Name: 末梢神経突起伸長のリアルタイムイメージングのためのGFP発現マウス胚の器官型スライス培養 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-29T11:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 42 s
Description: 学ぶ末梢神経の伸長をGFP発現マウス胚の器官型スライス培養でリアルタイムイメージングする手法。蛍光顕微鏡を用いて脊髄神経の発達を観察し、発生神経生物学の研究に応用できます。

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著者らは、マウス胚5時切片培養を行うためにアイデアの元のソースを認めます。私たちは、撮影中に私たちの使い走りとして機能するために寛大な科学的なサポートとアンナデジャンためのヨアヒムキルシュに感謝します。とハイデルベルク大学（エクセレンスクラスターセルラーネットワーク）：この作品は、ドイツ研究協会（Sonderforschungsbereich 488、Teilprojekt B7/B9ドイツ学術振興）によって賄われていた。

パート1：スライスと培養のための準備。 <ol><li>培地（DMEM、25％1X HBSS、25％ウシ胎児血清、0.5％グルコース、1mMのグルタミン、2.5mMのHEPES、pH7.3）に、3 cmのMillicell - CM 0.4 -μmの文化をスライスして10cmの組織培養プレートを準備します。膜インサートと37℃のインキュベーター内で維持℃、5％CO 2。 </li><li>それは約37にとどまるように電子レンジでPBS中4％低融点アガロースを加熱し、加熱板上でそれを維持℃に</li><li> PBS（140mMのNaCl、2.7 mMのKCl、10mMののNa 2 HPO 4、1.8mmのKH 2 PO 4）と氷上の場所で10cmの細菌シャーレを埋める。 </li><li>ミクロトームの冷却装置を設定するか、そのバッファのトレイと冷却要素がそれより前のクールに冷凍庫に保存されていることを確認してください。 </li></ol>パート2：胚の埋め込み。 <ol><li>子宮から胚を摘出し、GFPの発現を確認するために倒立蛍光顕微鏡でそれらを調べる。 </li><li>過度のPBSを除去するワットマン濾紙片を使用して反転10センチのシャーレと向き、それらの上に置いて胚。 </li><li>この位置でそれを修正するために胚のアガロースを適用します。アガロースが固化してみましょう。 </li><li>かみそりの刃で切断して胚を囲む領域を制限する。 </li><li>その反対側に埋め込まれた胚を回転させる。 </li><li>胚が完全に埋め込まれていることを保証するために胚組織に追加のアガロースを適用します。 </li><li>クリーンなエッジを持つアガロースブ​​ロックを準備し、ロックタイト406"クレイジー接着剤"に似た特殊な接着剤を使用してビブラトームチャック上にマウント。 </li></ol>パート3：手順をスライス。 <ol><li>あらかじめ冷却したバッファートレイと冷却要素を設定します。 </li><li>接着組織でチャックを挿入し、カバーまで、1X HBSSを（ のCa 2 +とMg 2 +フリーHBSS、10mMのHEPES緩衝液、pH7.3、500 U / mlペニシリン/ストレプトマイシン）を追加。 </li><li> precleaned（70％エタノール）ミクロトームの刃を挿入し、固定する。 </li><li> 450μmのスライスと氷上に置き、組織培養プレートに短縮ガラスパスツールピペットを用いてそれらを転送する - 350を準備します。 </li><li>ピンセットを使用して、慎重に各スライスからアガロースを削除し、Millicellの文化膜に移す。約4スライスは、培養液6 mLで満たされた10cmの組織培養プレートの1つの膜上で培養することができる。 </li><li> 37スライスをインキュベート℃、5％CO 2（培養培地：DMEM、25％1X HBSS、25％ウシ胎児血清、0.5％グルコース、1mMのグルタミン、2.5mMのHEPES、pHは7.3）。いずれかのタイムラプスイメージング系列1を実行する場合媒質定数の体積を保持する必要があります。短い時間枠のための時限イメージングシリーズのケースでは、そのままメディアを残すのに十分です。より長い培養期間のために12〜20時間後の変更は推奨されています。 </li></ol>パート4：顕微鏡でイメージング脊髄神経突起伸長。 <ol><li>直立蛍光顕微鏡下でのスライス、とMillicell培養膜を含む、10cmの組織培養プレートを配置し、画像脊髄神経。 </li><li>次の撮影時間の時点の間に正しく配置するために顕微鏡のステージ上Millicellの文化膜の方向にラベルを付けます。 </li><li> 4 × 10倍（開口数[NA] 0.1）、（NA 0.3）、または20倍（NA 0.5）の目標を使用してイメージ脊髄神経突起伸長。 </li></ol>図1は、4倍、10倍の目標と文化の20時間の間に脊髄神経の伸長を描いたイメージングシリーズを示しています。 <img src="/files/ftp_upload/2309/2309fig1.jpg" alt="図1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図1"> ホモ接合tauGPFの胚の横スライスで脊髄神経の突起伸長の図1イメージングシリーズ。腹側脊髄の* =運動ニューロン、矢印= DRG。スライスの背側（D） - 腹側（V）軸が示されています。スケールバー：200μmの。

