele-specific Gene Expression Assay to Test the Functional Basis of Genetic Associations

一般的な複雑な形質で有意な遺伝的関連の数は絶えず増加しています。しかし、これらの団体のほとんどは、分子レベルで理解されていない。表現型上のDNA変異の効果を仲介するメカニズムの一つは、複雑な形質1の特に重要であることが示されている遺伝子発現、です。 このメソッドは、細胞のコンテキスト遺伝子発現上の特定のDNA配列の効果のテスト。原則は、疾患（リスクの亜種）2,3に関連付けられているDNA配列のコピーを運ぶ細胞を解析、遺伝子の二つの対立遺伝子に起因する転写物の相対量を測定することです。したがって、この方法で使用される細胞は二つの基本的な遺伝子型の要件を満たす必要があります：彼らは、DNAのリスクの亜種のためにとその染色体の起源（図1）に基づいて転写産物を区別できるDNAマーカー、一般的にコーディングする遺伝子多型、両方のヘテロ接合体でなければならない。 DNAのリスクの亜種とDNAマーカーは、同じ対立遺伝子頻度を持つ必要はありませんが、遺伝子マーカーの相（haplotypic）の関係を理解し​​ておく必要があります。目的の遺伝子を発現する細胞の種類を選択することも重要です。このプロトコルは、線維芽細胞から核酸を抽出するために採用された手順のことを指しますが、この方法では、主要な細胞を含む他の細胞タイプにも等しく適用可能である。 DNAとRNAを選択した細胞株から抽出され、cDNAが生成されます。 DNAとcDNAをコードするDNAマーカー4を対象とするように設計されたプライマー伸長アッセイで分析されています。プライマー伸長アッセイは、製造業者の仕様に従ってMassARRAY（シーケノム）5プラットフォームを用いて行われる。プライマー伸長産物を質量分析（MALDI-TOF/MS） - 飛行のマトリックス支援レーザー脱離/イオン化時間で分析されています。選択したマーカーがヘテロ接合体であるので、彼らはMSのプロファイル上の2つのピークが生成されます。各ピークの面積は、転写産物量に比例し、アレル比（アレル1：対立遺伝子2）生成するMassARRAYのタイパーソフトウェアの機能を測定することができる計算に。 cDNAに得られる対立遺伝子比率は対立遺伝子比が1:1の技術的なアーチファクトを補正すると予想されるゲノムDNAから測定されたものを使用して正規化されます。 1〜大幅に異なる正規化された対立遺伝子の比を有するマーカーは、表現型に関連付けられているDNA変異が遺伝子発現に影響を​​与えることを示唆し、同じセルに2つの染色体から生成された転写物の量が異なることを示している。実験的なコントロールは、結果を確認するために使用する必要があります。

遺伝的関連は、多くの場合、機能レベルで解明されないままである。このメソッドは、転写されたSNPについてヘテロ接合体の細胞を分析することによって遺伝子発現の表現型に関連する遺伝子マーカーの効果を評価することを目的とする。技術は、アレル特異的なプライマー伸長産物を定量化するためにMALDI - TOF質量分析法による正確な測定が可能になります。

