ザリガニの脚の伸筋に高と低出力NMJsの生理的録音

この手順の全体的な目標は、形態学的染色と電気生理学的記録を用いて、ザリガニの伸筋における相位性および緊張性運動末端を露出させ、区別する方法を示すことです。これは、まず中サイズのザリガニから1番目または2番目の歩脚をつまんで、それを切り取り、メイトセグメントの屈筋を除去することから始まります。これにより、伸筋と神経束が露出します。

手順の2番目のステップは、4エチルアミノ無菌とメチルペリトニュームヨウ化物、または4 D 2 アスペートで準備を染色して、軸索と神経末端を視覚化することです。手順の3番目のステップは、緊張性または相位性のニューロンを選択的に刺激し、筋線維内の誘発EPSPの細胞内記録を同時に行うことです。手順の最後のステップは、焦点電極を使用して末端からの自発的および誘発されたquイベントを記録することです。

最終的に、免疫蛍光顕微鏡法と電気生理学により、形態学的および生理学的に緊張性と相位性の末端を区別する結果を得ることができます。この方法は、筋肉疲労、シナプス抑制、シナプス間相互作用などの分野におけるシナプス生理学の主要な質問に答えるのに役立ちます。実験は、ザリガニの爪を傷つけないよう慎重に取り扱うことから始まります。

イシアポッドセグメントで体から脚を切り離します。イシアポッドセグメントを強くつまむことで、ザリガニが自動的に、または自然に最初の歩脚を切断します。ザリガニは出血を止め、保持タンクに戻されます。

ザリガニは犠牲にされません。切断しやすいように、脚をティッシュペーパーの上に置きます。脚を回転させて、外側（外側）が解剖プレート上で上向きになるようにします。

通常、この場合、弓の側が上を向いています。鋭利な刃をスカルペルブレイカーに取り付け、図に示されているパターンに従って、メイトセグメント内のキューティクルを刻みます。メイト・カルポッド関節に沿った背側から腹側への切断で、あまり遠位に切らないように注意してください。

この切断により、メイトの上の基底筋の上に窓ができます。今のところ、キューティクルをその場所に残します。準備をザリガニ生理食塩水を含む解剖皿に入れます。

この時点で、細かいピンセットを使用して、カルポッドセグメントの中央とイシキアポッドセグメントの背側にピンを置きます。ウィンドウカットのキューティクルを遠位端から少し持ち上げ、刃で屈筋繊維をキューティクルから切り離します。遠位から近位に向かって切断を続け、最後にキューティクルの窓を持ち上げます。伸筋を露出させるには、重なる屈筋を除去する必要があります。

ピンを使用して屈筋の腱を屈筋から移動させ、分離します。次に、マリポディカルポッド関節で腱を切ります。図のように、切断する前に腱を脚の空洞から引き離すように非常に注意し、腱を切るだけにし、腱の内側にある主脚神経を切らないようにします。

ピンセットで切断した腱をつまみ、屈筋を脚から引き抜き、おんぶの向きに持ち上げて伸筋の神経を露出させます。メアポッドカルポッド関節で主脚神経を切断し、慎重に主脚神経を伸筋の上に引き戻します。伸筋への神経を主脚神経から分離するには、主脚神経の遠位端を準備の側面に優しく引きます。伸筋の上に主脚神経を剥がす際には、抑制性の軸索の小さな枝を切る必要がある場合があります。

神経束はメチレンブルー染色で視覚化できます。ただし、この上図ではメチレンブルーは電気生理学的記録には使用されません。関心のある神経の経路を示す赤い矢印。

関心のある神経束は、メアポッドの近位端の近くから主脚神経が分岐する大きな束です。神経内の軸索の分岐と、神経内に明確に見える2本の軸索に注目してください。神経と筋肉が露出したので、実験に使用する装置を準備します。

細胞内および細胞外記録は、標準的なヘッドステージとアンプで行われます。モデルアキソンクランプ2Bアンプと1 XLUヘッドを使用します。3本の電極が必要で、1本は細胞内、2本は細胞外です。

2本の細胞外電極は、神経を刺激し、シナプス誘発および自発的なqualイベントを記録するために使用されます。焦点電極を研磨し、加熱要素の上に少し曲げます。焦点電極を生理食塩水で満たした後、刺激電極ホルダーに置き、刺激ワイヤを挿入して生理食塩水と接触させます。

これは、グラスP 15刺激絶縁ユニットに接続され、グラスS 88刺激器に接続されます。電気生理学的記録中、D 2 ASP用のバイタル染料は、軸索を視覚化するために使用され、軸索を染色するために、浴用生理食塩水を4 D 2 ASP染料を含む生理食塩水に5分間交換します。5分後、ザリガニ生理食塩水で皿を満たし、準備を顕微鏡の下に置き、フォレックス対物レンズを使用します。

そして、10倍の目視レンズで、刺激電極を関心のある領域に移動させます。次のステップは、マクロパッチ刺激電極の管を相位性または緊張性の軸索の上に置くことです。4 D 2 AS染色した準備の写真は、ミトコンドリア含有量の増加により、緊張性の軸索がより明るく見えることを示しています。

相位性の末端は多数の膨大を示し、蛍光顕微鏡下では相位性の末端はより薄い性質です。そして、20倍対物レンズで、軸索を緊張性または相位性の末端に置きます。ここでは、軸索が緊張性の末端に置かれています。

細胞内電極をマイクロマニピュレーターに入れ、細胞内電極を伸筋細胞に入れます。これは、細胞内興奮性シナプス後電位またはEPSPを記録するために使用されます。質EPSPを記録するために。

2番目の焦点電極をマイクロマニピュレーターに入れます。これは、過去の細胞内電極とホルダーを取り外し、クリーンな電極ホルダーに交換することで行います。マイクロマニピュレーターを使用して、2番目の焦点電極の管を直接シナプスの膨大の上に置きます。

電極とシールの抵抗は、電極にテスト電流パルスを通すことで決定されます。我々の実験では、シール抵抗は0.3から1メガオーム、電極抵抗は0.5から1メガオームでした。シール抵抗は記録全体を通じてモニタリングできます。

刺激を開始する準備ができたら、scope 5.0ソフトウェアをオンにし、分離した軸索の刺激を開始します。神経束では、緊張性の軸索が吸引電極で刺激され、筋線維のEPSPは細胞内または細胞外電極で記録されます。EPSPは、パワーラボフォレストインターフェースを通じて