Name: のインプリント遺伝子のDNAメチル化の定量シロイヌナズナ胚乳 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-01-28T18:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 23 s
Description: 学ぶ、シロイヌナズナ胚乳のインプリント遺伝子におけるDNAメチル化状態の定量法。バイサルファイトシーケンスを用いて、親由来アレルのメチル化パターンを解析し、植物のゲノムインプリンティング機構を解明する。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

著者らは、 シロイヌナズナ植物のメンテナンスのために氏ジェニファーM.ロンメルとタラN. Rognanに感謝。この作品は、健康補助1R15GM086846 - 01とW ·シャオに3R15GM086846 - 01S1のセントルイス大学と国立研究所からの起動資金によってサポートされていました。

I.遺伝クロッシング 1。女性の親をEmasculating DNA配列の多型を使用して母親と父親の対立遺伝子を区別するために、二つの異なる生態型、例えば、コロンビア- 0（COL - 0）とLERは、女性と男性の両親として選択されます。植物は、若くて健康でなければなりません。一つは、解剖顕微鏡、拡大鏡のバイザー、または肉眼を使用して女性の親を骨抜きにすることができます。ステージ- 12花を見つけて（スミスら 、1990）とハサミと小花柄のベースクリッピングによるあらゆる花やsiliques上下それらを削除します。鉗子上の任意の花粉を除去し、同様に花粉を殺す95％エタノール、のビーカーに静かに先端の基盤を浸漬することで鉗子を滅菌する。静かに鉗子を使用して花芽をこじ開ける、ゆっくりと雌しべがむき出しとそのままにして、4がく片、4枚の花弁、6雄しべを取り除く。このプロセスの間に心皮への損傷を避けるようにしてください。 2。花粉ドナーをピッキングし、受粉を行っ最高の花粉のドナーは、花粉の多くが脱落している雌ずい（スミスら 、1990）、90 °の角度で伸びる花びらでステージ14で開いている花をanthesedされています。ベースで花をつかむと、ちょうど小花柄の上に、これは花が開いて広がることになります。葯と準備雌しべの柱頭ほこりを取り除きます。受粉後、汚名は簡単に顕微鏡下で観察することができる黄色の花粉で覆われる。 3。クロスのラベリング植物のすべての去勢雌しべを受粉した後、我々は、宝石のタグと、女性と男性の両親と日付の情報をクロスにラベルを付けます。工場に近い土壌​​の株式を置く、株式への花序の茎を結ぶために文字列を使用して、ビニール袋で受粉雌しべをカバー。 II。 シロイヌナズナにおける胚乳組織の分離 1。材料の準備液体窒素タンク、液体窒素、解剖顕微鏡、精密チップピンセット（デュモン生物学、スイスで5 INOX FST）、顕微鏡のスライドガラス（の二つの新しいペア：我々は通常、胚乳および胚組織を収穫する前に準備が必要な材料を得る3"X 1"X 1.0 mm）を、ソルビトール0.3 MのpH 5.7溶液及び5mMのMES。 2。収集siliques 7時 - または8日目の後の受粉（DAP）、種子は胚発生の後期魚雷段階半ばまでに収穫し、胚乳および胚のために解剖する準備が整いました。去勢花は若すぎる場合、時に、それは9〜10 DAPがかかる場合があります。 3。胚乳および胚の隔離 シロイヌナズナの種子は小さいですので、我々は、胚乳および胚を分離するために解剖顕微鏡を使用してください。顕微鏡下で8 DAPの​​長角果を入れ、長角果柄を保持するためにピンセットを使って二心皮のヒューズマージンで開いて長角果をスライドさせて鉗子の別のペアの先端を使用してください。