遺伝的関連の機能的基準をテストするための対立遺伝子特異的遺伝子発現アッセイ

本実験の全体的な目的は、疾患に関連するような特定のDNAバリアントが、特定の遺伝子の発現に影響を与えるかどうかを検証することです。これは、当該バリアントと目的遺伝子のコーディング領域にあるSNPの両方についてヘテロ接合体である細胞株を選択することで達成されます。第二のステップとして、細胞からDNAおよびRNAを抽出し、それらをアレル特異的プライマー伸長反応の鋳型として使用します。

次に、2つのアレル（対立遺伝子）の相対的な存在量を定量するため、一次伸長産物を質量分析で分析します。質量分析による定量的なアレル特異的測定に基づき、疾患に関連する元のDNA変異が、遺伝子発現の差とも関連しているかどうかの結果が得られます。この手法の主な利点は、ルシフェラーゼ報告遺伝子アッセイとは異なり、分子生物学的な操作を必要とせず、内因性の遺伝子発現レベルを測定できることです。

さらに、2つのアレル間の発現レベルを内部対照を用いて比較できるため、実験的なばらつきをある程度排除することが可能です。この手法は、遺伝的関連性の根底にある分子メカニズムなど、ヒト遺伝学分野における重要な疑問を解決するのに役立ちます。私たちがこの手法を着想したのは、3つの遺伝子にまたがる遺伝的関連性を特定し、そのシグナルを単一の遺伝子にまで絞り込むことができなかった時でした。

さらなる遺伝子マッピングによって。このアッセイに使用する細胞は、目的遺伝子を発現しているとともに、2つの基本的な遺伝型要件を満たしている必要があります。すなわち、疾患に関連するDNA配列と、染色体由来に基づいて転写物を区別できるDNAマーカーの両方についてヘテロ接合体である必要があります。ここに示す細胞株の選択戦略では、細胞株AおよびBのうち、三角形で表される転写されたコーディングマーカーについてヘテロ接合体であるものが選ばれます。

しかし、Omnicell株Aは、円で示されるリスクDNAバリアントと呼ばれる疾患に関連するDNA配列についてヘテロ接合体です。リスクバリアントの青色の対立遺伝子は、より低いレベルの転写に関連しています。サプライヤーの仕様に従ってフラスコ内の細胞株培養を選択します。本デモンストレーションでは線維芽細胞を使用します。このアッセイは初代細胞を含む他の細胞型にも同様に適用可能ですが、DNA抽出用とRNA抽出用に、それぞれ10 centimeterのペトリ皿を2枚用意してください。

細胞が80%コンフルエンスに達した時点で、選択した細胞種に適した市販のキットを含む標準的な手法を用いて、DNAおよびRNA抽出のために細胞を回収できます。本アッセイの実施に先立ち、各DNAマーカーに対して、ゲノムDNA増幅用とcDNA増幅用の2組のPCRプライマーを設計します。ゲノムDNAの混入を避けるため、cDNA増幅用のフォワードプライマーとリバースプライマーは異なるエキソンに配置してください。各細胞株について、PCR産物の長さが100から500 base pairsの範囲になるようにプライマーを設計します。1回あたり、ゲノムDNA増幅用に4つの独立した反応、およびcDNA増幅用に4つの独立した反応の、計8つの8 µL PCR反応液を調製します。

PCR反応用のミックスには、DNAポリメラーゼ、NTPs、プライマー、塩化マグネシウム、およびゲノムDNAまたはcDNAのいずれかが含まれています。各プライマーペアに対して最適化された条件下でPCR反応を行い、サイクル数は増幅の線形期に留めてください。PCR反応が完了したら、各PCR産物にexonuclease Iおよびシュリンプアルカリホスファターゼ（SAP）を添加し、37°Cで20分間、続いて85°Cで15分間インキュベートすることで、PCRプライマーと過剰なdNTPsを除去します。

各PCR産物を384ウェルプレートに2回ずつスポットし、1サンプルにつき8回の測定値を確保します。一次伸長アッセイでは合計で16スポットとなります。ゲノムDNAおよびcDNA PCR産物の両方に同じプライマーを使用できるよう、アッセイ設計ソフトウェアを用いて伸長プライマーを設計してください。

