ザリガニ後腸との生理学的実験：学生実験室実習

このレポートの全体的な目標は、生理学の実験に参加する生理学コースの上級高校生および学部生向けの教育ツールになることです。生徒は、ザリガニの後腸の収縮を露出させ、記録することを学びます。さらなるステップは、動物から後腸を切除することであり、これにより化合物の直接適用が可能になります。

次に、後腸平滑筋の収縮の力とリズムを、さまざまな薬理学的薬剤を適用しながらモニタリングし、収縮の強さを変化させるメカニズムを調べます。モジュレーターが神経内部に作用するか、または直接筋肉に作用するかを示す結果が得られ、薬理学的アッセイおよび受容体サブタイプに基づいています。こんにちは、ブロック大学生物科学部のJ・メルシエ博士です。

私はザリガニの後腸を、内臓筋を制御する神経伝達物質の研究を行うための準備として使っています。また、この準備を教育ツールとして使用しており、ケンタッキー大学のロビン・クーパー博士の研究室とのコラボレーションの一環として、教育目的で多くの学生が実行する実験を完成させています。この方法は、ザリガニのハングガットの機能についての洞察を提供することができます。

また、蠕動リズムに関与する疾患などの疾患の研究にも応用できます。また、筋肉の調節と神経神経支配の根底にあるメカニズムを説明するためにも使用できます。学生は、薬理学的物質、神経伝達物質、および神経ホルモンを使用して生理学的および薬理学的データを解釈することを学び、受容体機能についての一般的な理解を習得します。

アゴニストとアンタゴニストに関しては、学生は用量反応曲線を作成し、統計分析のためにデータをグラフ形式で提示します 動物に麻酔をかけるには、体長6〜10センチメートルのザリガニを氷の上に5〜10分間置きます。麻酔をかけたザリガニを爪の後ろから片手で持ちます。目のソケットから両側の頭の中央まですばやく切り取り、次にザリガニの首を切ります。

試しに作製した血液がベタベタになってしまうので、出来上がったら道具を洗ってください。次に、脚と爪を切り落とします。次に、左右の尾びれが付き、中央の尾びれが腹部の背側に沿って切り取られ、最後のセグメントに達するまで残ります。

次に、最後のセグメントに沿って反対側をカットします。背側の殻を外します。解剖したザリガニをシガーで裏打ちされたペトリ皿に入れます。

かわいそうなザリガニの生理食塩水。調製物を覆うために、解剖ピンを使用して調製物をペトリ皿に固定しました。後腸は通常、血管と結合組織の塊に囲まれています。

これらを鉗子で取り除きます。腸を傷つけないように注意してください。後腸が腹部に沿って見えるようになりました。

解剖したザリガニの準備物を生理食塩水に約10分間置いて、解剖と生理食塩水への曝露のショックから回復できるようにします。後腸のゆっくりとした蠕動収縮に注意してください。まず、収縮率を計算できるようになりました。

30秒間に発生した収縮の数を数え、ログに記録します。また、発生する収縮の種類と、それらが蠕動性か痙性かを記録します。蠕動波の方向に注意してください。

肛門の近くと腹部の中間で収縮率を数え、これら2つの領域間に速度の違いがあるかどうかを確認します。さまざまな試験液を用意し、入浴生理食塩水と同じ温度で調理します。ここでテストされる最初の溶液は、ザリガニの生理食塩水で作られた1マイクロモルのセロトニンです。

ピペットを使用して、ザリガニの露出した腹部の空洞から生理食塩水を取り除き、1マイクロモルのセロトニン溶液を直接後腸に塗布します。新しい溶液を追加した直後に、30秒待ってから、肛門付近の30秒分の収縮を数え、次に腹部の途中で次の30秒分の収縮を数えます。これらの数値をチャートに記録し、発生する収縮の種類にも注意してください。次に。

記録皿から試験液を注ぎ、通常のザリガニ生理食塩水で後腸を数回すすぎます。次に、30秒ごとに5分間準備をすすぎます。この時点で、次の試験溶液(このデモンストレーションでは1マイクロモルトパミン)を追加できます。

前と同じように観察結果を記録し、残りの試験化合物についてこのプロセスを繰り返します。同じ物質を複数の濃度で使用する場合は、必ず最低濃度から始めて、高濃度に作業してください。GI収縮の力を測定するためのセットアップには、ラボチャート7ソフトウェアを搭載したラップトップ、ブリッジポッド、パワーラボ、26 T、および力トランスデューサが含まれます。

消化管の収縮の力を測定する前に、消化管を分離する必要があります。これを達成するには、最後の腹部セグメントの筋肉を切り取り、肛門の両側にある柔らかい腹側のキューティクルに2つ以上のピンを配置し、次に腹部の残りの部分を切り取り、後腸と肛門をキューティクルの小さな部分に取り付けたままにします。腸は胸部と腹部の接合部の近くで切るべきです。