種皮から胚乳と別の胚乳を押し出すためにカットされていない端を絞る、胚を引き出すために卵門端に小さなカットを行う、ソルビトール0.3 Mおよび5mM MESのpHは5.7ソリューションにつのシードをピックアップしてピンセットを使用して、 （木下ら 、2004）。液体窒素で別々のマイクロチューブに胚と胚乳を置く。 -80℃の冷凍庫に管を保管し、我々は10〜15 siliquesから胚や胚乳を蓄積するまで、これを続けると。いくつかのケースでは、胚乳は種皮、すなわちから分離する必要がない、人は遺伝子刷り込みの分析のための胚乳と種子コートの混合物からトータルRNAを分離することができます。 III。バイサルファイトシークエンシング 1。必要な試薬 、：ゲノムDNA、制限酵素、3 M水酸化ナトリウム（たて）、6.42 Mの尿素/ 4 Mの亜硫酸水素ナトリウム（190 2 Mのメタ重亜硫酸ナトリウム、Sigma - Aldrichは、S9000、Na2S2O5、分子量）を調製するためのセチルトリメチルアンモニウムブロマイド（CTAB） 10mMのヒドロキノン、DNA精製キット（Promega社ウィザードDNAクリーンアップシステム、カタログ番号A7280）、TEバッファー、6.3 M水酸化ナトリウム（たて）、10 M NH 4 OAC、20μg/μLのtRNAは、100％エタノール。 2。亜硫酸水素塩の治療プロトコルの詳細<ol><li> CTABの手順を（ロジャーズとBendich、1988）を用いたゲノム胚乳や胚のDNAを分離します。 </li><li>ダイジェストは100 ng - 分析する領域の外側に切断する制限酵素で100μL全量を20μLのゲノムDNA2μgの。 MEAのプロモーターの場合は、我々はXhoIで、NdeIで、とPstIまたはHindIII部位を使用してください。 </li><li> 5分間DNAを煮沸して制限酵素を変性し、氷上で急冷する。 </li><li> 15分間37℃で3 M NaOHおよびインキュベートの1 / 9量（20μL消化されたDNA 2.2μL）° Cを追加。 </li><li> 250μLのPCRチューブにソリューションを転送する。 </li><li>滅菌蒸留水10mlに尿素7.5 gを溶かし、ゆっくりと1〜2時間にわたってメタ重亜硫酸ナトリウムの7.6 gを追加し、加熱は、通常、溶解することができます。焼きたての10 M NaOHで5にpHを調整し、最終的に滅菌蒸留水を追加します。 20mlに容積。これは、6.24 Mの尿素/ 4 Mの亜硫酸水素ナトリウムのソリューションです。 </li><li>それぞれ、5.36 Mおよび3.44 Mの最終濃度に6.24 Mの尿素/ 4 Mの亜硫酸水素ナトリウム溶液を加える（ポーリンら 、1998）。例えば、変性したゲノムDNAの上に22.2μL（小ら 、2003）に6.42 Mの尿素/ 4 Mの亜硫酸水素ナトリウム溶液を208μLを加える。 </li><li> 0.5mMの（20μL消化は12μL）の最終濃度でDNAを10 mMヒドロキノンを追加。 </li><li> 55 30サイクル℃で15分間と30秒間95 ° C：PCRのマシンで亜硫酸水素塩処理を行う。 </li><li>プロメガからウィザードのDNAクリーンアップシステムを用いてBisulfite処理したDNAを脱塩し、（ヤコブセンら 、2000）プロトコルをフォローアップ。 </li><li>脱塩後にカラムから回収TEの正確な体積を測定し、37℃0.3 Mインキュベートの最終濃度は6.3 M NaOHを加える℃で15分間。 </li><li> 3 Mの最終濃度10 M NH 4 OAC液（pH7.0）、20μg/μLのtRNAの2μL、および100％エタノールとしてミックスの3倍量を追加。 14,000 rpmで15分間遠心。 </li><li> 、70％エタノールで1回ペレットを洗浄短い遠心を行い、余分なエタノールを除去します。 </li><li> 25の5-10分を再懸濁します用speedvacのドライペレット - DNAの量を始めるに応じて、100μlのTEバッファー。ナトリウム、亜硫酸水素塩処理したDNAは、現在のPCR解析の準備ができています。 </li></ol> 3。 PCRの増幅<ol><li>非メチル化シトシンをウラシルに変換されるので、テンプレートとして、亜硫酸水素塩処理したDNAを用いて大規模な断片を増幅することは困難です。従って、我々は通常500 bpよりもはや製品を増幅するプライマーを設計する。シーケンス4 KB MEAのプロモーターをするために、我々は、プライマーの多くのセットを設計し、14重複したフラグメントは、地域全体をカバーするために増幅（小ら 、2003）。 </li><li>シーケンスに上部の鎖は、フォワードプライマー、I）の設計でプライマー内に追加可能なエキストラ長いヌクレオチドことなく、より高いアニーリング温度を持つために、G（グアニン）に富んだ領域を選択し、II）の変更C（シトシン）Yへ（ CGとCNGコンテキストにおけるピリミジン）とT（チミン）に、残りのCを変更してください。リバースプライマーを設計する上で、I）C -リッチ領域を選択する、II）は、CGでのR（プリン）とCNGコンテキストにGを変更し、A（アデニン）に残りのGに変更。 </li><li>フォワードプライマーを設計する上でシーケンスボトムストランドを、、私に）C -リッチ領域を選択する、II）は、CGでのRおよびCNGコンテキストにGを変更し、リバースプライマー、私の設計ではAに、残りのGを変更） G -リッチ領域、II）CGでのYのC（ピリミジン）とCNGコンテキストを変更し、T.、残りのCを変更する</li><li>我々は通常、各PCR増幅（小ら 、2003）のためのテンプレートとしてナトリウム、亜硫酸水素塩処理したDNAの1〜2μLを使用してください。 PCR産物は、ゲルインサートとして精製し、TOPO TAクローニングベクターpCR2.1（Invitrogen）にクローニングすることに、フラグメントの正しいサイズを確認するために、ゲル電気泳動によって分析する必要があります。単一のコロニーを拾い、培養され、プラスミドDNAを抽出し、配列決定のために送信されます。 </li></ol> 4。シーケンスの解析バイサルファイトシークエンシングの原理は、非メチル化シトシンがPCR産物にチミンとして増幅されるpH5.0での亜硫酸水素ナトリウムの高濃度で加水分解的脱アミノによるウラシルに変換されますです、5 - メチルシトシンは亜硫酸水素ナトリウムによって変更されることはありませんが、とPCR増幅後のシトシンに残ります（。クラークら 、1994;海外ホテルら、1992。）。シーケンシングの結果を得た後、我々は、PCR増幅に使用される鎖特異的なテンプレートと比較します。テンプレート内のシトシン残基は配列決定の結果でチミンとして読み取る場合、それはシトシンがメチル化されていないことを示しています。テンプレート内のシトシン残基はシーケンス中のシトシンのままである場合、それはシトシンがメチル化されていることを意味します。 IV。代表的な結果<img src="/files/ftp_upload/2327/2327fig1.jpg" alt="図1 /" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図1 /"> 図1。