一般的な複合形質との有意な遺伝学的関連の数は、絶えず増加しています。しかし、これらの関連の大部分はまだ……

本実験の全体的な目的は、疾患に関連するような特定のDNAバリアントが、特定の遺伝子の発現に影響を与えるかどうかを検証することです。これは、当該バリアントと目的遺伝子のコーディング領域にあるSNPの両方についてヘテロ接合体である細胞株を選択することで達成されます。第二のステップとして、細胞からDNAおよびRNAを抽出し、それらをアレル特異的プライマー伸長反応の鋳型として使用します。次に、2つのアレル（対立遺伝子）の相対的な存在量を定量するため、一次伸長産物を質量分析で分析します。質量分析による定量的なアレル特異的測定に基づき、疾患に関連する元のDNA変異が、遺伝子発現の差とも関連しているかどうかの結果が得られます。この手法の主な利点は、ルシフェラーゼ報告遺伝子アッセイとは異なり、分子生物学的な操作を必要とせず、内因性の遺伝子発現レベルを測定できることです。さらに、2つのアレル間の発現レベルを内部対照を用いて比較できるため、実験的なばらつきをある程度排除することが可能です。この手法は、遺伝的関連性の根底にある分子メカニズムなど、ヒト遺伝学分野における重要な疑問を解決するのに役立ちます。私たちがこの手法を着想したのは、3つの遺伝子にまたがる遺伝的関連性を特定し、そのシグナルを単一の遺伝子にまで絞り込むことができなかった時でした。さらなる遺伝子マッピングによって。このアッセイに使用する細胞は、目的遺伝子を発現しているとともに、2つの基本的な遺伝型要件を満たしている必要があります。すなわち、疾患に関連するDNA配列と、染色体由来に基づいて転写物を区別できるDNAマーカーの両方についてヘテロ接合体である必要があります。ここに示す細胞株の選択戦略では、細胞株AおよびBのうち、三角形で表される転写されたコーディングマーカーについてヘテロ接合体であるものが選ばれます。しかし、Omnicell株Aは、円で示されるリスクDNAバリアントと呼ばれる疾患に関連するDNA配列についてヘテロ接合体です。リスクバリアントの青色の対立遺伝子は、より低いレベルの転写に関連しています。サプライヤーの仕様に従ってフラスコ内の細胞株培養を選択します。本デモンストレーションでは線維芽細胞を使用します。このアッセイは初代細胞を含む他の細胞型にも同様に適用可能ですが、DNA抽出用とRNA抽出用に、それぞれ10 centimeterのペトリ皿を2枚用意してください。細胞が80%コンフルエンスに達した時点で、選択した細胞種に適した市販のキットを含む標準的な手法を用いて、DNAおよびRNA抽出のために細胞を回収できます。本アッセイの実施に先立ち、各DNAマーカーに対して、ゲノムDNA増幅用とcDNA増幅用の2組のPCRプライマーを設計します。ゲノムDNAの混入を避けるため、cDNA増幅用のフォワードプライマーとリバースプライマーは異なるエキソンに配置してください。各細胞株について、PCR産物の長さが100から500 base pairsの範囲になるようにプライマーを設計します。1回あたり、ゲノムDNA増幅用に4つの独立した反応、およびcDNA増幅用に4つの独立した反応の、計8つの8 µL PCR反応液を調製します。PCR反応用のミックスには、DNAポリメラーゼ、NTPs、プライマー、塩化マグネシウム、およびゲノムDNAまたはcDNAのいずれかが含まれています。各プライマーペアに対して最適化された条件下でPCR反応を行い、サイクル数は増幅の線形期に留めてください。PCR反応が完了したら、各PCR産物にexonuclease Iおよびシュリンプアルカリホスファターゼ（SAP）を添加し、37°Cで20分間、続いて85°Cで15分間インキュベートすることで、PCRプライマーと過剰なdNTPsを除去します。各PCR産物を384ウェルプレートに2回ずつスポットし、1サンプルにつき8回の測定値を確保します。一次伸長アッセイでは合計で16スポットとなります。ゲノムDNAおよびcDNA PCR産物の両方に同じプライマーを使用できるよう、アッセイ設計ソフトウェアを用いて伸長プライマーを設計してください。プライマーの長さを14から18塩基対の範囲で指定します。3種類のデオキシヌクレオチドターミネーターと1種類のデオキシヌクレオチドの適切な混合物を用いて、一次伸長反応を行います。代表的な一次伸長反応では、まず94 °Cで2分間の開始ステップを行い、続いて94 °Cで5秒、52 °Cで5秒、72 °Cで5秒のサイクルを40回繰り返します。最後に、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析計（MALDI-TOF MS）を用い、スペクトロリーダー質量分析計で伸長したオリゴヌクレオチドを定量します。本プロトコルの重要な点は、実験的なノイズを制御し、アーティファクトを排除するためにいくつかの戦略を用いることです。実験を少なくとも3回繰り返すことが非常に重要です。本実験における最適なコントロールは、一次伸長のためのコーティングsnipアッセイに対してヘテロ接合体であり、かつ疾患関連アレルを保持していない細胞株を使用することです。さらに、代替のDNA転写コーティングマーカーのアッセイを設計してください。これらが利用できない場合は、一次伸長アッセイにおいて異なるエキソンを標的とする別のPCRプライマーペアを用いることで、追加のコントロールを提供できます。内部コントロールは、フォワードストランドとリバースストランドの両方にアニーリングする伸長プライマーを設計することで導入できます。ここでは、質量分析トレースの例を用いて、アレル特異的発現解析の一例を示します。この図は、4つの異なるテンプレートを用いて実施した、4つのアレル特異的一次伸長産物の解析結果を示しています。上の2つのグラフは、転写されるコーディングポリモーフィズムに対して共にヘテロ接合体である2つの異なる細胞株のゲノムDNA解析から得られた結果を示しています。ただし、リスクDNAバリアントについてヘテロ接合体であるのは細胞株Aのみです。下の2つのグラフは、実験的なアーティファクトの結果として、同じ細胞株から生成されたcDNAの解析から得られた結果を示しています。ゲノム解析においても、第1ピークは常に第2ピークより高くなります。したがって、ゲノム解析の結果を用いてcDNAデータの正規化を行います。統計解析は、MassARRAYソフトウェア内のすべてのELOタイピングレポートを抽出することで実施します。本レポートではピーク面積に関するデータを提供します。ここでは、コーディングSNPについてヘテロ接合体である2つの細胞株（細胞Aおよび細胞B）を例に示しますが、疾患関連マーカーについてヘテロ接合体であるのは細胞Aのみである場合を示しています。灰色で色付けされた列はソフトウェアによって直接生成されたものであり、緑色で色付けされた列は各細胞について手動で導出されたものです。cDNAおよびゲノムDNAの両方について、8回の測定が行われています。ソフトウェアが各スペクトルピークの下方の面積を算出し、これが2つのアレルそれぞれの存在量を示します。各cDNAおよびゲノムサンプルについて、アレル1の面積をアレル2の面積で除することで、アレル比を算出します。8回の測定値全体で平均値と標準誤差を算出します。0.1を超える高い標準誤差は、測定値に一貫性がないことを示しており、無視すべきである。最後に、cDNAの平均比率をゲノムDNAの平均比率を用いて正規化し、アレル特異的発現に差がない場合に期待される比率1からの偏差を推定する。正規化された比率が細胞Aでは1から異なり、細胞Bでは1に近い場合、そのデータは、細胞株Aが第2ピークで測定されたアレルと連鎖したDNA変異を保持しており、それが解析対象遺伝子の発現を低下させていることを示唆している。細胞株Bは、非常に便利な陰性コントロールとなります。有益な遺伝子変異を特定し、適切な実験的コントロールを定義するためには、本手順を試みることが極めて重要です。本手順に加えて、ハプロタイプ特異的クロマチン免疫沈降などの他の手法を用いることも可能です。これにより、アレル特異的な遺伝子発現を解析するための転写マーカーが存在しない遺伝子変異がどこにあるか、といった疑問を解決することができます。このビデオを視聴することで、アレル特異的な方法でRNAを分析する方法と、それを用いて遺伝的に重要な機能的バリアントを理解する方法について、十分に習得することができます。

an-allele-specific-gene-expression-assay-to-test-functional-basis

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