成虫（A. gambiae）におけるRNAiのアッセイのためのプロトコル
July 4th, 2007
逆遺伝学的アプローチは、蚊のベクトルの病原体にどの遺伝子が基礎となる抵抗を決定するための非常に有用であることが証明されている。このビデオプロトコルは、マラリア原虫を抱いているハマダラカ蚊、にdsRNAを注入するDimopoulosラボで使用される方法を示しています。インジェクションのセットアップを操作し、胸部にdsRNAを注入する手法が示されている。
私はリンゼイ・ガーバーで、ジョンズ・ホプキンス大学公衆衛生大学院のジョージ・ディモプロス博士の研究室の博士課程の学生です。そして、注射技術を使用してRNAiを介した遺伝子のサイレンシングを行う方法を紹介します。ですから、最初のステップは、注射する蚊を採取することです。
これらはただひどくガビをストックしています。それは男性と女性の混合物です。そして、これが私たちのバッテリー駆動の吸引器です。
内部にはファンがあり、吸引力を生み出し、蚊をこのノズルからこの貯水池に引き込みます。だから、私たちはプラグを抜くのです。小さなアクセスドアがあり、通常は蚊を中に保つためにテープで留められていますが、それを開いてノズルを挿入し、スイッチを入れて収集に使用します。
蚊が中に入ったら、ノズルの上部を差し込んで、貯水池に蚊がいるのを確認します。次に、これらの蚊に麻酔をかけたいと思います。だから私たちはこの貯水池を氷のバケツに埋め、氷で覆い、蚊が降りるのを待ちます。
さて、次のステップは蚊を注射し、それを使用するために、ナノジェット2であるこれを使用します。それは私が持つ杖の部分で構成されています。そして、これには針が含まれており、針は液体を蚊に分配します。
コントロールパネルには、塗りつぶしボタンと空のボタンがあり、針に液体を出し入れする役割を果たします。そして、これが足元です。これを床に置きます。
そして、これを足で押すと、適切な量の1滴が蚊に分配されます。そのため、蚊が氷の上にいる間、コールドブロックを摂氏0度から2度に設定してワークステーションを準備します。このコールドブロックにはフラットなアタッチメントがあり、スライドガラスが取り付けられています。
そして、これにより、私たちが蚊を操作しようとしている間、蚊が動くのを防ぐことができます。私もこのガラス毛細管針を1本取ります。これは、通常のガラスキャピラリーチューブを加熱して中央で引っ張って針を作ったものです。
そして、これが私たちの液体を保持するものです。そして、これが蚊を注入し、液体を分配するために使用するものです。したがって、次に行う必要があるのは、毛細血管針を注入ワンドに配置することです。
ノーズピースを外します。インナーリングが製造元の指示に従って配置されていることを確認してください。ガラス針をノーズピースに滑り込ませ、先端が折れないように注意してください。
それが固定されたら、ワンドの針を毛細血管の針にスライドさせ、ノーズピースをしっかりとねじ込みます。次に、毛細血管の針が注射に適した幅であることを確認することです。針が細すぎると正しい量の液体が分配されず、針の先端が太すぎると蚊が怪我をし、死に至る可能性があるため、これは非常に重要なポイントです。
これは多くの練習が必要なことですが、適切な幅は実際には蚊の適切な注射と生存にとって重要です。私がすることは、針がまだ準拠しながら安定しているように、針の先端を壊すためにあなたの細い先端の鉗子を使用することです。二本鎖RNAサンプルが必要です。
このサンプルはキットを使用して調製しました。市場には、目的の遺伝子に対して特定のダブルスタンダードRNAを生成できるさまざまなキットがあります。私たちはRNAを1マイクロリットルあたり3マイクログラムの濃度で使用し、ナノインジェクションセットでは1回の注入で69ナノリットルの位置を分注しています。
チューブは針を液体に入れ、nイジェクトの充填ボタンを使用して液体を針に引き込みます。針に必要な液体の量は、注射する蚊の数に正比例します。大丈夫です。そして今、私たちは蚊を準備する必要があります。
そこで、プラスチック製のP 2皿をバケツの氷に埋めます。蚊が動いていないことを確認し、冷たいシャーレの上に蚊を薄く広げます。これにより、私たちが作業しているときに、蚊が動かず、飛び回ることもなくなります。
次に、蚊をスライドガラスの上に置きますが、スライドガラスは摂氏0度になりました。そして、蚊の位置は、蚊をどのように注入するかにとって非常に重要です。だから、あなたはあなたの蚊が注射されたとどれが注射されていないかを知るために整然と並んでいる必要があります。
また、インジェクターで蚊に到達できるように、蚊の間に十分なスペースを確保する必要があります。そこで、個々の蚊をピーウィー皿から滑り台に移し、注意を払い、足で蚊を扱うように注意します。これにより、体が押しつぶされるのを防ぎ、その結果、生存率が向上します。
これで、注入する準備が整いました。細い先端の鉗子を使って片側の蚊を支えていますが、私は右利きなので、これを左手で使っています。そして、反対側から針の先端を胸部の側面に挿入し、蚊の胸部が鉗子の先端と針先の間に挟まれ、針先が入るように注入します。
針の先端が胸部の内側に来たら、フットペダルを押すとビープ音が鳴り、液体が蚊の胸部に分配されます。次に、次のものに移動して繰り返します。たまに針を引き抜くと、エントリーサイトから出てきた液体の滴が見えます。
そして、これが発生した場合は、液体が侵入部位に再吸収されるのを待つことができます。それが起こったとしても、それは問題ありません。滴が再吸収されない場合、滴が胸部の外側に残っている場合、その蚊は捨てられなければならず、その場所に別の蚊を注射します。
