Name: ザリガニの脚の伸筋に高と低出力NMJsの生理的録音 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-11-17T17:00:00.000+00:00
Duration: 10 min
Description: 学ぶザリガニ脚の伸筋における高・低出力神経筋接合部の電生理学的記録法。形態染色と細胞内記録で位相性・緊張性終末を区別し、シナプス生理の基礎を解明します。

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我々は編集支援のために氏クレイグD.ラベン（英語学科、ケンタッキー州の大学）に感謝します。ケンタッキー州の大学、生物学科、学部及び芸術科学大学のOfficeでサポート。

1）はじめに運動ニューロンは、総称して神経筋接合部（NMJ）と呼ばれるシナプスにおける筋線維と通信します。 NMJsは、ほとんどのザリガニの筋肉の準備に簡単にアクセスすることができます。ザリガニのNMJsの多くは、脊椎動物のNMJsに記載されている哺乳類の中枢神経系または閾値以下の応答の中でシナプス後樹状突起で発生した段階的な電気信号に似て非スパイク興奮性シナプス後電位（EPSP）を示す（Wiersma＆ヴァンHarreveld、1938年、カッツ＆カフラー、1946） 。ザリガニのNMJsは、シナプス伝達とシナプス分化に一般的な洞察を提供するために基本的なシナプスのモデルとして機能することができます。 一般に、運動単位は、筋肉のNMJsとプロパティでのシナプスのコミュニケーションのタイプを介して動物の行動の側面を規制する。カニやザリガニに近い筋肉（ルーカス、1907、1917）で"速い"と"遅い"筋肉の収縮の最初の観測以来、同様の筋肉の収縮分化はこのような腹部の屈筋（ケネディ＆武田、1965aなど、他のザリガニの筋肉の種類に記載されている、b）と四肢伸（ヴァンHarreveld＆Wiersma、1936）。 "高速"収縮は迅速に対応を開始。例えば、ザリガニの尾のフリップは、高速動作です。 "スロー"の収縮はゆっくりとした動きを維持し、（Bradacs ら 、1997）姿勢を維持するのに役立ちます。 "速い"と"遅い"筋肉の収縮に対応する、"ハイ/相の出力"と"トニック/低出力は、"広義の運動ニューロンを記述するために使用されます。筋収縮の速度とタイミングの違いは、シナプスの構造とシナプス強度のシナプスの違い（キングら 、1996）に部分的に関係する。筋原線維タンパク質アイソフォームの発現は、端末のシェアので、収縮の違いで、しかし、特定の繊維が運動ニューロンの両方のタイプによって支配され、フォーカスが端末のシナプスの違いになっている足の伸筋、のような準備にも重要です。同じ標的細胞（Mykles ら 、2002）。以前の研究では、足の伸筋の二つ興奮モーターの軸索を検討し、相動性および持続性の表現型を（Bradacs ら 、1997）に記載。このレポートでは、我々は、解剖を行い、他の人が、さらにこれらの神経末端のシナプス分化の性質を調べることができるように記録を取得する方法を示します。 透過型電子顕微鏡で見ると、ザリガニの足の伸筋の強壮剤と相動端末から得られたセクションの様々なシリーズは、強壮剤の端末が一過性の端末よりも多くのRRPの小胞を含んでいることが明らかになった。ミトコンドリアはトニックニューロンのより一般的であり、そして相性の端末でシナプスがありますより低出力のシナプス上にあるものよりも複雑な、彼らは様々な間隔で複数のアクティブなゾーンを含んでいるので（Miller ら 、2002;ジョンストンら 、2008;。。キングら 、1996; Bradacs ら 、1997。）。低出力のトニック端子も一過性の端子（Cooper ら 、2003）よりも神経修飾物質のセロトニン（5 - HT）とシナプス伝達を強化を受けやすくなります。 トニックと相性NMJが同じ筋線維上に存在するという事実はそれが容易に特定の筋線維での前シナプスの違いを評価し、筋肉疲労、シナプス抑制とシナプスクロストークの問題に対処することができます。様々な質問には、強壮剤や相動端末の後シナプスにおけるターゲットのシナプス後受容体の密度とグルタミン酸受容体サブタイプの違いがあるかどうかのように、この準備のために対処されずに残っているが、これらの解剖学と生理学の基本的な相違の理解を深める2つのモータユニットは、より深遠な知識ベースを構築する際に役立ちます。希望は、このシナプスの準備で学んだ基本的な原理は、種々の製剤に他のシナプスにも適用になるとザリガニのこのシナプスモデルで将来の調査を強化することです。 2）方法<ol><li>すべての実験は中規模ザリガニ（ ザリガニ ）の第一または第二歩行の脚で実施されています。動物は個別にoxygenized水とプラスチック容器に収容されています。動物室の温度が13 ° C - 16℃の範囲である動物は週単位で変更乾いた魚の餌と水が供給されています。 <img src="/files/ftp_upload/2319/2319fig1.jpg" alt="図1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図1"> 図1：ザリガニ歩いて足と6つの遠位のセグメントの回路図。 </li><li>ザリガニの歩く脚の遠位面は解剖学的に6つのセグメント（図1）に分かれています。足の伸筋は長節に位置しており、分離されて神経の束は、長節坐骨関節に近接しています。強壮剤や相動性軸索が選択的にnと刺激することができるそれらが露出された後に生理的な目的のためにeeded。 </li><li>クーパーとクーパー（2009年）長節領域内オープナー運動ニューロンの刺激神経を露出させるための方法を含む、初期の解剖のいくつかの側面を説明するが、それがあったとして、その説明は、損傷から伸筋を保護するために必要なケアを提供していませんオープナーの筋肉の準備に対処する必要はありません。伸筋を保護するために、第一または第二歩行の脚部は力強くつまんで手足をautomizeするために動物を誘導することによって、ボディの長さが6〜10センチメートル（アチャファラ生物サプライ（株）、レースランド、LA）を測定し、ザリガニから削除されます坐骨セグメントにおける破断面に遠位。