ミツバチのテングザルの拡張レスポンスの古典的条件における行動薬理学（セイヨウミツバチ）

この手順の全体的な目的は、学習および記憶形成の根底にある分子メカニズムを研究することです。ミツバチにおいて、最初のステップは巣から自由に行き来しているハチを採取することです。次に、ハチをプラスチックチューブに固定します。

本手順の第3段階は、古典的条件付けを行うことです。学習および記憶形成への影響を調べるため、条件付け前後の特定の時点で薬物を投与することができます。手順の最終段階は、記憶の保持をテストすることです。

最終的に、薬剤投与後の行動の変化から、ミツバチにおける学習および記憶形成の根底にある分子メカニズムが明らかになる可能性があります。この手法は、記憶形成の分子メカニズムを解明することで、学習と記憶の分野における重要な問いに答えるのに役立ちます。

一般的に、この手法に不慣れな研究者は、条件付けおよび記憶想起における刺激提示のタイミングを正確に制御しなければならないため、困難に直面することがあります。また、給餌計画も極めて重要です。本手順は、私の研究室の大学院生であるcutting gearingとJohannes fabergによって実演されます。実験の前日、午後2時から4時の間に、UV透過性プレキシガラス製ピラミッドを用いてミツバチを採集してください。

研究室に戻ったら、ピラミッドを底面で固定し、頂点部分以外をタオルで覆って遮光します。頂点を開き、開口部の上のガラスバイアルにハチを1匹ずつ移動させ、その後すぐに蓋を閉めます。秋と冬の間、すべてのハチがガラスバイアルに移動するまでこの手順を繰り返します。

ミツバチが屋外で飛行していないとき、ビーハイブは温室内のネットで管理され、個々のミツバチをネットから直接捕獲します。1匹のミツバチにつき1本のガラスバイアルを使用し、バイアルを氷上で2分30秒から3分30秒間冷却してミツバチを不動化させます。ミツバチの状態を注意深く観察し、動きが止まった直後に氷から取り出してください。

固定したミツバチを、粘着テープを用いて小さなプラスチックチューブに固定します。ミツバチが頭部、胸部、脚を動かせず、かつ口器を自由に動かせる状態であることを確認してください。また、首を圧迫しないようにすることが重要です。

ミツバチの準備が完了したら、取り扱いと識別の利便性を高めるため、チューブをラックの番号付きボアホールに配置します。

チューブは常に同じ穿孔孔に戻します。ハンドリング後、コンディショニング部位とは異なる場所で、午後4時から6時の間にミツバチに給餌します。ミツバチの体や触角に触れることで、口吻伸展反応（PER）を誘発させます。

ショ糖溶液を用いて、ミツバチに約4 µLのSRA溶液を1滴摂取させます。この際、ミツバチの触角、口器、またはプラスチックチューブに溶液を塗りつけないように注意してください。各ミツバチが摂取しなくなるまで給餌します。

触覚が溶液に触れた際に、迅速かつ確実な陽性肢反射（PER）を示すことを確認します。実験のその後の夜には、各ミツバチにショ糖溶液を1滴ずつ4回投与してください。高さ約0.5〜1 cmのプラスチック製ボウルに水道水を満たします。

ハーネスを装着したミツバチを入れたラックを、ライザプレートを台としてボウルの中に配置します。ボウルを段ボールで覆い、室温で一晩保管します。採集した翌日の午前10時頃に、ミツバチに嗅覚条件付けを行います。

実験開始の30分前に、ハーネスを装着したミツバチのラックを条件付け部位の近くに配置します。ただし、ミツバチの訓練に使用する排気管の開口部からは離して配置してください。次に、フード内で条件刺激を準備します。

フィルターチップを用いて、4 µLのクローブオイルを丸型フィルターペーパーにピペットで分注します。香りを付加したフィルターペーパーを20 mLシリンジに入れ、プランジャーを挿入します。実験者に音響信号を提示するためのオーディオプレーヤーをセットします。

これにより、刺激の提示開始、刺激の終了、持続時間、および配置のタイミングを正確に制御できます。条件付けの間、ミツバチの行動を記録する準備をしてください。条件刺激の開始から無条件刺激の提示までの間に、ミツバチがSSISを伸展させた場合に正のスコアを与えます。