<ol><li>Clark, S. J., Harrison, J., Paul, C. L., Frommer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+sensitivity+mapping+of+methylated+cytosines%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">High sensitivity mapping of methylated cytosines.</a> Nucleic Acids Res. 22, 2990-2997 (1994).</li>
<li>Cokus, S. J., Feng, S., Zhang, X., Chen, Z., Merriman, B., Haudenschild, C. D., Sriharsa Pradhan, S., Nelson, S. F., Pellegrini, M., Jacobsen, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shotgun+bisulphite+sequencing+of+the+Arabidopsis+genome+reveals+DNA+methylation+patterning%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Shotgun bisulphite sequencing of the Arabidopsis genome reveals DNA methylation patterning.</a> Nature. 452, 215-219 (2008).</li>
<li>Frommer, M., McDonald, L. E., Millar, D. S., Collis, C. M., Watt, F., Grigg, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genomic+sequencing+protocol+that+yields+a+positive+display+of+5-methylcytosine+residues+in+individual+DNA+strands%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">A genomic sequencing protocol that yields a positive display of 5-methylcytosine residues in individual DNA strands.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 89, 1827-1831 (1992).</li>
<li>Gehring, M., Huh, J. H., Hsieh, T. F., Penterman, J., Choi, Y., Harada, J. J., Goldberg, R. B., Fischer, R. L. D. E. M. E. T. E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+glycosylase+establishes+MEDEA+polycomb+gene+self-imprinting+by+allele-specific+demethylation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">DNA glycosylase establishes MEDEA polycomb gene self-imprinting by allele-specific demethylation.</a> Cell. 124, 495-506 (2006).</li>
<li>Henderson, I. R., Chan, S. R., Cao, X., Johnson, L., Jacobsen, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+sodium+bisulfite+sequencing+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Epigenetics%22%5BJournal%5D)">Accurate sodium bisulfite sequencing in plants.</a> Epigenetics. 5, 47-49 (2010).</li>
<li>Hsieh, T. F., Ibarra, C. A., Silva, P., Zemach, A., Eshed-Williams, L., Fischer, R. L., Zilberman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+demethylation+of+Arabidopsis+endosperm%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genome-wide demethylation of Arabidopsis endosperm.</a> Science. 324, 1451-1454 (2009).</li>
<li>Jacobsen, S. E., Sakai, H., Finnegan, E. J., Cao, X., Meyerowitz, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ectopic+hypermethylation+of+flower-specific+genes+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Ectopic hypermethylation of flower-specific genes in Arabidopsis.</a> Curr. Biol. 10, 179-186 (2000).</li>
<li>Kinoshita, T., Miura, A., Choi, Y., Kinoshita, Y., Cao, X., Jacobsen, S. E., Fischer, R. L., Kakutani, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-way+control+of+FWA+imprinting+in+Arabidopsis+endosperm+by+DNA+methylation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">One-way control of FWA imprinting in Arabidopsis endosperm by DNA methylation.</a> Science. 303, 521-523 (2004).</li>
<li>Lister, R., O'Malley, R. C., Tonti-Filippini, J., Gregory, B. D., Berry, C. C., Millar, A. H., Ecker, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+integrated+single-base+resolution+maps+of+the+epigenome+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Highly integrated single-base resolution maps of the epigenome in Arabidopsis.</a> Cell. 133, 523-536 (2008).</li>
<li>Lister, R., Pelizzola, M., Dowen, R. H., Hawkins, R. D., Hon, G., Tonti-Filippini, J., Nery, J. R., Lee, L., Ye, Z., Ngo, Q. -M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+DNA+methylomes+at+base+resolution+show+widespread+epigenomic+differences%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Human DNA methylomes at base resolution show widespread epigenomic differences.</a> Nature. 462, 315-322 (2009).</li>
<li>Paulin, R., Grigg, G. W., Davey, M. W., Piper, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Urea+improves+efficiency+of+bisulfite-mediated+sequencing+of+5%27-+methylcytosine+in+genomic+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nucl.+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Urea improves efficiency of bisulfite-mediated sequencing of 5'- methylcytosine in genomic DNA.</a> Nucl. Acids Res. 26, 5009-5010 (1998).</li>
<li>Rogers, S. O., &amp, B. endich, J, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extraction+of+DNA+from+plant+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Molecular+Biology+Manual%22%5BJournal%5D)">Extraction of DNA from plant tissues.</a> Plant Molecular Biology Manual. A6, 1-10 (1988).</li>
<li>Smyth, D. R., Bowman, J. L., Elliot, M., Meyerowitz, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+Flower+Development+in+Arab%C3%ADdopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Early Flower Development in Arabídopsis.</a> Plant Cell. 2, 755-767 (1990).</li>
<li>Xiao, W., Gehring, M., Choi, Y., Margossian, L., Pu, H., Harada, J. J., Goldberg, R. B., Pennell, R. I., Fischer, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imprinting+of+the+MEA+Polycomb+gene+is+controlled+by+antagonism+between+MET1+methyltransferase+and+DME+glycosylase%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">Imprinting of the MEA Polycomb gene is controlled by antagonism between MET1 methyltransferase and DME glycosylase.</a> Dev. Cell. 5, 891-901 (2003).</li>
</ol>

