膜電位、シナプス応答、神経回路、ニューロモデュレーションとザリガニを使用して筋肉の組織学：学生研究室の演習

以下の実験の全体的な目標は、興奮性膜の特性と静止膜電位のイオン基盤を理解し、膜電位を測定する方法を学ぶとともに、シナプス伝達の特性を実証することです。実験の一部では、細胞外カリウムを変化させながら、静止膜電位を測定します。実験の別の部分では、シナプス分化のメカニズムは、さまざまな運動単位で刺激されたシナプス応答を記録することによって調査されます。

次に、メンテナンスが容易な神経回路が提示されます。この準備は、教育だけでなく、感覚からCNS、運動ニューロン、筋肉回路へのさまざまな側面を研究するためにも使用できます。この一連の実験は、ザリガニモデルを使用して、膜電位、シナプスの統合と伝達、および筋線維タイプの構造的違いに関連する問題に対処することの容易さを示しています。

電気生理学的概念と技術を教える際にザリガニ調製物を使用する主な利点は、解剖の容易さ、調製物の最小限の生理食塩水の実行可能性、シナプス応答を得る容易さ、および筋肉の全体的な解剖学的配置を識別する容易さです。これらの技術は、他の調製物にも適用することができ、実証された調製物におけるシナプスの生理学と調節、および生化学的および構造的な違いについての理解を深めるでしょう。手術を開始するには、体長約6〜10センチのザリガニを選択し、砕いた氷に5分間麻酔してザリガニの首を切り落とし、後頭部から持ち、大きなハサミを使用してザリガニの爪と口に指が届かないようにします。

ザリガニの目の後ろからきれいに切り込んで頭をすばやく取り除き、怪我を防ぐためにザリガニの脚と爪を取り除きます。男性のスタイルと、男性と女性の両方のスイマーエットを削除します。頭部と付属物は廃棄してください。

次に、腹部と胸部を結合する関節膜に沿って切り込みを入れて、腹部を胸部から分離します。ザリガニの腹部を保存し、胸部を処分し、はさみを腹側に向かってわずかに下に向け、斜めに、腹部の各側面の下部側縁に沿って殻に切り込みを入れます。ザリガニに深く切り込まないように注意してください。

鉗子を使用して、各セグメントの長さを走るザリガニの線の自然な殻のパターンをたどります。シェルの腹側部分を引き上げて後ろに引っ張って取り外します。腹筋を壊さないように注意してください。

屈筋を切除します。この時点で、深屈筋の上に組織の白い塊が見えます。このティッシュを鉗子で慎重に取り除きます。

消化管は、深屈筋の正中線に沿って走る小さな管として見えるようになりました。上部の鉗子でつまんで腹部から引き離すようにして取り外します。尾の端にある消化管の底を切ります。

解剖液を生理食塩水ですすいで、糞便廃棄物が準備を妨げないようにします。.解剖ピンを使用して、調製物の上部と下部の角をSガードコーティングされたペトリ皿に固定します。腹部伸筋が露出しました。

生理食塩水をペトリ皿に注ぎ、細胞内記録が行われるまで準備を覆います。ペトリ皿を顕微鏡に移し、皿の下にワックスを使用して動かないようにします。細胞内記録に用いる装置をこの図に示します。

適切な接続と設定については、付属のテキストに記載されています。指示に従って、ラボカルテソフトウェアをセットアップします。添付のテキストで、アース線を生理食塩水浴に入れます。

3モルの塩化カリウムを充填したガラスマイクロピペットの先端を生理食塩水浴に入れ、電極抵抗をテストします。電極抵抗は20〜60メガオームである必要があります。の粗いノブを使用します amplifier高強度の照明下でラボチャートの線をゼロに移動します。

顕微鏡を覗いて、縦方向のDEM筋を特定します。電極プローブを使用して、細胞内電極をDEM筋の筋線維に挿入します。電極は筋繊維にかろうじて挿入する必要があります。

セル全体に浸透しないように注意してください。静止電位の振幅を測定します。チャートウィンドウの左下隅にある位置からトレースにMカーソルをドラッグします。

マーカーMをベースラインに置き、録音された信号の最も低い点にカーソルを移動します。マーカーとアクティブなカーソルの差は、画面の右上に表示されます。この値は、静止膜電位の電圧です。

記録された電圧を増幅量で割ると、この場合は10 x増幅が使用されました。次に、電圧をボルトからミリボルトに変換します。その筋線維の静止電位を記録した後、顕微鏡を覗いて、筋線維から電極を慎重に取り外します。