脚部は、視聴者が直面している側面（外側）と解剖の板の上に置かれる。視聴者が外の（側面）（図2）通常アーチ型の側で、解剖のプレート上に上を向いていることを確認できるようになるまで、足を前後になっています。ティッシュの紙の上に足を置くと、これらの削減を行っている間、それは簡単に準備を変身させることができます。 <img src="/files/ftp_upload/2319/2319fig2.jpg" alt="図2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図2"> 図2：通常長節の側面、アーチしている側は、解剖のプレート上に直面している。 </li><li>手術用メスの刃ブレーカとホルダーと、鋭いカミソリの刃は、ちょうど長節セグメントについては、図3に示すように、パターンの貫通切削までエッチングキューティクルするために使用されます。ケアは、長節、腕節の共同により、腹側のカットに背をはるかに遠すぎて切らないように取られます。 <img src="/files/ftp_upload/2319/2319fig3.jpg" alt="図3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図3"> 図3：キューティクルの窓から外をエッチングするための推奨パターンとして線で長節セグメント。 製剤は、生理食塩水に配置されます。解剖皿には、底部にSylgard（ダウコーニング）コーティング（厚さ1cm）を持つ必要があります。Sylgardが虫ピンがまだ準備を保持するためにそれにスタックできるように使用されます。この時点で、ピンは腕節セグメントの真ん中にと坐骨セグメント（図4）の背側面でスタックしています。解剖の準備は、標準的なザリガニ生理食塩水に浸し205 NaClで行われるヴァンHarreveld sソリューション（1936年）、から変更されています。5.3KCl、13.5のCaCl 2、2H 2 O、2.45のMgCl 2、6H 2 O、5 HEPESとするように調整pHは7.4（mMで）。 <img src="/files/ftp_upload/2319/2319fig4.jpg" alt="図4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図4"> 図4：リフトオフされているカットウィンドウで長節セグメント。解剖のピンの位置に注意してください。 </li><li>キューティクルを穏やかに遠位領域で解除され、筋線維は脚部の底に向かってストロークすることにより、キューティクルから離れてカットされます。キューティクルをリフトオフすることができます。 </li><li>内突起（腱）は長節-腕節ジョイントで切断されています。ピンはカットが行われるか（図5）場所を示すために屈筋腱の内面に配置されます。それはピンセットで切断された場所腱は、挟まれており、屈筋は、主脚の神経と伸筋を露出、尾側方向（図6）でそれを持ち上げることによってオフにプルアップ。 <img src="/files/ftp_upload/2319/2319fig5.jpg" alt="図5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図5"> 図5：屈筋の内突起はピンと屈筋から、それを置換することによって強調表示されている。 <img src="/files/ftp_upload/2319/2319fig6.jpg" alt="図6" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図6"> 図6：主脚神経を損傷しないように屈筋の内突起をカットし、慎重に削除されます。 </li><li>主脚の神経は、長節、腕節のジョイントで切断し、注意深く伸筋を介して引き戻される。筋肉の内側表面は、本研究で使用されています。主脚の神経から伸筋への神経の分離を穏やかに準備の側に主脚の神経の遠位断端を引っ張ることによって拡張することができます。伸筋を振り返って主脚の神経を剥離するときに、軸索の小枝をカットする必要があるかもしれません。これらは、抑制性運動ニューロンから伸筋への枝です。長節の近位端の近くに主脚の神経から分岐大きいバンドルには、関心の小さな神経の束である。 <img src="/files/ftp_upload/2319/2319fig7.jpg" alt="図7" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図7"> 図7：主脚神経を切断し、近位方向に引き戻される。 この神経束は、メチレンブルー染色（図8）でまたはで見ることができる4 - ジ- 2 - ASP蛍光染色（図9）。 <img src="/files/ftp_upload/2319/2319fig8.jpg" alt="図8" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図8"> 図8：メチレンブルーで染色した伸筋。軸索分岐と神経内の2つの容易に目に見える軸索に注意してください。赤い矢印demark神経トラック。 <img src="/files/ftp_upload/2319/2319fig9.jpg" alt="図9" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図9"> 図9：4 -ジ- 2 - ASPで染色した運動神経の軸索。強壮剤の軸索が原因で増加したミトコンドリアのコンテンツに、より明るく表示されます。 <img src="/files/ftp_upload/2319/2319fig10a.jpg" alt="図10A" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図10A"> 図10A：4 -ジ- 2 - ASPで染色相動性および持続性ニューロンの個々の端末。トニック端末と相動端末の薄い性質上varicositiesに注意してください。 <img src="/files/ftp_upload/2319/2319fig10b.jpg" alt="図10B" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図10B"> 図10B -トニックは指摘する <img src="/files/ftp_upload/2319/2319fig10c.jpg" alt="図10C" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図10C"> 図10C -相の指摘した</li></ol> 3）生理的プロファイル<ol><li>筋肉の細胞内電位を監視している間、強壮剤や相動性ニューロンの興奮性シナプス後電位（EPSPの）観察するには、神経線維束の分離された軸索の一つは、（ジョンストングラスの刺激装置に接続された吸引電極（図11）によって刺激されら 、2008）。 70 Hzの刺激は、低出力NMJsのための容易に反応を促進するために、トニックの軸索に適用される、または、単一のパルス（1Hz）で高出力の大きなEPSPのを得るために一過性軸索に適用されている図のようにNMJs図12インチEPSPのはPowerLab/4sインタフェースを介してコンピュータに記録されます。 <img src="/files/ftp_upload/2319/2319fig11.jpg" alt="図11" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図11"> 図11：神経束内の単一の軸索上に配置刺激電極。 2つの主な軸索の輪郭を描く緑のラインに注意してください。 <img src="/files/ftp_upload/2319/2319fig12.jpg" alt="図12" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図12"> 図12：細胞内記録で得られたとして、強壮剤や相動性ニューロンのシナプス後電位（EPSPS）。 </li><li>シナプスの円滑化及びシナプス抑制の性質の調査は低いと高出力のNMJsで様々な実験パラダイムによって取り組むことができます。約20の刺激（図13）、20、40および60 Hzのパルスに対して示すように低出力のNMJsの促進は、周波数に依存します。 <img src="/files/ftp_upload/2319/2319fig13.jpg" alt="図13" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図13"> 図13：通常のザリガニの生理食塩水で3つの異なった周波数20、40、60 Hzで与えられた刺激パルスのパルス列に対する応答のEPSPの。 </li><li>刺激の周波数のシナプス抑制の率も高出力のNMJsに関連しています。図14は、30分以上NMJを押す刺激の連続的な5 Hzとを示しています。より高い刺激周波数で、準備は（Bradacs ら 、1997）より急速に抑制される見込み。 <img src="/files/ftp_upload/2319/2319fig14.jpg" alt="図14" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図14"> 図14：うつ病を誘発することが5Hzの刺激の間に相性反応のEPSPの振幅。 </li></ol> 4）量子応答<ol><li>ザリガニのオープナーの筋肉（クーパーとクーパー、2009）記載のものと同様の手順では、この準備のために使用されています。直接神経終末の識別可能な地域にわたって量子EPSPのは重要な染料4 -ジ- 2 - ASP（5μM、5分の治療、Cooper らによって可視化シナプスvaricositiesにマクロパッチの記録電極の内腔を配置することによって記録されます。 ら 、1995;。Magrassi ら 、1987）。。自然だけでなく、誘発量子応答は神経終末に沿って記録することができます。誘発し、自発的なシナプス電位がマクロパッチ電極（Dudel、1981; Wojtowicz ら 、1991;。Mallart、1993）で記録されます。 Kimaxガラス（外径：1.5 mm）を引っ張り、10〜20μmの（図15）に至るまでの内径とパッチのヒントを生成するためにファイアーポリッシュされた。 <img src="/files/ftp_upload/2319/2319fig15.jpg" alt="図15" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図15"> 図15：マクロパッチの記録電極の内腔。 電極の内腔は、入浴媒体で満たされている。アンプは、上記の細胞内記録用に使用されるものと同じです。電極とシール抵抗は、電極を介してテスト電流パルスを渡すことによって決定することができます。我々の実験では、シール抵抗は0.3から1.0 Mohmをすることであったと電極の抵抗は0.5〜1.0 Mohmをすることであった。シール抵抗は録音を通してモニターすることができます。 </li><li>量子イベントの直接計数は、低刺激の周波数で可能です。それぞれの誘発反応のために、量子イベントの数は、容易に低出力端子（図16）に決定することができます。これらの直接のカウントは、平均量子コンテンツ（。。Cooper ら 、1995デルカスティー＆カッツ、1954）を推定することができます。誘発高出力NMJsはマルチ量子誘発イベント、自発的なイベントの平均ピーク振幅または面積とともにたわみの平均振幅または面積を、生成するので、適切に使用することができます。平均量子コンテンツ（Cooper ら 、1995）ximate。 <img src="/files/ftp_upload/2319/2319fig16.jpg" alt="図16" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図16"> 相動性および持続性NMJから記録された焦点距離のトレース図16。 <img src="/files/ftp_upload/2319/2319fig17.jpg" alt="図17" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図17"> 図17 </li></ol>

