回路基板と生体膜のモデル化と軸索の電気信号の測定：学生研究室の演習を

この手順の全体的な目的は、電気モデルを用いて生物学的膜をどのように理解できるかを示し、ザリガニの腹側神経索から活動電位を記録する手順を実演することです。まず、ブレッドボード上の回路部品を使用して、膜の電気的特性を表現します。次に、モデル回路の抵抗と容量を変化させ、電圧波形への影響を確認します。

本手順の第3ステップでは、モデル回路から学んだ概念を生体神経標本に適用します。最終ステップでは、複合活動電位を記録し、閾値不応期とシナプス伝達の特性について理解を深めます。最終的に、モデル回路の構成要素の変更や生体神経への刺激条件の変更を通じて、生物学的膜の電気回路モデルおよび生体神経の特性を検討することが、いかに有用な教育ツールとなり得るかが示されます。

この手法により、生体膜を電気モデルとしてどのように理解できるかについての知見を得ることができます。また、筋肉などの他の組織にも適用可能です。腹側神経索の解剖や記録系のセットアップは、最初は困難を伴うことがあり、神経索からの刺激および記録に適したセットアップを構築するためには、神経を損傷させないよう細心の注意を払う必要があるため、本手法のデモンストレーションは極めて重要です。

本実験の第一部では、抵抗器とコンデンサを用いて神経細胞膜の電気活動をシミュレートします。最初の回路は抵抗器のみで構成されており、後のステップでコンデンサを追加します。

神経膜の受動的抵抗特性は、ここに示す回路で表されます。ブレッドボードには、横断膜抵抗を表す33 kΩの並列抵抗と、細胞内抵抗を表す10 kΩの直列抵抗が配置されています。この回路は、外部液の抵抗が細胞内抵抗および横断膜抵抗に比べて無視できるものであると想定しています。

モデル細胞が完成したら、PowerLabの出力リードをブレッドボードモデルに接続します。PowerLabは刺激を発生させ、電圧を記録するための測定プローブを備えています。次に、PowerLabをコンピュータに接続してください。

コンピューターを使用して、ブレッドボードから記録された電気信号を表示します。次のステップは、PowerLabからモデル神経細胞に送られる刺激を制御するコンピューターソフトウェアを設定することです。デスクトップからLabChartプログラムを開いてください。

「New file」を選択し、「Setup」を選択してから「Channel settings」を選択します。表示するチャネルを1つ選択し、次に「Stimulator panel」を選択します。1.5 voltsの長時間パルスが必要です。

実験のこの段階では、振幅を1 voltに調整します。PowerLabから正負0.5 voltの間で変動する電圧が出力され、これによりピーク・ツー・ピーク刺激が1 voltとなります。周波数を0.75 hertzに、パルス幅を1 secondに設定してください。

チャンネル設定では、モニタリングするチャンネル1を選択し、「input amplifier」をクリックして、ボックス内の「differential」ボタンをクリックし、レンジを5 Vに設定して選択します。次に、神経細胞モデルに電気信号を印加し、モデルの長さに沿った信号の減衰を調べます。コンピュータ上の「start」をクリックして、回路の一端のAとBの間に電圧を印加します。

モデル軸索に沿った最初の単位長さの電圧を測定し、コンピューターでモニターします。電圧測定プローブの赤色のリード線をブレッドボード上の点Aに固定したまま、もう一方のリード線を直列接続された抵抗器の間の異なる位置に移動させます。離れた位置になるほど電圧が低下することを確認してください。

コンピューターの停止ボタンを押し、記録を終了します。コンピューターに保存されたトレース上の各パルスにカーソルを合わせ、保存された電圧差を測定します。画面左下のMマーカーカーソルでトレースの底部を指定し、フリーカーソルをトレースのピークに配置して電圧差を測定してください。

画面から電位差の測定値を読み取り、回路に沿った各測定箇所の値をノートに記録します。次のステップでは、距離に伴う信号の指数関数的な減衰を記述するために用いられる、モデル細胞の長さ定数を算出します。膜抵抗を1単位として、電源からの距離に対する電位差のグラフに、それぞれの電位差の値をプロットしてください。

グラフとは別に、この回路の長さ定数を決定してください。神経線維の長さ定数は、膜電位が起点における元の値の37%まで低下する距離として定義されます。神経および筋線維の受動的なケーブル特性をより適切にシミュレートするため、モデル神経細胞を拡張し、抵抗成分と容量成分の両方を含めるようにします。