利害の衝突は宣言されません。

それは、胚乳と種皮から胚を分離することは比較的容易ですが、それは胚発生の初期または中期魚雷の段階で、特に種子のために、種皮から胚乳を分離することは面倒です。種皮のみを組織のごく少量を寄与するため、いくつかの遺伝子については、例えば、MEAとFWAは 、我々は種皮から胚乳を分離する必要はありません。我々は胚乳と種皮の組織の混合物からRNAを分離できることを意味、遺伝子の母親と父親の対立遺伝子の発現を確認し、胚における発現と比較して、遺伝子の刷り込みの状態を決定する。 バイサルファイトシークエンシングのために、設計されたプライマーは、鎖特異的である必要があります。時には、それは、亜硫酸水素ナトリウム処理による損傷DNAのテンプレートのために、亜硫酸水素塩処理したゲノムDNAから断片を増幅することは困難であり、我々は通常、様々な地域や短い断片でPCRプライマーの異なるセットを試してみてください。制限酵素消化後、ゲノムDNAは、亜硫酸水素の脱アミノ化は、ほとんど二本鎖DNA構造のシトシン残基上では動作しないので、一本鎖に完全に変性する必要があります。別の...

電源<ul><li>解剖顕微鏡</li><li>はさみ</li><li>ファインチップ鉗子</li><li>ジュエリータグ</li><li>植物ステークス</li><li>文字列またはツイストネクタイ</li><li> 4&quot;X 2&quot;X 8&quot;ポリエチレン袋</li><li> 3&quot;X 1&quot;X 1.0 mmの顕微鏡用スライド</li><li>液体窒素</li><li>液体窒素容器</li><li>ヒートブロック</li><li> PCRチューブ</li><li>クラー</li><li>マイクロ遠心チューブ</li><li>マイクロ遠心機</li><li>ゲル電気泳動の施設</li><li> シロイヌナズナコロンビア- 0植物</li><li> シロイヌナズナ Landsbergのエレクタの植物</li></ul>試薬<ul><li> 70％エタノール</li><li> 95％エタノール</li><li> 100％エタノール</li><li>ソルビトール0.3 Mおよび5mM MES - pHは5.7 </li><li>セチルトリメチルアンモニウムブロマイド（CTAB） </li><li> 100％エタノール</li><li> Cholorform </li><li>制限酵素</li><li> 3 M NaOHを</li><li> 6.3 M NaOHを</li><li> 6.24 M尿素/ 4 Mの亜硫酸水素ナトリウム</li><li>滅菌蒸留H 2 O </li><li> 10mMのヒドロキノン</li><li>ウィザードDNAクリーンアップシステム（プロメガ） </li><li> 10 M NH 4 OAC </li><li>で20μg/μLのtRNA </li><li> TEバッファー</li><li> TOPO TAクローニングキット（Invitrogen社） </li></ul>

のインプリント遺伝子のdnaメチル化の定量シロイヌナズナ胚乳

Determination of DNA Methylation of Imprinted Genes in Arabidopsis Endosperm

シロイヌナズナでは、エピジェネティックなメカニズムを研究するための優れたモデル生物である。理由の一つは、DNAメチルトランスフェラーゼの機能喪失型のヌル変異体であるため、ゲノムのDNAメチル化の消失は、成長と発展にどのように影響するかを研究するシステムを提供し、実行可能です。刷り込みは、母親と父親の対立遺伝子の差次的発現を意味し、哺乳類や植物の両方で再生開発において重要な役割を果たしている。 DNAメチル化はインプリント遺伝子の母性や父性の対立遺伝子が発現したり、沈黙されているかどうかを決定するための非常に重要です。顕花植物では、生殖における重複受精のイベントがあります：一つ精子細胞は、胚乳を生じさせるために、中央細胞と胚と第二精子のヒューズを形成するために卵細胞を受精。胚乳は、刷り込みが植物に発生した組織です。MEDEA、SETドメインポリコーム群遺伝子、及びFWA、開花を調節する転写因子は、胚乳およびそれらの発現にプリントにして表示された最初の2つの遺伝子であるにDNAメチル化と脱メチル化によって制御される植物。胚乳の遺伝子とメチル化パターンの刷り込みの状態を決定するために、我々は最初の胚乳を分離できるようにする必要があります。シードは、 シロイヌナズナの小さななので、それはシロイヌナズナ胚乳を分離し、そのメチル化を調べることが困難なままである。このビデオプロトコルでは、我々は、遺伝的交雑を実施するために種子から胚乳組織を分離するために、そして、重亜硫酸塩シークエンシングによりメチル化状態を判別する方法を報告する。

刷り込みは、植物と哺乳類の生殖の現象です。 DNAメチル化はインプリンティングのメカニズムに重要な役割を果たしている。胚乳を分離し、でインプリント遺伝子のメチル化状態を決定する<em&gt;シロイヌナズナ</em&gt;困難になる可能性があります。このプロトコルでは、我々は、胚乳を分離し、バイサルファイトシークエンシングによってメチル化を決定する方法について説明します。

のインプリント遺伝子のDNAメチル化の定量シロイヌナズナ胚乳

シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）は、エピジェネティックなメカニズムを研究するための優れたモデル生物です。その理由の一つに、DNAの機能喪失ヌル変異体の存在が挙げられます。