他の筋線維で細胞内記録を繰り返します。この実験の次の部分では、細胞外カリウム濃度の上昇が静止膜に及ぼす影響を監視します。潜在的な 6 つのザリガニ生理食塩水が、カリウム濃度 5.4、20、40、60、80、および 100 ミリモルで使用されます。

記録の合間に次の細胞内記録を行うために、けいれんしていない筋肉を選びます。入浴液を次に高濃度の塩化カリウム溶液と交換します。毎回、準備を完全にカバーするようにしてください。

各溶液の膜電位の変化を記録します。細胞外カリウム濃度を上げる効果は、膜電位がこのスクリーンキャプチャで示されています。この画面キャプチャでは、細胞外カリウム濃度と膜電位の半対数プロット上にカリウムの各濃度の静止膜電位がプロットされています。5.4ミリモルの細胞外カリウムで安静時電位を並べます。

仮想曲線と観測曲線について、観測された線の傾きを架空の線の傾きと比較します。これらの電気生理学的記録を終えたら、次のステップは筋線維の解剖学的構造とその神経支配パターンを調べることです。準備を立っている皿に移し、メチレンブルーを加えます。

5分後、メチレンブルーを取り除き、新鮮なザリガニの生理食塩水を加えます。セグメント内の筋肉を神経支配する主要な神経を探します。セグメント内のS-E-M-D-E-L 2D EL one筋とDEM筋に神経支配パターンをスケッチします。

次に、フュームフードの下に準備を移動します。生理食塩水を取り除き、固定液を追加します。ここで用いる固定剤はポイント溶液です。

ヒュームフードの目的は、固定剤の蒸気を避けることです。この溶液が肌や目に入らないように十分注意してください。目が火傷し始めた場合は、すぐに洗眼ステーションで目を洗ってください。

boin溶液を調製物に約10分間放置し、次にピペットを使用して溶液を生理食塩水と交換します。DEL1またはDEL2の筋肉の細いセグメントを切り取ります。スライドガラスの上に置きます。

スライドにラベルを付けます。SEM筋肉についてもこの手順を繰り返します。化合物顕微鏡を使用して、両方の組織調製物におけるサルコメアバンディングパターンを観察します。

次の一連の実験では、ザリガニ腹筋のシナプス応答を記録する方法を検討します。別のザリガニを選択し、斬首します。手術で示されているように、胸部と付属器を切除し、腹部伸筋を露出させます。

このビデオの最初のセクションでは、顕微鏡を使用して、運動軸索を伸筋に運ぶ神経を見つけます。最もアクセスしやすい神経を持つセグメントを探します。神経は白く、ピペットを使用して生理食塩水を製剤に噴霧するか、製剤に軽く息を吹きかけることで見ることができます。

これにより神経が動き、識別が容易になります。マイクロマニピュレーターによって保持された吸引電極を神経の真上に配置します。シリンジをそっと引っ張って、神経を電極に引き込みます。

神経が電極に吸い込まれていく様子を顕微鏡で見ることができます。ラボカルテソフトウェアの設定を、付属の記事で指定されているように調整します。3モルの塩化カリウムガラスマイクロ電極を充填し、ヘッドステージとパワーラボに接続します。

のコースノブを使用します amplifierラボチャートの線をゼロに移動します。電極を挿入する前に、トグルノブを数回オンにしてからオフにする必要があります。電極抵抗をテストするには、結果の値の振幅を測定します。

顕微鏡を覗き、電極プローブを使用して、縦方向の筋線維の1つ(DEMまたはDL1またはDL2)に電極を挿入します。筋繊維を貫通しないように注意してください。これで、実験の準備が整いました。

吸引電極は分節神経束を刺激するために使用され、ガラス微小電極は筋線維からのシナプス応答を記録するために使用され、移植刺激装置は位相応答のために1ヘルツで神経を刺激する。次に、電極をSEL筋繊維に入れます。SELは強直筋です。

10ヘルツのパルスの短いバーストで神経を刺激し、強直反応を起こします。DEL筋とSEL筋の記録された応答を比較します。位相性DEL筋は、強直性SEL筋よりも振幅シナプス反応が大きいことに注意してください。

この次の一連の実験は、伸筋ではなくザリガニ屈筋に焦点を当てています。新しいザリガニから始めて、この手術で示されているように腹部を分離します。このビデオの最初のセクションでは、分離された尾の準備を生理食塩水で満たされたペトリ皿に入れ、準備の尾と上部を固定します。

dec Caroが強直屈筋の実験を行うと、腹側神経索はそのままにしておく必要があることに注意してください。メスを使用して、製剤の腹側にある2つの肋骨の間の関節膜を縦方向に切り込みます。.深い切り傷は運動神経根を横断する可能性があるため、この切り込みを入れるときは深く切りすぎないように十分に注意してください。