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L. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+anatomical,+physiological+and+biochemical+characterization+of+muscles+associated+with+the+articulating+membrane+in+the+dorsal+surface+of+the+crayfish+abdomen.">The anatomical, physiological and biochemical characterization of muscles associated with the articulating membrane in the dorsal surface of the crayfish abdomen.</a> J. Exp. Zool. 287, 353-377 (2004).</li><li>Tsien, R. W., Harata, N. C., Choi, S. W. P. y. l. e., Aravanis, A. M., AM, G. C. h. e. n. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vesicles,+quanta+and+synaptic+plasticity.+Molecular+Mechanisms+of+synaptic+function.">Vesicles, quanta and synaptic plasticity. 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G., Van Harreveld, A. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+the+frequency+of+stimulation+on+the+slow+and+fast+contraction+in+crustacean+muscle.">The influence of the frequency of stimulation on the slow and fast contraction in crustacean muscle.</a> Physiol. Zool. 11, 75-81 (1938).</li><li>Wojtowicz, J. M., Smith, B. R., Atwood, H. L. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-dependent+recruitment+of+silent+synapses.">Activity-dependent recruitment of silent synapses.</a> Ann. N.Y. Acad. Sci. 627, 169-179 (1991).</li></ol>

利害の衝突は宣言されません。

我々は分析する方法、記録し、両方の高と低出力端末が同一の筋線維を支配するユニークなザリガニ神経筋の準備にシナプス応答を定量化するこのレポートに示されている。ザリガニの神経筋の製剤は、わずか数興奮性運動ニューロンは筋肉を支配するために必要ですので、脊椎動物の神経筋接合部に比べて多くの利点を提供し、神経細胞が準備から準備（アトウッド、1976）に識別可能であるため。さらに、興奮性神経伝達物質はグルタミン酸であり、興奮性シナプス後電位（EPSP）が採点され、したがって、段階的なイベントの生物物理学的特性は、脊椎動物の中枢神経系内のニューロンの樹状突起に似ています。量子電流は、しかし、後シナプス部位（Cooper ら 、1995）で直接監視することができます。 相動性神経の反復的な5 Hzの刺激が大きく、数分後にうつ状態になる大きなEPSPのを生じさせる。うつ病のこのタイプは、節足動物相動性神経筋接合部（アトウッドとクーパー、1996）で共通です。相動端子と並んで強壮端末の存在は1つがシナプス後の目標を大幅に相動性運動ニューロンの抑うつの間と後に変更されているかどうかを評価することができます。 （;デサイ- Shahさんとクーパー、2009年。デサイ-シャーら、2008）さらに、低出力端子には、シナプスの円滑化を根底にあるメカニズムを調べるために良い準備を提供する高い出力端子は、シナプス抑制と回復過程の速度で変調を調査するためにプレイグラウンドを提供しています。アクセスおよび実行可能な準備がシナプス抑制の背後にあるメカニズムを解読するのに役立つはずです。