この手順の目的は、胚乳におけるゲノム印銘遺伝子のDNAメチル化状態を決定することです。まず、母系親の除雄を行い、その後、父系親の花粉を用いて受粉させることでこれを達成します。次に、他花受粉させた種子から胚乳を切り出します。手順の最終ステップは、胚乳DNAのバイサルファイトシーケンシングを行うことです。最終的に、異なるエコタイプにおけるDNAシーケンシング多型とバイサルファイトシーケンシングを通じて、インプリント遺伝子の母性または父性アレルにおけるDNAメチル化状態を示す結果を得ることができます。こんにちは。セントルイス大学生物学部のYang Shaw博士です。こんにちは。セントルイス大学生物学部、Dr.J研究室のMatthew Rayです。Dr.J研究室のDiman Panuです。今日は、ラグビーオフィサーの解剖を行い、sulf FARシーケンシングによってDNAメチル化状態を決定する手順をご紹介します。当研究室では、DNAメチル化および脱メチル化によって制御される遺伝子インプリンティングを研究するためにこの手順を用いています。それでは始めましょう。この手順を開始するために、DNA配列多型を用いて母方および父方の対立遺伝子を区別できるよう、雌親と雄親として2つの異なるArabidopsis ecotypeを選択します。ここでは、Columbia zeroを雌親、Landsberg Erectaを雄親としてそれぞれ選択します。若くて健全な個体を選択するように注意してください。解剖顕微鏡を用いて、雌親の除雄を行います。ステージ12の花を特定し、その上下にある花やLICを、台座の基部をハサミで切り取ることで除去します。ピンセットの先端基部を95% ethanolのビーカーに軽く浸し、滅菌します。これにより、ピンセットに付着している花粉を除去し、花粉を死滅させることができます。ピンセットを用いて花芽をそっと開き、4枚の萼片、4枚の花弁、および6本の雄しべを慎重に取り除き、雌しべだけを完全な状態で残します。この操作の間、心皮を傷つけないように注意してください。次のステップは、花粉親を選択し、授粉を行うことです。最適な花粉親は、花弁が柱頭に対して90度の角度に広がり、大量の花粉が飛散しているステージ14の開花個体です。花を基部と花柄のすぐ上の部分で掴むと、花が大きく開きます。準備した柱頭に葯で花粉を付着させてください。受粉後、柱頭は黄色の花粉で覆われ、顕微鏡下で容易に観察できます。植物の除雄したすべての雌しべへの受粉が完了したら、ジュエリータグを用いて交配個体としてラベルを付けてください。その際、日付および雌雄親植物の情報を記載してください。植物の近くの土壌に支柱を立てます。紐を使用して、蛍光を発する個体の茎を支柱に固定し、受粉させた雌しべをプラスチック袋で覆います。受粉後（DAP）7〜8日で、胚発生のmid to late torpedo stage（中〜後期魚雷型段階）に達し、種子の回収および解剖が可能になります。胚乳および胚を採取するため、受精後8日（eight DAP）のsalicを解剖顕微鏡下に置きます。ピンセットでEK P cellを固定し、別のピンセットの先端を用いて、2つの心皮が融合している縁の隙間をずらして開きます。BPSを用いて種子を1つ取り出し、ガラススライド上に置きます。次に、マイクロパイレットの端を小さく切り、胚をスライドさせて取り出します。切っていない側の端を絞って胚乳を押し出し、種皮から分離させます。続いて、胚と胚乳を別々のマイクロチューブに入れ、液体窒素に入れます。10～15個のCLICから十分な量の胚または胚乳が蓄積されるまでこれを繰り返します。その後、重亜硫酸塩処理を行うまで、チューブを-80 °Cのフリーザーで保存します。その後、TMAB（トリメチルアンモニウムブロミド）またはCTAB法を用いて、胚乳または胚のゲノムDNAを単離します。胚乳のゲノムDNAを単離した後、解析対象領域の外側を切断する制限酵素を用いて、全反応容量20 µLで100 ngのDNAを消化します。MEプロモーターの制限酵素としては、XhoI、EcoND1、PstIを使用します。DNAを5分間加熱することで、制限酵素を失活させます。次に、反応を氷上で停止させます。3 M 水酸化ナトリウムを全量の9分の1量（2.2 µL）加え、37 °Cで15分間インキュベートします。インキュベーション後、溶液を250 µL PCRチューブに移します。次に、6.24 M urea・4 M sodium metabisulfite溶液を作成します。7.5 gのureaを10 mLの滅菌蒸留水に溶解させ、溶液を加熱・攪拌しながら、1～2時間かけて7.6 gのsodium metabisulfiteをゆっくりと加えます。溶解後、調製したばかりの10 M sodium hydroxideを用いてpHを5に調整します。