プライマーの長さを14から18塩基対の範囲で指定します。3種類のデオキシヌクレオチドターミネーターと1種類のデオキシヌクレオチドの適切な混合物を用いて、一次伸長反応を行います。代表的な一次伸長反応では、まず94 °Cで2分間の開始ステップを行い、続いて94 °Cで5秒、52 °Cで5秒、72 °Cで5秒のサイクルを40回繰り返します。

最後に、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析計（MALDI-TOF MS）を用い、スペクトロリーダー質量分析計で伸長したオリゴヌクレオチドを定量します。本プロトコルの重要な点は、実験的なノイズを制御し、アーティファクトを排除するためにいくつかの戦略を用いることです。実験を少なくとも3回繰り返すことが非常に重要です。

本実験における最適なコントロールは、一次伸長のためのコーティングsnipアッセイに対してヘテロ接合体であり、かつ疾患関連アレルを保持していない細胞株を使用することです。さらに、代替のDNA転写コーティングマーカーのアッセイを設計してください。これらが利用できない場合は、一次伸長アッセイにおいて異なるエキソンを標的とする別のPCRプライマーペアを用いることで、追加のコントロールを提供できます。

内部コントロールは、フォワードストランドとリバースストランドの両方にアニーリングする伸長プライマーを設計することで導入できます。ここでは、質量分析トレースの例を用いて、アレル特異的発現解析の一例を示します。この図は、4つの異なるテンプレートを用いて実施した、4つのアレル特異的一次伸長産物の解析結果を示しています。

上の2つのグラフは、転写されるコーディングポリモーフィズムに対して共にヘテロ接合体である2つの異なる細胞株のゲノムDNA解析から得られた結果を示しています。ただし、リスクDNAバリアントについてヘテロ接合体であるのは細胞株Aのみです。下の2つのグラフは、実験的なアーティファクトの結果として、同じ細胞株から生成されたcDNAの解析から得られた結果を示しています。

ゲノム解析においても、第1ピークは常に第2ピークより高くなります。したがって、ゲノム解析の結果を用いてcDNAデータの正規化を行います。統計解析は、MassARRAYソフトウェア内のすべてのELOタイピングレポートを抽出することで実施します。

本レポートではピーク面積に関するデータを提供します。ここでは、コーディングSNPについてヘテロ接合体である2つの細胞株（細胞Aおよび細胞B）を例に示しますが、疾患関連マーカーについてヘテロ接合体であるのは細胞Aのみである場合を示しています。灰色で色付けされた列はソフトウェアによって直接生成されたものであり、緑色で色付けされた列は各細胞について手動で導出されたものです。cDNAおよびゲノムDNAの両方について、8回の測定が行われています。

ソフトウェアが各スペクトルピークの下方の面積を算出し、これが2つのアレルそれぞれの存在量を示します。各cDNAおよびゲノムサンプルについて、アレル1の面積をアレル2の面積で除することで、アレル比を算出します。8回の測定値全体で平均値と標準誤差を算出します。

0.1を超える高い標準誤差は、測定値に一貫性がないことを示しており、無視すべきである。最後に、cDNAの平均比率をゲノムDNAの平均比率を用いて正規化し、アレル特異的発現に差がない場合に期待される比率1からの偏差を推定する。正規化された比率が細胞Aでは1から異なり、細胞Bでは1に近い場合、そのデータは、細胞株Aが第2ピークで測定されたアレルと連鎖したDNA変異を保持しており、それが解析対象遺伝子の発現を低下させていることを示唆している。

細胞株Bは、非常に便利な陰性コントロールとなります。有益な遺伝子変異を特定し、適切な実験的コントロールを定義するためには、本手順を試みることが極めて重要です。本手順に加えて、ハプロタイプ特異的クロマチン免疫沈降などの他の手法を用いることも可能です。これにより、アレル特異的な遺伝子発現を解析するための転写マーカーが存在しない遺伝子変異がどこにあるか、といった疑問を解決することができます。

このビデオを視聴することで、アレル特異的な方法でRNAを分析する方法と、それを用いて遺伝的に重要な機能的バリアントを理解する方法について、十分に習得することができます。