次に、消化管を底がサードコーティングされた浅い皿に移動します。消化管の背側に沿って走る血管があります。これを消化管から慎重に引き離します。

新鮮なザリガニの生理食塩水を準備物に注ぎます。力変換器を準備に移動します。力変換器の底部に接着されているピンをよく見てください。

腸に引っ掛かる端は少し曲がっています。ピンの小さな曲がりを後腸の切り口に引っ掛けます。後腸を引っ掛けた後、後腸がぴんと張るまで皿を少し動かします。

このステップでは、腸がぴんと張っている必要がありますが、きつすぎないように注意してください。きつすぎると筋肉が損傷する可能性があります。皿が最適な位置にあるときは、ワックスまたは粘土を使用して皿を安定させます。

次に、ソフトウェアを起動します。記録を開始するには、ラボカルテソフトウェアを開きます。ラボカルテを閉じて、ウェルカムセンター。

左上の[セットアップ]に移動します。左下のチャンネル設定をクリックします。チャンネル設定を 1 つのみになるように変更します。

画面の右側にある[OK]をクリックします。チャネル 1 のオープン ブリッジ ポッドに移動します。範囲を最も感度の高い設定(この場合は200マイクロボルト)にチャートの右隅に設定します。

1秒あたりのサイクル数を2Kに設定します。これで、録音する準備が整いました。[開始] をクリックして、セットアップが正しく機能していることを確認します。

ピペットでトランスデューサーの先端に軽く触れます。ソフトウェアによって記録された力の変化が表示されます。ソフトウェアの[停止]をクリックし、[開始]をクリックしてプログラムを実行します。

約 20 秒間、[停止] をクリックし、生理食塩水というラベルの付いたコメントを追加します。収縮率を計算するには、1つのたわみの開始から次のたわみの開始までの時間を測定するか、1分または2分にわたるたわみの合計を数えます。速度は、発生速度に応じて、1分あたりの収縮数または1秒あたりの収縮数として計算します。

収縮の力を測定するには、相対測定を使用して、保存されたファイル上のさまざまな条件下での収縮を比較します。マーカーMをベースラインに移動し、次にカーソルを変位量のピークに移動して、画面の右上にリストされている値を確認します。これは、Mからピークまでの差であるデルタ値です。

変化を測定するためには、カーソルをピークで静止させる必要があることに注意してください。次に、Mマーカーとカーソルを次の目的の波形に移動し、メジャーを繰り返してモジュレーターの効果を調べます。この準備では、生理食塩水をゆっくりと試験溶液に切り替えます。

この場合、1マイクロモルのセロトニン、および最後のテストとして収縮の速度と力を記録し続けます。この調製試験では、ギャップ結合阻害剤が収縮の速度または力を変化させるかどうか、ギャップ結合阻害剤には、二酸化炭素で泡立たれた1つのHEPエタノールまたは生理食塩水が含まれます。これらの化合物は、さまざまな化合物の影響を比較し、データをグラフ化するために、長時間の曝露後に筋線維を損傷する可能性があるため、最後に使用されます。

この準備のもう一つの興味深い使用法は、輪状筋によって生成される力を記録することです。ただし、ギャップ結合阻害剤を製剤に適用した場合、阻害剤が輪状筋を損傷した可能性があるため、その場合は、新しい後腸製剤を使用して円形筋をテストする必要があります。円形の筋肉を露出させるには、細かいハサミで腸の管を縦方向の平面に切り込みます。

細いピンを使用して、片側を皿にしっかりと固定します。トランスデューサーのフック付きピンをストリップの反対側に取り付けます。縦方向の筋肉で試験されたのと同じ化合物に調製物をさらすと、試験された化合物と収縮の数および種類との関係がここに示されている。

生理食塩水、セロトニン、グルタミン酸溶液の収縮回数と時間をグラフ化できます。生理食塩水セロトニングルタミン酸溶液の収縮数と収縮の力をミリボルト単位でグラフ化できます。これらの移植片は、腸のさまざまな領域の縦筋と円形の筋肉がさまざまな調節因子に対して異なる反応を示すかどうかをテストするために、縦筋と円形筋の両方に対して行うことができます。

上記の実験は、肛門から腹部までのさまざまな領域で繰り返すことができます。この手順を試行する際は、ピンセットで消化管を傷つけないように注意し、力変換器で強く引っ張らないように注意することが重要です。電気生理学的な他の方法、筋肉の記録は、イオンチャネル機能や変調などの他の問題に対処するために実行でき、他の動物モデルのモデルや他の組織として役立つことができます。