滅菌蒸留水を加えて最終容量を20 millilitersにする。この溶液208 microlitersを、変性させた胚乳ゲノムDNA 22.2 microlitersに加える。その後、調製したばかりの10 millimolar ハイドロキノン 12 microlitersをDNAに加える。PCRマシンを用い、55 °Cで15分間、次いで95 °Cで30秒間のサイクルを30回繰り返し、重亜硫酸塩処理を行います。次に、Promega社のWizard DNA Cleanup Systemを使用して、重亜硫酸塩処理後のDNAを脱塩します。製造元の指示に従い、脱塩後にカラムから回収されたTEの正確な量を測定してください。次に、最終濃度が0.3 Mとなるように6.3 Mの水酸化ナトリウムを加えます。混合物を37 °Cで15分間インキュベートします。インキュベーション後、最終濃度が3 Mとなるように10 M酢酸アンモニウムを加え、20 µg/µLのtRNAを2 µL、および100%エタノールを3量分加えます。サンプルを混合し、14,000 RPMで15分間遠心分離します。ペレットを70%ethanolで1回洗浄し、その後、短時間遠心分離して余分なethanolを除去します。最後に、スピードバックでペレットを5分間乾燥させ、25 µLのTE bufferに再懸濁します。ナトリウム-BI処置を施したDNAが、PCR解析に使用可能な状態になりました。4 kbのMadeaプロモーターをシーケンスするため、多くのプライマーセットを設計し、領域全体をカバーする14本のオーバーラップ断片を増幅させます。まず、上のストランドをシーケンスするためのフォワードプライマーの設計から始めてください。まず、プライマーに極端に長いヌクレオチドを含ませることなくアニーリング温度を高めるため、グアニン含有量の高い領域を選択します。次に、CGおよびCNGコンテキストにあるシトシンをウラシルに変更します。その後、その他のすべてのシトシンをチミンに変更します。リバースプライマーを設計する際は、シトシン含有量の高い領域を選択してください。CGおよびCNGコンテキストにおけるグアニンをプリンに置き換え、それ以外のグアニンはアデニンに置換します。下位ストランドを再度シーケンスするには、まずフォワードプライマーを設計することから始めてください。シトシンに富む領域を選択し、CGおよびCNGコンテキストにおけるグアニンをプリンに置換します。その他のグアニンはアデニンに置換してください。リバースプライマーを設計する際は、AINEに富む領域を選択してください。CGおよびCNGコンテキストのシトシンをパラジジンに変換し、残りのシトシンをチミンに変換します。プライマーを設計後、各PCR増幅のテンプレートとして、亜硫酸ナトリウム処理したDNAを2 µL使用してPCR反応液を調製します。PCR反応を行い、ゲル電気泳動で産物を分析して、フラグメントのサイズが正しいことを確認してください。次のゲルを作成します。PCR産物を精製し、Invitrogenのtopo TAクローニングベクターpCR 2.1にクローニングします。インサートとして個々のクローンのシーケンシングを行います。バイサルファイトシーケンシングの原理は、pH 5.0の高濃度亜硫酸ナトリウムによる加水分解的脱アミノ化により、非メチル化シトシンがウラシルに変換されることです。逆に、5-メチルシトシンは亜硫酸ナトリウムによって修飾されません。ウラシルはPCR産物中でチミンとして増幅されますが、メチル化シトシンはPCR増幅後もシトシンのままとなります。シーケンシング結果を得た後、PCR増幅に使用したストランド特異的テンプレートと比較します。テンプレート中のシトシン残基がシーケンシング結果でチミンとして読み取られた場合、そのシトシンはメチル化されていないことを示します。テンプレート中のシトシン残基がシーケンシング結果でもシトシンのままである場合は、そのシトシンがメチル化されていることを意味します。Columbia, g ClarusとRLDを交配させた胚乳のシーケンシングクローンにおける、MEAプロモーターの-500 bp領域内の5箇所のメチル化CPG部位における母系MEAアレルでメチル化状態が示されています。メチル化されたシトシンは黒い塗りつぶし円で、非メチル化シトシンは白い白抜き円で示されています。同様に、Columbia, GladysとRLDを交配させた胚の母系Madeaアレルのメチル化状態が示されています。以上で、胚乳の単離方法と、本手順における亜硫酸塩シーケンシングの実施方法について説明しました。プロトコルを正確に遵守することが重要です。以上で終了します。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りいたします。