神経細胞膜には横方向の膜抵抗が存在するだけでなく、表面膜容量も存在し、これが神経細胞の信号を歪ませます。これをシミュレートするために、10 µFのコンデンサを横方向の膜に並列に接続します。抵抗器はコンピュータ側のブレッドボード上に配置してください。

スティミュレーターの設定を、1秒、1V（振幅設定 0.5 V、パルス周波数 0.75 Hz）にします。また、パネルの右上にあるデータ収集率を 20 K/s に設定します。次に、画面右側にあるチャンネル1をクリックします。

ボックス内の入力アンプをクリックします。ディファレンシャルボタンをクリックし、レンジを5Vに設定します。OKをクリックします。

これらの変更を保存するには、[スタート]をクリックしてデータ収集を開始してください。ブレッドボード上の同じ箇所でデータを測定します。データ収集後、ズームウィンドウを使用して、スクエアパルスの一つの立ち上がり時間を拡大してください。

必要に応じてズームインを繰り返し、トレースの間隔を広げます。信号がベースラインから立ち上がり、電圧トレースの頂点に達するまでの時間を測定します。ちょうど平坦になるタイミングで測定してください。

電位変化の時間経過と、方形パルスの歪みを観察してください。また、前述と同様にMカーソルとフリーカーソルを用いて、測定された電圧が0.2 voltsを超えているかを確認し、電圧の変化量を読み取ってノートに記録してください。この際、閾値電圧を0.2 voltsと想定します。各膜抵抗において、電位が閾値に達するまでにかかる時間を測定してください。

結果を時間対距離としてプロットします。髄鞘の厚さが増すと膜容量が減少します。ブレッドボード上の10 µFコンデンサをより小さい0.1 µFコンデンサに交換することで、これをシミュレートしてください。前述の実験を繰り返します。

選択した抵抗器において、閾値に達するまでの時間の変化に注目してください。より容量の大きいコンデンサを用いたデータを、前述の時間対距離のグラフに重ね合わせます。髄鞘の厚さを増すことで、神経細胞内での電気信号の立ち上がりと立ち下がりがより速くなり、その結果、伝導速度が向上します。

実験の次のパートでは、ザリガニの腹側神経索における軸索の電気化学的特性を調べます。モデル回路で示された受動的な電流拡散の特性は、生体標本においても観察されます。しかし、細胞の受動的な電気的特性によって信号が減衰するため、数ミリメートルの距離にわたって信号を伝達する必要がある場合は、活動電位が必要となります。

ザリガニの腹側神経索を伝わる信号の伝導速度が異なる場合、最も速い信号が最初に観測され、遅い信号はわずかに後に観測されます。伝導速度が近い軸索の集団によっては、一部の信号が記録において合算されます。このように複数の軸索から生じる合算された電気信号は、複合活動電位と呼ばれます。

次の一連の実験では、ザリガニの腹側神経索を得て、ザリガニの神経から複合活動電位を記録することに焦点を当てます。まず、神経解剖用ディッシュ、解剖器具、および生理食塩水を用意します。ザリガニを氷上に約5分間置き、麻酔をかけます。

麻酔後、ザリガニを湿らせたペーパータオルで包み、親指と人差し指で鉗脚を固定して片手で保持します。もう一方の手で、眼窩の間の額角に沿ってハサミで切開します。切開口から下方に向かって切り進み、頭部を完全に切り離します。

鉗脚と歩脚を取り除きます。腹部の上方にある頭胸部の基部を切開し、頭胸部を切り離します。尾と遊泳脚を取り除きます。

腹部腹側の両側に沿って切開します。深部の組織を傷つけないよう注意してください。腹側神経索を露出させるため、切り離した外骨格の部分を尾扇の基部まで剥ぎ取ります。

ピンセットの端を使用して、腹側神経索を先端から慎重に取り除きます。神経索を伸ばしたり、押し潰したりしないように注意してください。神経索に見られる結節はザリガニの神経節です。

神経索を神経チャンバー内の金属バーの上に置きます。腹側神経索を湿った状態に保つことが不可欠です。そのためには、金属のクロスバーと同じ高さになるまで、十分な量のザリガニ生理食塩水を神経チャンバーに加えてください。

