X -線結晶構造のためのタンパク質の結晶化

この手順の全体的な目標は、ここでX線回折実験用のタンパク質結晶を作製することです。結晶スクリーニングのための3つの異なる技術が実証されています:吊り下げ滴と座滴を含む蒸気拡散結晶化法、および蒸気拡散結晶化のためのマイクロバッチ結晶化法が説明されています。井戸は沈殿物で満たされています。

次に、高濃度の精製タンパク質サンプルを沈殿剤と混合します。次に、混合液滴を沈殿剤溶液を含むウェルに密封します。マイクロバッチ結晶化は、ウェルにパラフィンオイルを充填することから始まります。

その後、タンパク質をウェルにロードし、続いて沈殿液をロードします。すべての方法の最後のステップは、システムを平衡化させ、液滴内の結晶の外観と成長を追跡することです。最終的に、この技術から結晶を得ることができ、適切な検出器を備えたX線源を使用してタンパク質の回折パターンを決定できます。

こんにちは、イェール大学の分子生物物理学および生化学学部のヨガ・モティス教授の研究室のサルです。今日は、精製されたタンパク質の結晶化の手順をご紹介します。私たちの研究室では、この手順を使用して、ウイルス感染の構造的基盤を研究しています。

それでは、始めてクリスタルを育てましょう。選択した高分子の結晶化法を特定するために、スパースマトリックス不完全要因法の試験条件を利用するために選択された市販の結晶化溶液を使用して初期スクリーニングを行うことができます。これらの条件は、高分子の既知の、そして一般的に成功した結晶化条件に基づいて選択されます。

結晶化条件がわかったら、元のヒットの周りのpHの沈殿剤濃度を変化させて、狭いスクリーンを組み立てることができます。通常、これらのスクリーニングに使用される結晶化条件は、沈殿剤のアサルトとpHを設定するための緩衝液で構成されており、このデモンストレーションでは、すべてのストック溶液を0.22ミクロンのフィルターでろ過する必要があります。ニワトリリソソームの以前に同定された結晶化条件は、沈殿剤がさまざまなpHの0.1モル酢酸ナトリウム中にさまざまな濃度の塩化ナトリウムの1ミリリットル溶液を調製することにより手順を開始するときに、塩化ナトリウムとともに使用されます。

次に、タンパク質サンプルをマイナス80°Cで解凍し、氷上に保ちます。一般的なタンパク質濃度は、1ミリリットルあたり5〜50ミリグラムの範囲であり、濃度が高いほど、通常はより良い結果が得られます。ここでは、0.02モル酢酸ナトリウムpH 4.9中の鶏卵リソソームの50ミリグラム/ミリリットルの溶液が使用されます。

サンプルを18, 000 G、摂氏4度で15分間回転させ、部分的に凝集したタンパク質や解凍ステップからの沈殿物を除去します。これらの凝集体は、結晶成長を妨害し、さらなる凝集を促進する可能性があります。遠心分離後。

UVスペクトル光度計を使用して、280ナノメートルの吸光度からタンパク質濃度を決定します。タンパク質濃度は、吸光度の読み取り値とタンパク質の吸光係数から計算できます。タンパク質サンプルの準備ができたら、トレイマップに従って、24ウェルハンギングシッティングドロップ結晶化トレイに500マイクロリットルの沈殿液を充填します。

空気が井戸に逃げることができるように、リングを完全に閉じずに、各ウェルの端の周りにシリコングリースリングを作成します。天井。凝縮したエアスプレーまたは専門家によるワイプでカバースライドを清掃して、ほこりを避けると、結晶化液滴の解釈が容易になり、汚染がなくなります。次のステップは、同量のタンパク質サンプルとリザーバー溶液をカバースライドにピペットで移すことです。

ただし、最適化プロセスの一部として、沈殿物よりも多くのタンパク質を使用して異なる量のタンパク質と沈殿剤を試すことができ、平衡化滴中のタンパク質の正味濃度が得られ、これはデュートタンパク質サンプルや結晶核形成または成長を遅らせるために望ましい場合があります。このデモンストレーションでは、0.02モル酢酸ナトリウム中の50ミリグラム/ミリリットルのリゾチームを2マイクロリットル使用しています。pH 4をカバースライドの中央に装填し、続いて2マイクロリットルの結晶化溶液を装填します。