<ol><li>Tucker, K. L., Meyer, M., Barde, Y. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurotrophins+are+required+for+nerve+growth+during+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neurotrophins are required for nerve growth during development.</a> Nat Neurosci. 4, 29-37 (2001).</li>
<li>Brachmann, I., Jakubick, V. C., Shaked, M., Unsicker, K., Tucker, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+slice+culture+system+for+the+imaging+of+nerve+development+in+embryonic+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">A simple slice culture system for the imaging of nerve development in embryonic mouse.</a> Dev Dyn. 236, 3514-3523 (2007).</li>
<li>Collingridge, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+brain+slice+preparation%3A+a+tribute+to+the+pioneer+Henry+McIlwain%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+neuroscience+methods%22%5BJournal%5D)">The brain slice preparation: a tribute to the pioneer Henry McIlwain.</a> Journal of neuroscience methods. 59, 5-9 (1995).</li>
<li>Katz, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+circuitry+of+identified+projection+neurons+in+cat+visual+cortex+brain+slices%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Local circuitry of identified projection neurons in cat visual cortex brain slices.</a> J Neurosci. 7, 1223-1249 (1987).</li>
<li>Hotary, K. B., Landmesser, L. T., Tosney, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryo+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Embryo slices.</a> Methods Cell Biol. 51, 109-124 (1996).</li>
</ol>

妊娠中期のマウス胚の胚切片培養（E10 - E12）を調製する方法の広範な比較では、我々はビブラトームは質問なしでの文化の全体的な実行​​可能性との再現性の両方に関して最も信頼性の高い結果を生じることを観察した神経突起伸長のパターン。対照的に、マッキルウェーン組織チョッパ3を用いて調製したスライスは、完全に生存不能であることが判明した。私たちは、もともと胚の全体ゴミは同時に400μmのセクション1を生成するために格子切りの周りに直列に包まれたタングステン線でスライスして準備するおそれのあるギロチンの方法4を採用。このテクニックは、準備の速度の利点があったが、それは胚あたり最大で1つの実行可能なセクションが得られたと伸長のパラメータの変動の大きい量を示した。これらの理由から、我々はビブラトームベースの方法が準備に長い時間にもかかわらず、優れた選択であると感じている。必要性によって、このソリューションは、ビブラトームが必要ですが、結果は他の&quot;ローテク&quot;のアプローチによって達成されたものに比べて非常に優れているため、投資を正当化している。