また、針が必要なだけ胸部に入るようにすることも重要です。反対側に突き刺したり、針の幅が広すぎたりするのは避けたいものです。胸部や蚊の生存が損なわれます。
したがって、必要に応じてすべての蚊に対してその手順を続けます。そこで、注射した蚊を保管するために、薄いメッシュネットで覆われ、輪ゴムと段ボールの蓋で固定された1パイントの段ボールワックス裏打ちカップを使用しました。テープで覆われているアクセスドアを開け、蚊を慎重に追加して、蚊が生き残るのを助けます。
ここにいる蚊の食料源として機能する10%ショ糖溶液と結合した綿球を追加する必要があります。そして、しっとりと折りたたんだペーパータオル。傷ついた蚊は乾燥する傾向があるため、これは湿度を維持し、注射した蚊の生存を助けるのに役立ちます。
これをペトリの蓋で締めくくって湿気を封じ込め、ペーパータオルとコットンボールが濡れたままになるようにします。そして、これを通常の環境制御条件下でインキュベートします。したがって、RNAiを介した遺伝子サイレンシングの分子動態は、遺伝子ごとにかなり異なります。
そのため、一部の遺伝子ではサイレンシングが1日以内に行われることがあり、他の遺伝子では効率的なサイレンシングが数日間行われないこともあります。各遺伝子間の違いは、定量的なリアルタイムPCRを使用して測定でき、これにより蚊の転写レベルが監視され、効率的なサイレンシングが達成されたことが通知されます。ですから、その目的のために、注射した蚊を数匹取っておくことをお勧めします。
これは、あなたの特定の二本鎖RNAが効率的なサイレンシングを達成できるかどうか、あなたの二本鎖RNAが一般的にどれほど効率的であるかを判断するのにも役立ちます。そして、あなたが実際に転写産物レベルに干渉しているなら、私はちょうど異常なガンビアの蚊のRNAi媒介遺伝子サイレンシングの手順を示しました。この手順では、ダブレット鎖RNAをAnole Gabi蚊の胸部にマイクロインジェクションします。
この手順は、蚊の個々の遺伝子を操作するのに最も簡単で効果的な廃棄物の1つであるため、重要です。
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概要
このビデオプロトコルは、マラリアの媒介者であるアノフェレス・ガンビアエ蚊におけるRNAiを介した遺伝子サイレンシングの方法を示しています。この技術は、病原体耐性に関連する遺伝子機能を研究するために、蚊の胸部にdsRNAを注射することを含んでいます。
主要な研究構成要素
科学の分野
- 神経科学
- 遺伝学
- 媒介生物学
背景
- 逆遺伝学的アプローチは遺伝子機能を理解するために不可欠です。
- 媒介者病原体への耐性はマラリア制御にとって重要です。
- アノフェレス・ガンビアエはマラリア伝播の主要な媒介者です。
- RNA干渉（RNAi）は遺伝子サイレンシングの強力なツールです。
研究の目的
- 蚊へのdsRNA注射の方法を説明する。
- マラリア病原体への耐性の遺伝的基礎を探る。
- 媒介生物学を研究する研究者のためのプロトコルを提供する。
使用された方法
- アノフェレス・ガンビアエ蚊の収集。
- 注射用dsRNAの調製。
- バッテリ駆動の吸引器を用いた蚊の取り扱い。
- 蚊の胸部へのdsRNAの注射。
主要な結果
- 成功した注射技術が実証されました。
- 標的蚊における遺伝子サイレンシングの可能性。
- この方法はマラリア耐性に関連する遺伝子機能を研究するために使用できます。
- このプロトコルは媒介制御の将来の研究の基礎を提供します。
結論
- この注射方法は蚊におけるRNAi研究に効果的です。
- このアプローチはマラリア媒介生物学の理解を深めることができます。
- 将来の研究は、このプロトコルを基に遺伝子機能を調査することができます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
This protocol enables functional gene interrogation in Anopheles gambiae, a key malaria vector, supporting target validation in vector-borne disease research. By facilitating RNAi-mediated knockdown, it aids in de-risking therapeutic hypotheses related to pathogen resistance mechanisms. The method provides a scalable approach for phenotypic screening in insect models relevant to global health R&D pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables therapeutic hypothesis interrogation by silencing specific genes to assess their role in pathogen resistance pathways.
- Operational Value: Provides a reproducible method for functional target validation in mosquito models.
- Predictive Value: Supports mechanistic de-risking by linking gene function to vector competence phenotypes.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative gene expression readouts via qPCR to measure silencing efficiency.