開いた大顎の間の仮想線を通過させる。獲得試行を開始するには、訓練するハチを選択し、排気口の前に10秒間配置する。この10秒間の間隔が終わる直前に、臭気を含むシリンジをハチの触角から3 cm離して配置する。シリンジから20 mLの空気を送り出すことで、5秒間にわたって臭気を提示する。

3秒後、湿らせた爪楊枝を用いてショ糖溶液で両触角の遠位鞭毛の腹側部分に触れ、無条件刺激を与えます。溶液が蜂の体や触角に付着しないように注意しながら、蜂に爪楊枝を舐めさせます。この複合刺激を4秒間持続させた後、蜂をトレーニング環境から取り出し、ラックに戻します。

条件刺激の提示から13秒後、1回のトレーニング試行は28秒間続きます。10分間の試行間隔を置いた後、ミツバチをトレーニングサイトに戻します。前述の手順に従って3回の試行のうち2回目を行い、さらに10分待機してから最後のペアリングを実施します。

その日のトレーニングが完了した後、ラックをボウルに戻します。午後4時から6時の間に、ミツバチ1匹につき4 µLのショ糖溶液を4回与えることを忘れないでください。先に示したように、保持テストはトレーニング後、数分から数日の任意の感覚で実施可能です。ミツバチのラックを条件付け部位の近くに30分間置き、記憶テストの準備をします。

排気口の前にハチを10秒間配置してテストを開始します。条件刺激を5秒間提示し、PER（確率的応答）の発生を記録してください。その日のテストが完了したら、ラックをボウルに戻します。

先に実演した通り、午後4時から6時の間に、1回4 µLのショ糖溶液の液滴を各ミツバチに4回与えてください。実験全体の最後に、SRA溶液で触角に触れ、ミツバチが依然として口吻を伸ばせることが確認できた個体のみを解析対象に含めます。ミツバチは実験期間全体を通じて生存し、PER（確率的餌反応）が損なわれていない必要があります。一部の研究では、薬理学的介入が嗅覚記憶に及ぼす影響を調べるために全身投与が行われます。これらの投与は、実験デザインに応じて異なるタイミングで実施されます。

まず、使い捨て下皮注射針を用いて、飛翔筋の上方にあるS scootle裂溝付近のS scootin後方の角皮に小さな穴を開けます。次に、ガラスキャピラリーチューブに、試験する溶液を1 µL充填します。このキャピラリーを角皮の穴に挿入し、飛翔筋に溶液を注入します。

熟練した実験者は30秒に1回Bを注入することができ、これにより注入と条件付けの正確なタイミング制御が可能になります。ここでは2つの実験を提示します。最初の実験では、トレーニング前に生理食塩水を全身投与した際の影響が、記憶の学習にどのように作用するかを検証します。

本研究では、治療なしのA群、1 µLのリン酸緩衝生理食塩水を全身投与した群、またはシャム群の3つの群を設定しました。これらの処置は、左に示されている訓練の30分前に行われました。獲得期に条件反応を示した動物の割合は、3回の訓練回数を経て増加しましたが、群間に差は認められませんでした。

右側の棒グラフは、PBSの注入および擬似病変のいずれも記憶保持に影響を与えなかったことを示しています。2回目実験のトレーニングから24時間後、トレーニングから40分後に注入を行いました。ミツバチを、生理食塩水を受ける群と、タンパク質合成阻害剤であるanisomycinを1 µL受ける群の2群に分けました。右側の棒グラフは、anisomycinを受けたミツバチにおいて記憶保持が明らかに低下していることを示しています。これらの結果は、嗅覚記憶の形成におけるタンパク質合成の重要性を強調するものです。

この手順に従い、学習および記憶形成の発生後の神経生理学的基盤は何かといった追加の疑問に答えるために、電気生理学的記録を行うことができます。この手法は、学習および記憶研究分野の研究者が、ミツバチの記憶形成における分子および神経生理学的メカニズムを探索するための道を切り開きました。