ザリガニの脚の伸筋に高と低出力NMJsの生理的録音

本手順の目的は、ザリガニの伸筋において、形態学的染色および電気生理学的記録を用いて、分相性（phasic）および持続性（tonic）の運動終末を露出し、区別する方法を実演することである。まず、中型のザリガニから第1または第2歩脚を切り離し、中節（meite segment）のクチクラを切開して屈筋を除去することで、これを達成する。これにより、伸筋と神経束が露出する。

手順の第2段階では、軸索と神経終末を可視化するために、4-エチルアミノアクリジンおよびメチルプロピジウムヨード（4-D2ASP）で標本を染色します。手順の第3段階では、強直性および／または相性のニューロンを選択的に刺激し、同時に筋線維における誘発EPSPの細胞内記録を行います。手順の最終段階では、局所電極を用いて終末からの自発的および誘発的なquイベントを記録します。

最終的に、免疫蛍光顕微鏡法および電気生理学的手法を用いて、形態学的および生理学的にトニック末端とフェイジック末端を区別した結果を得ることができます。この手法は、筋疲労、シナプス抑制、シナプス間のクロストークといった分野におけるシナプス生理学の重要な疑問を解決するのに役立ちます。実験は、ザリガニのハサミを避けて慎重に捕獲することから始まります。

イシアポッド（isia pod）節で脚を体から切り離します。イシアポッド節を強くつまむことで、ザリガニに第1歩脚を自切、あるいは自然に脱落させることができます。止血を確認した後、ザリガニを飼育タンクに戻します。

ザリガニは殺処分しません。切開時に準備物を簡単に回転させられるよう、脚をティッシュペーパーの上に置きます。解剖皿の上で、外側である外側が上を向くまで脚を回転させます。

通常、弓状の側を上に向けます。メス刃ブレーカーに取り付けた鋭いカミソリ刃を使用し、図に示すパターンに従ってmeite節内のキューティクルをエッチングします。meite carpod関節に沿った背側から腹側への切開時に、遠位側へ切りすぎないよう注意してください。

この切開により、下層の脚筋の上にある外骨格に窓が開きます。クチクラは今のところそのままにしておきます。準備した試料を、ザリガニ生理食塩水が入った解剖皿に入れます。

この時点で、細いピンセットを用いて、carpodセグメントの中央とischia podセグメントの背側にピンを留めます。クチクラに切り出した窓を遠位端からわずかに持ち上げ、カミソリを使用して屈筋繊維をクチクラから切り離します。遠位から近位に向かって切断を続け、最後にクチクラの窓を取り除きます。伸筋を露出させるには、その上にある屈筋を除去する必要があります。

ピンを用いて屈筋から離すことで、屈筋の腱を分離します。次に、手根関節（carpod joint）で腱を切断します。図に示されているように、切断前に腱を脚の空腔から慎重に引き離し、腱の内側にある主脚神経を切断しないよう、腱のみを切断することに細心の注意を払ってください。

ピンセットで切断した腱の部分をつまみ、屈筋を上方へ持ち上げるようにして脚から引き離します。伸筋への神経を露出させるには、肢節間関節（merepod carpod joint）で主脚神経を切断し、主脚神経を伸筋の上まで慎重に引き戻します。主脚神経から伸筋への神経の分離を容易にするには、主脚神経の遠位端を標本の側方へそっと引くと効果的です。主脚神経を伸筋の上に引き戻して剥離させる際、抑制性軸索の小さな分枝を切断する必要がある場合があります。

神経束はメチレンブルー染色で可視化できます。ただし、この上の画像のような電気生理学的記録において、メチレンブルーは使用されません。赤色の矢印は、目的の神経経路を示しています。

目的とする神経束は、基節（merepod）の近位端付近で主脚神経から分枝している太い束です。軸索の分枝と、神経内に容易に確認できる2本の軸索に注目してください。神経と筋肉が露出したので、実験に使用する装置を準備します。

細胞内および細胞外記録は、標準的なヘッドステージとアンプを用いて行います。ここでは、Axon Clamp 2Bアンプと1 XLUヘッドステージを使用します。電極は、細胞内用1本と細胞外用2本の計3本が必要です。

2本の細胞外電極を用いて、神経の刺激およびシナプス誘発・自発的なイベントの記録を行います。局所電極をファイアポリッシュし、加熱元素上でわずかに曲げます。局所電極に生理食塩水を充填した後、それを刺激電極ホルダーにセットし、刺激電極線が生理食塩水に接触するように挿入します。