次に、液面がバーの底部にちょうど接するまで、ザリガニ生理食塩水をピペットで吸い出します。神経索を配置したら、2本のミニフックリードが付いた刺激装置ケーブルを神経チャンバーに取り付けます。赤い正極リードを神経索末端付近にある外部金属ループの1つに取り付け、黒い負極リードを神経索に接触している隣接する金属ループに取り付けます。

マニピュレーターを使用して、吸引電極を負極および正極リードとは反対側の神経末端付近に配置します。腹側神経索の先端を慎重に記録電極へと吸引します。吸引電極からの1本のワイヤーをプローブの正入力端子に、もう1本のワイヤーを負入力端子に接続し、電極をヘッドステージプローブに取り付けます。

どちらの電線がどちらの入力端子に接続されても問題ありません。プローブは、塩化銀線を用いてファラデーケージまたは生理食塩水バスに接地させるか、あるいは差動アンプのグランド入力に接続して60 Hzの電位ノイズを低減させます。プローブを差動アンプに取り付け、アンプをPowerLabに接続します。

付属記事の表に示されているアンプRSの設定を確認してください。USBケーブルを使用して、PowerLabをコンピュータに接続します。コンピュータのデスクトップ画面右上にあるScopeソフトウェアを開きます。

チャンネル2を選択し、オフにします。画面中央のバーを画面下端までドラッグして、チャンネル1のみが表示されるように調整します。付属の論文に記載された設定で、入力アンプを確認してください。

次に、画面上部のセットアップでスティミュレーターを選択し、isolated stemをオフにします。ディレイを5 millisecondsに、デュレーションを1 millisecondに、パルス数を2 pulsesに、インターバルを15 millisecondsに、レンジを5 voltsに、そして振幅を0.5 voltsに設定します。腹側神経索への刺激を開始するには、画面左下のスタートボタンをクリックします。スコープのデータ収集ボックスに、明確に定義された活動電位が表示されるはずです。

ノートに活動電位の一般的な形状を描いてください。画面左上のタブを使用して、電圧をゆっくりと下げます。活動電位の振幅は小さくなり、最終的にその特徴的な波形パターンが消失します。

電圧を下げると、複合活動電位に寄与して動員されるニューロンの数が減少します。この効果を反転させるには、電圧を段階的に上げます。より多くのニューロンが動員されるにつれて、複合活動電位の波形は大きくなります。この演習は、個々のニューロンがそれぞれ異なる活動電位誘発閾値を持っているという事実を例証しています。

刺激電圧をさらに上げても複合活動電位が増加しなくなったとき、すべてのニューロンが動員されたことになり、コンピュータ画面上に活動電位波の2つの明確なピークが見えるはずです。実験の次のパートでは、軸索の不応期を調べます。画面左上のタブを使用して、パルス間の遅延時間を変更してください。

2つ目の複合活動電位が誘発できなくなるまで、遅延時間を短くし続けます。絶対不応期は、パルス間の時間遅延において、2つ目の活動電位がもはや誘発されなくなる時間として定義されます。相対不応期は、絶対不応期の終了から、2つ目の刺激によってフル振幅の2つ目の活動電位が得られるまでの時間として定義されます。

これで、ヘプトエタノールのようなギャップ結合阻害剤の特性を検討することができます。同一の刺激設定で複合活動電位の差異を比較することにより、腹側神経索に沿ってどの信号がギャップ結合を介して伝導されるかを判断できます。また、冷生理食塩水または温生理食塩水を用いて、複合活動電位を構成するさまざまな成分の伝導速度の差を測定することも可能です。

ここに示すのは、ザリガニの腹側神経索から記録された2つの複合活動電位です。この図は、完全な複合活動電位の後に、2回目の刺激によってより小さな複合活動電位が誘発される時間である相対不応期を示しています。また、この図は、この手順の後にヘプトエタノールを使用した際の複合活動電位への影響を示しています。

生物学的膜回路の構成要素を変更することで、膜におけるリークチャネルの密度の変化による影響や、開発後の電位依存性チャネルの機能といった追加の疑問を検証することが可能です。これらの手法と手順は、生理学分野の研究者が、細胞がいかに電気回路として機能するか、また動物の生体組織においてギャップ結合がいかに機能するかを探索するための道を切り拓くものです。