このザリガニの足の伸筋の準備では、セロトニンの外因性のアプリケーションは、シナプス抑制とシナプス小胞プールの動員に調査を推進する潜在的な手段の回復を調べるために別のツールです。個々の筋線維が一過性と持続性の両方の運動ニューロンによって支配されているので、この準備には、いくつかの実験的な利点を提供します。 セロトニンは、誘発刺激で放出される小胞の数が増加し、それが不況時の回復を促進するので、それはセロトニンの存在（ジョンストンらとの融合の確率を高めるための小胞プールのいくつかの変調があることが明らかであるので。、2008年;ログスドンら、2006;らスパークス、2004）。。としてうつ状態とは対照的に、低頻度刺激時のシナプス前神経終末内の小胞プールのダイナミクスを説明するというモデルは、、また、この準備では不可能な様々な実験的なプロトコルの中で考慮する必要があります。 。ツィンら 、それはリサイクル小胞の残りの部分は小胞体（原田ら、2001年までの伝統的な低速のリサイクルパスを通過するのに対し、小胞プールの約30％が、急速なリサイクルを受けることを他のシステムで注目されている。 、2001）。このようなデュアルパスもこのシステムに存在することができる。 ATPはその後、シナプス前終末のうつ状態に欠けているドッキングとドッキング解除された場合に発生することができない場合があります、したがって、多くの無負荷時の小胞がシナプス表面に残っているでしょう。端子が5 HTにさらされているときに多くの小胞が急速に放出されるので、それはよりは容易に放出できるプール（RRV）に含まれていること可能です。しかし、うつ状態で、減少ATPで、ドッキングおよびドッキング解除は、さらに再びシナプス表面で無負荷時の小胞を離れる5 HT、の存在下でブロックされることがあります。予備的データは、より多くの小胞が長引く5 HTの曝露と刺激と時間をかけてリリースされることを示唆しているので、高速および低速リサイクルパスから小胞プールの分布は、再リリース（ジョンストンらのために有能な小胞を持つように偏りが発生する場合があります。 、2008;。レビュー-デサイ- Shahさんら、2008を参照してください。デサイ- Shahさんとクーパー、2009） シナプス後電流と運動神経終末の定義の領域から単一量子の対策の焦点macropatchの録音のテクニックを使うと、1つはシナプス抑制が解放される少数の小胞のため、または機能の変化の結果として発生しているかどうかを判断するために質問をすることができますシナプス後受容体。それは小胞がより高いために可能性が高いアカウントは相動端子（Msghina らの量子コンテンツを意味等しいカルシウムの暴露（Miller ら、2005）、のためのこの準備の相動NMJでの融合に敏感であることが示されている。 、1998、1999）。さらに、カルシウム結合タンパク質のfrequenin（Jeromin ら、1999）と超微細構造（キングら、1996）の違いは、差動シナプス伝達効率（クーパーに貢献するら、2003）。 （; Cooper ら、2003。。Bradacsら、1997）、いくつかの先行研究では、伸筋線維の筋の表現型を調べてきました。混合繊維の種類のザリガニの純粋トニックと相性のファイバタイプの筋分化の調節を比較すると、、鈍い支配され、脚伸展のためにしたいと筋肉の表現型の発現と調節（ラフランバスら、2000年に手がかりを提供することができます。。孫らら、2000;。グリフィスら、2001;。Myklesら、2002）。。 多くの基本的な質問は神経生物学で対処されずに残っている、と本製剤は、それらのいくつかに取り組む際に助けることができる。足の伸筋に近づく可能性がある分野への関心、今日のいくつかのトピックが含まれます：1）高出力の端子の中でシナプス抑制の基礎となる細胞メカニズムの決定（Ca2 +のエントリの減少に起因するうつ病です、有能の欠如量子の形かどうかの判断容易に放出できる小胞（RRV）プール、および/または変更されたシナプス後受容性？）2）迅速な復旧、および3を促進するためのシナプス抑制の誘導後に適用するときに5 - HTの機構的役割の決定）刺激的な一過性の端子から発生する電流は、シナプス抑制のプレとポストシナプスのコンポーネントを対象にうつ病の誘導中に変更されています。 それは、私たちはリリースのサイトで直接測定されるシナプスのパフォーマンスのアンダーラインのメカニズムに対処する適切な情報を得ることができるため、このNMJは、継続的な研究と将来の研究者にとって重要です。この分野での現在の研究では5 - HTおよび小胞プールのダイナミクスによってシナプス抑制の変調についての情報を提供している。すべての神経システムに関連するシナプス伝達の基本的な基礎に関連するような話題。