これはgrass P 15刺激分離ユニットに接続されており、さらにS 88 grass刺激装置に接続されています。電気生理学的記録中、D 2 ASPバイタルダイを用いて軸索を可視化するために、浴槽内の生理食塩水を5 µMの4 D 2 ASPダイを含む生理食塩水に交換し、5分間染色します。5分後、ディッシュにザリガニ生理食塩水を再充填し、試料を顕微鏡下に配置してForex対物レンズを使用します。

10倍の接眼レンズで、刺激電極を目的の領域まで移動させます。次のステップは、マクロパッチ刺激電極のルーメンを、 phasic または tonic axon のいずれかに配置することです。4種類の染料および 2種類の as dye で染色された標本のこの写真では、ミトコンドリア含量が増加しているため、tonic axon がより鮮明に確認できます。

蛍光顕微鏡下では、持続的（tonic）終末には多数の静脈瘤状の膨大部が見られ、相性（phasic）終末はより細い形態をしています。20倍の対物レンズを用いて、電極を持続的または相性のいずれかの軸索上に配置します。ここでは、電極を持続的軸索上に配置しています。

細胞内電極をマイクロマニピュレーターに装着し、細胞内電極を伸筋細胞に挿入します。これにより、細胞内興奮性突起後電位（EPSP）を記録します。qual EPSPを記録する場合に使用します。

2本目の焦点電極をマイクロマニピュレーターに取り付けます。これは、以前に使用した細胞内電極とホルダーを取り外し、清潔な電極ホルダーと交換することで行います。マイクロマニピュレーターを使用して、2本目の焦点電極のルーメンをシナプス膨大部（varicosity）の直上に配置します。

電極抵抗およびシール抵抗は、電極にテスト電流パルスを流すことで測定します。本実験において、シール抵抗は0.3～1 MΩの範囲であり、電極抵抗は0.5～1 MΩの範囲でした。シール抵抗は記録の間、継続的にモニターすることが可能です。

刺激を開始する準備ができたら、scope 5.0 ソフトウェアを起動し、単離した軸索への刺激を開始します。神経束において、緊張性軸索は吸引電極によって刺激され、筋線維の EPSP は細胞内または細胞外電極を用いて記録されます。EPSP は PowerLab インターフェースを介してコンピュータに記録されます。

強直性軸索への刺激の後、刺激電極を速記性軸索に移動させ、神経刺激を行い実験を繰り返すことができます。細胞内電極は、強直性および速記性の両方の運動ニューロン活性に応じて生成されるEPSPを記録します。強直性神経筋接合部のシナプス促通は、神経刺激の頻度に依存します。ここでは、60 hertzの頻度でそれぞれ約20回の刺激からなる連続したトレインを用いて、その様子を示しています。

複数の刺激によって起こる促進に注目してください。この図は、青色が20 hertz、緑色が40 hertz、赤色が60 hertzの周波数で緊張性神経を刺激した際に生成されるEPSPの振幅を比較したものです。刺激周波数が高くなるにつれて、顕著な促進が見られることに留意してください。緊張性終末はシナプス効率が低いですが、図に示されているように劇的な促進反応を示します。

ここでは、まず持続的なEPSPのみを示し、次に同じスケールで相的な反応を重ね合わせて示しています。持続的な終末とは対照的に、相的な終末は量子放出効率が高いものの、高頻度刺激によってシナプス抑制を示します。相的な終末におけるシナプス抑制も、ここに示すように刺激頻度に関連しています。

30分間にわたる5 Hzの連続刺激は、神経筋接合部における反応を抑制します。刺激頻度を高めると、適切な刺激によってさらに急速に抑制が起こります。ザリガニの神経筋接合部は、非スパイク性のEPSPを生成します。

これらのEPSPを用いて、これらの筋肉における段階的な電気信号を構成する量子的な特性を調査することができます。ここでは、強直性終末の量子的なシナプス応答を示します。すべての刺激試行において量子的なイベントが発生するわけではないことに注意してください。

各誘発反応に対して低頻度刺激を行うことで、量子イベントの直接計数が可能です。緊張性末端については、量子イベント数を容易に決定できます。量子イベントを計数することにより、相性運動ニューロンからのシナプス応答を同様の方法で記録することが可能です。

しかしながら、誘発反応は本質的にマルチクォール（multi qual）です。平均クォール含有量は、自発的イベントの平均ピーク振幅または面積とともに、偏向の平均振幅または面積を用いて推定されます。最後に、伸筋を露出させる際に神経を損傷しないよう、屈筋の除去には十分注意してください。

以上です。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りしております。