determination-dna-methylation-imprinted-genes-arabidopsis

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

初期生活ストレスにDNAメチル化と遺伝子発現の変化を研究するために合理化されたワークフローが表示されます。新生児マウスと離散の脳組織の分離の母子分離から始めて、我々は同時に、その後の重亜硫酸塩シークエンシングおよびRT-PCR解析のための脳組織のパンチからDNAとRNAを単離するためのプロトコルを表します。...

脳の小、解剖学的に定義された領域からのDNAメチル化と遺伝子発現の最適化分析

我々は、より開発の初期段階で胚を単離するための効率的で簡単な方法を報告する...

から初期段階の胚の効率的かつ迅速な単離<em&gt;シロイヌナズナ</em&gt;種子

私たちは、 シロイヌナズナの種子から種皮寝具アッセイ（SCBA）を構築する手順を紹介します。 SCBAは、遺伝的およびin vitroで探索する強力なツールであることが示されたか休眠種子中の光の合図に応答して、胚乳を制御し種子の発芽。 SCBAは胚乳が胚の成長に影響を与えることが疑われるあらゆる状況下で適用可能な原則です。...

遺伝的に探索するために種皮寝具アッセイ<em&gt;体外</em&gt;どのように胚乳コントロール種子発芽<em&gt;シロイヌナズナ</em

私たちは、免疫染色、蛍光in situハイブリダイゼーション 、ホールマウントシロイヌナズナ胚珠の量的、高分解能イメージングに続いてDNA染色のためにここに効率的で信頼性の高いプロトコルを提供する。この方法は、正常なクロマチン修飾および核構造を分析するために使用した。...

ホールマウント胚珠内でのクロマチン修飾や核構造の定量的、単一細胞分析のための効率的な方法<em&gt;シロイヌナズナ</em

クロマチン免疫沈降は、DNAは、インビボでのシロイヌナズナのタンパク質の結合部位を同定するための強力な技術です。この手順は、クロマチン架橋および断片化、目的のタンパク質に対する選択的な抗体を用いた免疫沈降、および結合したDNAの定量PCR分析を含みます。私たちは、シロイヌナズナ植物用に最適化され、単純なChIPアッセイを説明します。...

シロイヌナズナタンパク質-DNA相互作用の同定のための免疫沈降アッセイクロマチン<em&gt;インビボ</em

このプロトコルでは、顕微鏡下で胚パターン形成の検査続く胚珠クリアランスを介してシロイヌナズナの胚発生を観察するためのメソッドについて説明します。...

シロイヌナズナの胚発生の特性評価法

新たに発見された 5-メチルシトシン (oxi mCs), 5-ヒドロキシメチルシトシン (5hmC), 5-formylcytosine (5 fC) の酸化フォームと 5-carboxylcytosine (5caC) は、独自の機能的役割の異なる DNA 変更を表す場合があります。ここの可視化から oxi mCs...

DNA 変更染色: 共焦点画像の数値解析

メチル化されたRNA免疫沈降アッセイは、メチル化RNAフラグメントを濃縮するために使用される抗体ベースの方法です。深いシーケンシングと結合して、それはm5C修飾を運ぶ転写物の同定をもたらす。...

シロイヌナズナのm5C修飾を研究するメチル化RNA免疫沈降アッセイ

本研究では、マイクロアレイ技術によって得られたDNAメチル化データを管理するワークフローについて説明する。このプロトコルは、サンプル調製からデータ分析までの手順を示しています。すべての手順が詳細に説明されており、ビデオは重要な手順を示しています。...

DNAメチル化のバイオインフォマティクス分析へのサンプル調製:肥満および関連形質研究の関連戦略

このプロトコルは、 シロイヌナズ...

発育中および成熟 シロイヌナズ ナ種子中の胚乳細胞層の顕微鏡分析のための無傷組織の調製

学ぶ、シロイヌナズナ胚乳のインプリント遺伝子におけるDNAメチル化状態の定量法。バイサルファイトシーケンスを用いて、親由来アレルのメチル化パターンを解析し、植物のゲノムインプリンティング機構を解明する。

のインプリント遺伝子のDNAメチル化の定量シロイヌナズナ胚乳

さらに動画を探す