<ol><li>ザリガニ（ ザリガニ ）。アチャファラヤ生物サプライ（株）、レースランド、LA。、米国。 </li><li>標準的なザリガニ生理食塩水： <ul><li>ヴァンHarreveldのソリューション（1936）から変更。 （mMで）205のNaCl、5.3 KClを、13.5のCaCl 2 2H 2 O、2.45のMgCl 2 · 6H 2 O、5 HEPES、pHを7.4に調整</li></ul></li><li>解剖ツール：ファイン＃5ピンセット、細かいはさみ、ナイフの刃ホルダー、＃26002から20虫ピン（すべてのファイン科学のツール（米国）、（株）、373 - Gビンテージパークドライブ、フォスターシティー、CA 94404から1139から取得） </li><li> Sylgardコーティング解剖皿、録音の料理は、どちら吸引電極で構成または吸引電極を保持する吸引電極と葯のマニピュレータを使用してください。 </li><li>細胞内記録用のズーム機能で顕微鏡を解剖。可視化端末上で焦点距離の記録のために直立の目標（4 ×と20倍）を持つ化合物の顕微鏡が使用されます。一つは、水銀光源を必要とします。 </li><li>コンピュータへのライン録音での標準的な細胞内のアンプとA / Dボード。電気信号は、PowerLab/4sインタフェース（ADInstruments、オーストラリア）への行に記録されます。我々は、チャートまたはScopeというADInstrumentsから標準のソフトウェアを使用してください。 </li><li>化学物質： <ul><li> 。varicosities（Marigassiら 、1987を視覚化するために、、我々は、極めて重要な蛍光色素、4 [4（ジエチルアミノ）スチリル] Nメチルピリジニウムヨウ化物（Molecular Probes社、オレゴン州ユージーン4 ASPディ2）;使用Cooper ら 、1995aを。 ）。すべての生理食塩水の化学物質は、シグマケミカル社（セントルイス、MO）から得た。 </li></ul></li><li>細胞内記録のために我々はガラスキャピラリチューブ（FHC、ブランズウィック、ME、04011、アメリカ合衆国カタログ＃30-31-0）、焦点macropatch電極のために私達がKimax - 51を使用して、キンブル製品アートを使用してください。 100ミリメートル番号34502、ID 0.8〜1.1ミリメートル、長さ。細胞内電極は、20〜30オームの抵抗を持つ必要があります。 macropatch電極は、微細な先端が電極の引き手から作られた後のガラスの先端を切り離すことにより構築されます。壊れたオフの先端の直径は20μM程度きれいな垂直のブレークにする必要があります。ヒントは、約10μM内径に研磨熱である。電極のシャフトは、それが徐々に曲げて約45度に曲げるために発生する発熱体を介して実行されます。これは準備にさらに45度程度が生成されますマイクロマニピュレータを持つ角度などの神経終末上の平らなまたは垂直電極の内腔を生成します。 </li></ol>

ザリガニの脚の伸筋に高と低出力nmjsの生理的録音

Physiological Recordings of High and Low Output NMJs on the Crayfish Leg Extensor Muscle

我々は高い（一過性）、低（トニック）出力の運動ニューロンは、ザリガニの歩行足に伸筋を支配するためのシナプス応答の電気生理学的記録を公開し、実施するのかを詳細に説明。明確な違いは、一過性および持続性神経終末の生理学と形態で存在している。強壮剤の軸索は、それがもっと激しく相動軸索より生体染色法を利用できるように、より多くのミトコンドリアの多くが含まれています。トニック端末はvaricositiesを持っている、と相性の端末は糸状です。トニック端末はシナプス伝達効率が低いですが、劇的な促進反応を示しています。対照的に、相動端末は量子効果の高いが、高頻度刺激でシナプス抑制を示す。量子出力は、可視化の神経終末の上に直接配置された焦点macropatchの電極で測定されます。相動性および強壮剤の両方の端子には、形態学的および生理的分化のためのその神経細胞の本質的な違いではなく、筋肉からの差動逆行性フィードバック、アカウントを示唆している同一の筋線維を、刺激する。

この記事では、ザリガニの歩行足に伸筋のシナプス応答の電気生理学的記録を行い、どのように神経終末が高と低出力の神経終末の総形態的な違いを示すために可視化する方法を示します。