次の手順に進みます。ハサミやメスを使って顕微鏡で見ると、筋肉を覆っている薄い膜層の縦方向の切り傷から水平に切り取られます。カットを拡大して関節膜のフラップを作り、フラップを上に持ち上げます。

ハサミを使用してフラップを切り取り、表在屈筋からの細胞内記録のために表在屈筋を露出させます。安静時膜電位と腹部伸筋からのシナプス応答を記録するために使用したのと同じ装置とセットアップを使用します。前と同様に、3モルの塩化カリウムを充填した細胞内電極を使用します。

表在屈筋の筋線維に電極を挿入し、筋肉を貫通しないように注意します。EPSP の自発的な活動を記録します。EPSP のサイズが異なること、および IPSP が存在するかどうかに注意してください。

小さな絵筆を取り、記録電極を含む同じセグメント内のキューティクルの端に沿って慎重にブラシをかけます。より大きな反応が観察された場合は、刺激によるEPSPの周波数またはサイズの変化に注意してください。これは、感覚神経の発火の変化に応答する追加の運動ニューロンの動員を示しています。

生理食塩水浴液を、1マイクロモルのセロトニンや二酸化炭素で泡立った生理食塩水などの神経調節物質を含むものと慎重に交換します。その後、絵筆の刺激を繰り返します。入浴液の変更が記録された活動に与える影響に注意してください。

入浴生理食塩水を通常の生理食塩水に戻し、筋繊維活動がベースラインに戻ることを確認します。この図は、表在屈筋線維に記録されたEPSPを示しています。EPSP のサイズが異なることに注意してください。

この実験の次の段階では、細胞外電極を使用して、感覚の活動に応答する運動ニューロンからCNS、運動ニューロン回路への活動電位を監視します。まずは、感覚神経を刺激するための吸引電極を作ることから始めます。プラスチックチューブを炎の上に引っ張ります。

次のステップは、チューブを希望のサイズにトリミングすることです。これを行うには、吸引電極の望ましい開口部の直径を判断するために、準備中の神経を見る必要があります。ザリガニのサイズに応じて、神経束のサイズは直径約1ミリメートルから数ミリメートルまでさまざまです。

チューブの伸ばした部分をカットして、先端の開口部を神経を保持するのに適したサイズにします。開口部が大きすぎると、神経が抜け落ちる可能性があります。開口部が小さすぎると、電極の圧力によって神経が損傷する可能性があります。

プラスチックチューブをガラス製サック電極の先端に置きます。電気生理学とソフトウェアのセットアップは、細胞内記録のセットアップと比較して、細胞外応答のモニタリングとは少し異なります。添付の記事で指定されているように、機器は、表在屈筋を吸引電極に神経支配する第3のルートを吸引します。

これで、活動電位の記録を開始できます。このルートには、5つの興奮性運動ニューロンと1つの阻害剤運動ニューロンがあります。ベースライン活動を記録した後、ブラシでキューティクルを刺激して、生成された活動電位の変化を観察します。

これに続いて、前の実験と同様に、入浴液をセロトニンなどの神経調節剤に交換し、応答の変化を記録します。追加の演習は、付属のテキストに記載されています。この記録は、ブラシによるキューティクルの刺激前および刺激中の第3経路から記録された活動電位を示しており、ブラッシング前の活動電位の周波数を刺激中のそれらの周波数と比較します。

この記録は、生理食塩水とセロトニン溶液中の3番目のルートから記録された活動電位を示しています。生理食塩水の活動電位の周波数を、その周波数とセロトニンと比較します ちょうど示したように。ブラッシングは、ベースラインよりも点火頻度を増加させます。

また、セロトニンは生理食塩水よりも発火頻度が増加することが実証されています。この図は、ブラッシングとセロトニンを組み合わせると、発火頻度がさらに増加することを示しています。外部カリウム濃度が静止膜電位に及ぼす影響の外部および理論的に導出された影響の比較は、イオンが膜電位に及ぼす影響を示しています。

また、位相筋と強直筋の両方の神経筋接合部でのntic応答を記録する方法も示しました。これらの手法は、基本的な概念や生理学を教えるための調査学生の研究室に使用できます。この実験室演習で得られた技術は、他の実験室調製物に関連する質問に答えるだけでなく、医学や健康に関連する生理学的応用にも使用できます。