<table><tbody><tr><td>HBSS 10x</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>14180</td><td></td></tr><tr><td>解剖器具</td><td>Fine Science Tools</td><td>各種</td><td></td></tr><tr><td>L.M.P. アガロース</td><td>Invitrogen</td><td>15517-022</td><td></td></tr><tr><td>Whatmann ペーパー</td><td>Whatman, GE Healthcare</td><td>3030917</td><td></td></tr><tr><td>短縮化した火炎滅菌ピペット</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>41966</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>Pen Strep</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine 100x</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>25030</td><td></td></tr><tr><td>ビブラトーム</td><td>Microm International</td><td>HM 650 V</td><td></td></tr><tr><td>蛍光顕微鏡</td><td>オリンパス株式会社</td><td>BX61WI</td><td></td></tr><tr><td>analySIS</td><td>Soft Imaging System</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Millicell-CM インサート</td><td>EMD Millipore</td><td>PICMORG 50</td><td></td></tr><tr><td>10 cm 培養プレート</td><td>Greiner Bio-One</td><td>633171</td><td></td></tr><tr><td>LOCTITE 406</td><td>Henkel Corp</td><td>142580</td><td></td></tr><tr><td>カミソリブレード</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>なし</td><td></td></tr><tr><td>解剖顕微鏡</td><td>ニコンインストゥルメンツ</td><td>SMZ800</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Carl Roth Gmbh</td><td>9105.2</td><td></td></tr><tr><td>グルコース</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>x4 対物レンズ</td><td>オリンパス株式会社</td><td>PL シリーズ</td><td></td></tr><tr><td>x10 対物レンズ</td><td>オリンパス株式会社</td><td>UPLFL &amp;#8211;PH シリーズ</td><td></td></tr><tr><td>フィルター</td><td>オリンパス株式会社</td><td>U-MNIBA2</td><td></td></tr><tr><td>CCD カメラ</td><td>Soft Imaging System</td><td>SIS F-View II</td><td></td></tr><tr><td>加温チャンバー用装置</td><td>Leica Microsystems</td><td>CTI-Controller 3700 およびインキュベーター S #11531171</td><td></td></tr></tbody></table>

末梢神経突起伸長のリアルタイムイメージングのためのgfp発現マウス胚の器官型スライス培養

Organotypic Slice Culture of GFP-expressing Mouse Embryos for Real-time Imaging of Peripheral Nerve Outgrowth

多くの目的のために、器官型スライスなどのマウス胚のex vivoでの栽培が望ましいです。例えば、我々は両方のフィルムの神経支配の可能性をできるように、緑色蛍光タンパク質（EGFP）の拡張版を独占的に開発し、中枢および末梢神経系1のすべてのニューロンに発現するトランスジェニックマウスのライン（tauGFP）を採用前肢および薬理学的および遺伝学的手法2でこのプロセスを操作する。このようなスライス培養の成功した栽培で最も重要なパラメータは、スライスが準備される方法です。種々の方法の広範なテストの後、我々は、ビブラトームは、彼らが日常的に数日間の期間にわたって実行可能性を示す文化につながるような胚をスライスする最良のデバイスであり、そして最も重要なことは、年齢で発症することを見出した固有の方法。妊娠中期胚の場合、これは脊髄および後根神経節から周囲と骨格と筋肉組織の適切な決定で、その目標への脊髄神経の正常な伸長を含みます。 スライス標本の後二日するまで学ぶことができる標準的な組織培養インキュベーター、栽培は400マイクロメートルのスライス - この作品では、我々は300に（E）E10 E12に日胚の全胚を処理するための手法を提案する。このアプローチの成功のための重要な各アガロース包埋の胚をスライスするビブラトームを使用することがあります。これは、インタフェースの培養技術で、その結果中​​小の小さな体積に課せMillicell文化膜インサート、時のスライスの栽培が続いている。 7胚の平均で一リットルは、日常的にわずかに胚の年齢までだけでなく、スライスの厚さにより変動する少なくとも14スライス（胚あたりの前肢地域の2-3スライス）を生成する。培養スライスの約80％が培養期間2 througout測定可能な神経突起伸長を、示す。 tauGFPのマウスラインを用いて代表的な結果が実証されています。

我々は、末梢神経突起伸長の栽培とタイムラプスイメージングのための妊娠中期のマウス胚の器官型スライスを準備する方法を提示する。

末梢神経突起伸長のリアルタイムイメージングのためのGFP発現マウス胚の器官型スライス培養

多くの目的において、マウス胚を器官型スライスとしてex vivoで培養することは有用です。例えば、我々は……において、トランスジェニックマウス系統（tauGFP）を利用しています。