タンパク質とリザーバー溶液をカバースライドにピペッティングするときは、ピペットから空気が吹き出されるときによく発生する気泡の形成を避けるために細心の注意を払ってください。液滴中の局所的に高い沈殿物濃度による早期のタンパク質沈殿を防ぐために、液滴を穏やかに混合することは、ピンセットを使用したポリエチレングリコールなどの粘性沈殿物にとって特に重要です。カバースライドを静かに裏返し、その上のグリースリングに置き、空気が井戸から逃げることができるように、これを方向性を持ってよく実行します。

そうしないと、空気がカバースライドを持ち上げ、ウェルシールを損なう可能性があります。トレイが完成するまで、次のウェルに進みます。トレイをセットしたら、目視検査を行い、タンパク質結晶の誤検出を減らす可能性のある粉塵粒子やその他の汚染物質を排除します。

スコアシートを使用して実験を文書化します。次に、トレイを通常4°Cから室温までの所望のインキュベーション温度に置きます。最も成功した温度は摂氏20度です。

トレイは優しく取り扱い、移乗中やインキュベーション中の振動や温度変化が結晶の成長を妨げたり、結晶品質に悪影響を及ぼしたりしないように注意してください。翌日と数日ごとにトレイに結晶がないか確認し、常にトレイの取り扱いに注意してください。調査結果とドロップ形態をトレイの特定のスコアリングシートに文書化します。

結晶は通常、現れるまでに2〜5日かかりますが、結晶はほぼすぐに、または数か月後に現れることがあります。結晶化条件が特定され、結晶の成長速度がわかったら、結晶が現れて最終サイズの少なくとも半分に成長するまで、トレイを邪魔せずに放置するのが最善です。トレイを邪魔せずに放置すると、結晶核形成イベントの数を減らすことができ、その結果、座っているドロップ結晶化のためのより大きな結晶の数が少なくなり、吊り下げドロップと同じ手順に従いますが、カバースライドが不要な24ウェルシッティングドロップトレイを使用します。

代わりに、ウェルには、タンパク質と沈殿物が混合された棚があり、その上には50ミリグラム/ミリリットルのリゾチーム溶液が2マイクロリットルの棚の中央にあり、気泡の発生を防ぎます。次に、トレイのセットアップ後に2マイクロリットルの沈殿液をサンプルに加えます。ウェルを光学テープで密封し、シッティングドロップで行います。

カバースライドは必要ありません。ハンギングドロップについて説明したように、インキュベーションとクリスタルスコアリングを続けます。マイクロバッチ手順を実行します。

吊り下げ手順の説明に従って、結晶化溶液とタンパク質を調製します。マイクロバッチトレイ内のほこりやその他の大きな粒子を避けるために、新しいマイクロバッチトレイとエアスプレーを入手してください。各ウェルにパラフィンオイルを3ミリメートルの深さまで加えます。

次に、余分な油を取り除きます。次に、1マイクロリットルのタンパク質溶液をプレフィルドウェルにロードし、液滴がウェルの底に沈むことを確認します。次に、1マイクロリットルの沈殿液をウェルにロードします。

液滴がウェルの底に沈み、タンパク質液滴と融合することを確認してください。トレイが完成するまで次のウェルに移動し、ここで説明するようにインキュベーションと結晶分析を続けます。タンパク質の結晶化の典型的な結果。

実験が表示されます。非晶質沈殿は、タンパク質および/または沈殿物が高濃度にあるときに発生します。逆に、不飽和の液滴は通常透明なままです。

相分離は、タンパク質または界面活性剤が特定の沈殿物と高濃度で混合されたときに別の相に分離する場合に発生する可能性があります。最適な条件下では、タンパク質結晶はシロイヌナズナcsnを形成するはずです。ポリエチレングリコール8,000と酢酸マグネシウムで得られた7つのタンパク質結晶は、棒状に見えます。

また、1モルで得られたリソソームタンパク質の結晶、塩化ナトリウムおよび酢酸ナトリウム(pH 4.9)の結晶も示されています。このタイムラプス動画は、吊り下げ式でリソソーム結晶がセットアップ後数時間以内に大きなプリズムに成長する様子を実演しています。

を行う際に、タンパク質実験を設定する方法を示しました。高湿度は液滴の蒸発を最小限に抑えるのに役立つため、温度と湿度を安定して制御する環境で作業することが重要です。外気への液滴の曝露を最小限に抑える技術を採用するようにしてください。このため、よく整理された職場環境で運用することが不可欠です。

というわけで、これだけです。ご覧いただきありがとうございます、そしてあなたの実験に頑張ってください。