- Operational Value: Standardizes dsRNA delivery through precise nanoliter injection volumes.
- Scalability: Enables preparation of injected mosquito cohorts for downstream compound or genetic screening.
Translational & Preclinical Research
- Translational Relevance: Connects gene silencing outcomes to malaria parasite interaction phenotypes.
- Disease Model Continuity: Supports preclinical evaluation of targets in a pathogen-relevant insect system.
- Risk-Adjusted Advancement: Informs target prioritization based on functional impact on vectorial capacity.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within early discovery workflows, enabling target validation prior to assay development and preclinical evaluation in disease-relevant systems.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification through gene-specific knockdown in adult mosquitoes.
- Screening Readiness: Delivers standardized, quantitative outputs (e.g., transcript reduction) for evaluating genetic or chemical modulators.
- Analytics: Generates measurable dependent variables (gene expression levels) via qPCR to compare experimental conditions.
- Translational Research: Maintains continuity from gene function to phenotypic outcomes in malaria-relevant vector models.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable RNAi injection platform for iterative target interrogation across vector biology projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in gene function.
- Operational Value: Enhances reproducibility through standardized anesthesia, injection, and recovery protocols.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing functional evidence on target relevance to pathogen resistance.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on phenotypic impact in validated disease models.
Implementation Considerations
- Requires expertise in mosquito handling, microinjection, and RNAi reagent preparation.
- Depends on nano-injector instrumentation, glass capillary preparation, and cold-chain handling for mosquito viability.
- Necessitates cross-team standardization of dsRNA concentration, injection volume, and post-injection incubation conditions.
- Involves adaptation considerations across mosquito species, strains, and developmental stages.
- Includes practical limitations such as variable silencing kinetics and injection-related mortality affecting throughput.