本手順の全体的な目的は、脊髄神経の伸展をイメージングするために、GFP発現マウス胚の前肢領域の器官培養横断切片を作製することです。まず、胚を低融点アガロースに包埋し、組織とアガロースの範囲を目的の領域に限定することでこれを達成します。その後、切断のためにアガロースブロックを固定します。次に、ブロックに埋め込まれた胚をバイブレーターでスライスします。手順の最終ステップは、スライス周囲のアガロスを除去し、スライスを培養プレートに転移させることです。その後、スライスを培養すると末梢神経が外周に向かって伸展し、これを蛍光顕微鏡で観察することができます。ギロチンや組織チョッパーなどの既存の手法に対するこの技術の主な利点は、切片をより制御された方法で作成でき、培養における生存率が向上することです。したがって、この手法は、脊髄神経のガイダンスや伸展の観察など、発生神経生物学の研究に役立ちます。本手順の実演はIsabel barmanが行います。まず、10 cmの組織培養プレートに6 mLの培養液を分注し、3 cmのMillicell-CM 0.4 µm培養メンブレンインサートを準備して、この手順を開始してください。これらを37°C、5% CO2のインキュベーター内で保持します。次に、PBSで調製した4%低融点アガロースを電子レンジで加熱し、約37°Cに維持されるようホットプレートの上に置きます。10 cmの細菌学用ペトリ皿にPBSを満たし、氷上に置きます。次に、Viome冷却装置を準備します。胚の包埋を行うまで、バッファー・トレイと冷却エレメントを冷凍庫で完全に凍結させて保管してください。まず、子宮から胚を摘出します。倒立蛍光顕微鏡で観察し、GFPの発現を確認します。次に、ワトマン濾紙を用いて胚の向きを調整しながら、10 cmの倒立ペトリ皿に配置し、余分なPBSを除去します。胚を固定するために、アロスを塗布します。配向させた状態で、アロスが凝固するまで待ち、過剰なアロスおよび必要に応じて胚の中央部分周囲の組織をトリミングします。包埋した胚を反対側に回転させます。胚が完全に包埋されるよう、胚組織にさらにアロスを塗布します。アロスが凝固するまで待ちます。エッジがきれいな状態で、胚を埋入したアロスブロックを準備します。最後に、Loctite 4 0 6を用いてサンプルをバイオームチャックに接着します。あらかじめ冷却したバッファー・トレイと冷却素子を準備します。組織を接着させたチャックをバイオーム上に配置します。組織が浸るまで、X-H-B-S-Sをチャックに加えます。あらかじめ洗浄したビオームブレードをブレードホルダーに装着します。次に、厚さ約 350 to 450 microns の横断切片を作製します。各切片は HM six 50 V ミクロトームを用いて切断します。短く切ったガラスパストゥールピペットを用いて、スライスを組織培養プレートに移し、氷上に保持します。ピンセットを使用し、すべてのスライスから慎重に毛細血管を取り除きます。その後、あらかじめ加温した培養液を6 mL満たした10 cm培養プレート内のミリセル培養メンブレンに、1枚のメンブレンにつき4枚のスライスを配置して移します。タイムラプスイメージングの開始まで、およびイメージングの間隔中は、スライスを37 °C、5% 二酸化炭素条件下でインキュベートします。スライスを載せたMillicell培養膜を含む組織培養プレートを正立蛍光顕微鏡下に設置し、4倍、10倍、または20倍の対物レンズを用いて脊髄神経を特定し、脊髄神経の伸展を撮影します。温度および二酸化炭素濃度が安定した環境でない場合に備え、次回のイメージング時に正しく再配置できるよう、顕微鏡ステージ上のMillicell培養膜の向きをラベルで表示しておきます。ここに示されている環境は、ホモ接合体tau GFP胚の横切片における24時間の培養中の脊髄神経成長のイメージングシリーズです。星印は腹側脊髄の運動ニューロンを、矢印はDRGを示しています。上段のパネルは4倍対物レンズを用いて、下段のパネルは10倍対物レンズを用いて撮影されました。このビデオを視聴することで、脊髄神経の伸展をイメージングするために使用できる、マウス胚の器官培養横断切片の作製方法について十分に理解することができます。

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