ザリガニの脚の伸筋に高と低出力NMJsの生理的録音

高出力（相性）および低出力（持続性）の運動ニューロンにおけるシナプス応答の電気生理学的記録を行うための、神経の露出および記録の手順について詳細に解説します。

本手順の目的は、ザリガニの伸筋において、形態学的染色および電気生理学的記録を用いて、分相性（phasic）および持続性（tonic）の運動終末を露出し、区別する方法を実演することである。まず、中型のザリガニから第1または第2歩脚を切り離し、中節（meite segment）のクチクラを切開して屈筋を除去することで、これを達成する。これにより、伸筋と神経束が露出する。手順の第2段階では、軸索と神経終末を可視化するために、4-エチルアミノアクリジンおよびメチルプロピジウムヨード（4-D2ASP）で標本を染色します。手順の第3段階では、強直性および／または相性のニューロンを選択的に刺激し、同時に筋線維における誘発EPSPの細胞内記録を行います。手順の最終段階では、局所電極を用いて終末からの自発的および誘発的なquイベントを記録します。最終的に、免疫蛍光顕微鏡法および電気生理学的手法を用いて、形態学的および生理学的にトニック末端とフェイジック末端を区別した結果を得ることができます。この手法は、筋疲労、シナプス抑制、シナプス間のクロストークといった分野におけるシナプス生理学の重要な疑問を解決するのに役立ちます。実験は、ザリガニのハサミを避けて慎重に捕獲することから始まります。イシアポッド（isia pod）節で脚を体から切り離します。イシアポッド節を強くつまむことで、ザリガニに第1歩脚を自切、あるいは自然に脱落させることができます。止血を確認した後、ザリガニを飼育タンクに戻します。ザリガニは殺処分しません。切開時に準備物を簡単に回転させられるよう、脚をティッシュペーパーの上に置きます。解剖皿の上で、外側である外側が上を向くまで脚を回転させます。通常、弓状の側を上に向けます。メス刃ブレーカーに取り付けた鋭いカミソリ刃を使用し、図に示すパターンに従ってmeite節内のキューティクルをエッチングします。meite carpod関節に沿った背側から腹側への切開時に、遠位側へ切りすぎないよう注意してください。この切開により、下層の脚筋の上にある外骨格に窓が開きます。クチクラは今のところそのままにしておきます。準備した試料を、ザリガニ生理食塩水が入った解剖皿に入れます。この時点で、細いピンセットを用いて、carpodセグメントの中央とischia podセグメントの背側にピンを留めます。クチクラに切り出した窓を遠位端からわずかに持ち上げ、カミソリを使用して屈筋繊維をクチクラから切り離します。遠位から近位に向かって切断を続け、最後にクチクラの窓を取り除きます。伸筋を露出させるには、その上にある屈筋を除去する必要があります。ピンを用いて屈筋から離すことで、屈筋の腱を分離します。次に、手根関節（carpod joint）で腱を切断します。図に示されているように、切断前に腱を脚の空腔から慎重に引き離し、腱の内側にある主脚神経を切断しないよう、腱のみを切断することに細心の注意を払ってください。ピンセットで切断した腱の部分をつまみ、屈筋を上方へ持ち上げるようにして脚から引き離します。伸筋への神経を露出させるには、肢節間関節（merepod carpod joint）で主脚神経を切断し、主脚神経を伸筋の上まで慎重に引き戻します。主脚神経から伸筋への神経の分離を容易にするには、主脚神経の遠位端を標本の側方へそっと引くと効果的です。主脚神経を伸筋の上に引き戻して剥離させる際、抑制性軸索の小さな分枝を切断する必要がある場合があります。神経束はメチレンブルー染色で可視化できます。ただし、この上の画像のような電気生理学的記録において、メチレンブルーは使用されません。赤色の矢印は、目的の神経経路を示しています。目的とする神経束は、基節（merepod）の近位端付近で主脚神経から分枝している太い束です。軸索の分枝と、神経内に容易に確認できる2本の軸索に注目してください。神経と筋肉が露出したので、実験に使用する装置を準備します。細胞内および細胞外記録は、標準的なヘッドステージとアンプを用いて行います。ここでは、Axon Clamp 2Bアンプと1 XLUヘッドステージを使用します。電極は、細胞内用1本と細胞外用2本の計3本が必要です。2本の細胞外電極を用いて、神経の刺激およびシナプス誘発・自発的なイベントの記録を行います。局所電極をファイアポリッシュし、加熱元素上でわずかに曲げます。局所電極に生理食塩水を充填した後、それを刺激電極ホルダーにセットし、刺激電極線が生理食塩水に接触するように挿入します。これはgrass P 15刺激分離ユニットに接続されており、さらにS 88 grass刺激装置に接続されています。電気生理学的記録中、D 2 ASPバイタルダイを用いて軸索を可視化するために、浴槽内の生理食塩水を5 µMの4 D 2 ASPダイを含む生理食塩水に交換し、5分間染色します。5分後、ディッシュにザリガニ生理食塩水を再充填し、試料を顕微鏡下に配置してForex対物レンズを使用します。10倍の接眼レンズで、刺激電極を目的の領域まで移動させます。次のステップは、マクロパッチ刺激電極のルーメンを、 phasic または tonic axon のいずれかに配置することです。4種類の染料および 2種類の as dye で染色された標本のこの写真では、ミトコンドリア含量が増加しているため、tonic axon がより鮮明に確認できます。蛍光顕微鏡下では、持続的（tonic）終末には多数の静脈瘤状の膨大部が見られ、相性（phasic）終末はより細い形態をしています。20倍の対物レンズを用いて、電極を持続的または相性のいずれかの軸索上に配置します。ここでは、電極を持続的軸索上に配置しています。細胞内電極をマイクロマニピュレーターに装着し、細胞内電極を伸筋細胞に挿入します。これにより、細胞内興奮性突起後電位（EPSP）を記録します。qual EPSPを記録する場合に使用します。2本目の焦点電極をマイクロマニピュレーターに取り付けます。これは、以前に使用した細胞内電極とホルダーを取り外し、清潔な電極ホルダーと交換することで行います。マイクロマニピュレーターを使用して、2本目の焦点電極のルーメンをシナプス膨大部（varicosity）の直上に配置します。電極抵抗およびシール抵抗は、電極にテスト電流パルスを流すことで測定します。本実験において、シール抵抗は0.3～1 MΩの範囲であり、電極抵抗は0.5～1 MΩの範囲でした。シール抵抗は記録の間、継続的にモニターすることが可能です。刺激を開始する準備ができたら、scope 5.0 ソフトウェアを起動し、単離した軸索への刺激を開始します。神経束において、緊張性軸索は吸引電極によって刺激され、筋線維の EPSP は細胞内または細胞外電極を用いて記録されます。EPSP は PowerLab インターフェースを介してコンピュータに記録されます。強直性軸索への刺激の後、刺激電極を速記性軸索に移動させ、神経刺激を行い実験を繰り返すことができます。細胞内電極は、強直性および速記性の両方の運動ニューロン活性に応じて生成されるEPSPを記録します。強直性神経筋接合部のシナプス促通は、神経刺激の頻度に依存します。ここでは、60 hertzの頻度でそれぞれ約20回の刺激からなる連続したトレインを用いて、その様子を示しています。複数の刺激によって起こる促進に注目してください。この図は、青色が20 hertz、緑色が40 hertz、赤色が60 hertzの周波数で緊張性神経を刺激した際に生成されるEPSPの振幅を比較したものです。刺激周波数が高くなるにつれて、顕著な促進が見られることに留意してください。緊張性終末はシナプス効率が低いですが、図に示されているように劇的な促進反応を示します。ここでは、まず持続的なEPSPのみを示し、次に同じスケールで相的な反応を重ね合わせて示しています。持続的な終末とは対照的に、相的な終末は量子放出効率が高いものの、高頻度刺激によってシナプス抑制を示します。相的な終末におけるシナプス抑制も、ここに示すように刺激頻度に関連しています。30分間にわたる5 Hzの連続刺激は、神経筋接合部における反応を抑制します。刺激頻度を高めると、適切な刺激によってさらに急速に抑制が起こります。ザリガニの神経筋接合部は、非スパイク性のEPSPを生成します。これらのEPSPを用いて、これらの筋肉における段階的な電気信号を構成する量子的な特性を調査することができます。ここでは、強直性終末の量子的なシナプス応答を示します。すべての刺激試行において量子的なイベントが発生するわけではないことに注意してください。各誘発反応に対して低頻度刺激を行うことで、量子イベントの直接計数が可能です。緊張性末端については、量子イベント数を容易に決定できます。量子イベントを計数することにより、相性運動ニューロンからのシナプス応答を同様の方法で記録することが可能です。しかしながら、誘発反応は本質的にマルチクォール（multi qual）です。平均クォール含有量は、自発的イベントの平均ピーク振幅または面積とともに、偏向の平均振幅または面積を用いて推定されます。最後に、伸筋を露出させる際に神経を損傷しないよう、屈筋の除去には十分注意してください。以上です。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りしております。

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筋肉感覚ニューロンは自己受容体シグナル伝達に関与し、また代謝状態やけが関連するイベントについて報告している。私たちは、ストレッチ活性化筋求心性神経の研究のためのin vitroでの筋肉の神経に備えて成体マウスについて説明します。...

アン体外成体マウス筋肉神経の準備

神経筋接合部 (NMJ) の機能評価は、筋肉と神経の間の通信に不可欠な情報を提供できます。ここで使用して 2 つの異なる筋神経剤、すなわちヒラメ坐骨とダイヤフラム隔 NMJ...

神経筋接合部機能を測定

提示された、ラットの異なるタイプの中央値神経(MN)病変および修復を産生するプロトコルである。さらに、プロトコルは、いくつかの非侵襲的な行動検査および生理学的測定を用いて神経の機能的回復を評価する方法を示す。...

ラットの神経再生の中央値を評価する機能と生理学的方法

学ぶザリガニ脚の伸筋における高・低出力神経筋接合部の電生理学的記録法。形態染色と細胞内記録で位相性・緊張性終末を区別し、シナプス生理の基礎を解明します。

ザリガニの脚の伸筋に高と低出力NMJsの生理的録音

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