Name: の生産 C.エレガンストランスジーン galK選択可能なマーカー (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-01-11T23:58:00.000+00:00
Duration: 12 min 3 s
Description: 学ぼう、Caenorhabditis elegansにおけるトランスジェン産生法を。SMIDライブラリクローン由来のゲノムDNAを用い、lambda red再組み換えとGAL K選択可能マーカーにより、ネイティブ制御要素を保持した遺伝子改変を実現する効率的な手法です。

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著者は、技術の開発の手助けのためにリンジーナッシュに感謝します。この作品は、ALF、ピッツバーグ大学からピッツバーグOAIC（AG024827）、およびシード資金の大学からのパイロットプロジェクトの助成にNIHの助成金AG028977によって賄われていた。

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<li>Zhang, Y., Nash, L., Fisher, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simplified%2C+robust%2C+and+streamlined+procedure+for+the+production+of+C.+elegans+transgenes+via+recombineering%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">A simplified, robust, and streamlined procedure for the production of C. elegans transgenes via recombineering.</a> BMC Dev Biol. 8, 119-119 (2008).</li>
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<li>Snow, M. I., Larsen, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+expression+of+daf-12%3A+a+nuclear+hormone+receptor+with+three+isoforms+that+are+involved+in+development+and+aging+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Structure and expression of daf-12: a nuclear hormone receptor with three isoforms that are involved in development and aging in Caenorhabditis elegans.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1494, 104-116 (2000).</li>
<li>Fisher, A. L., Page, K. E., Lithgow, G. J., Nash, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Caenorhabditis+elegans+K10C2.4+Gene+Encodes+a+Member+of+the+Fumarylacetoacetate+Hydrolase+Family.+A+CAENORHABDITIS+ELEGANS+MODEL+OF+TYPE+I+TYROSINEMIA%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol.Chem%22%5BJournal%5D)">The Caenorhabditis elegans K10C2.4 Gene Encodes a Member of the Fumarylacetoacetate Hydrolase Family. A CAENORHABDITIS ELEGANS MODEL OF TYPE I TYROSINEMIA.</a> J Biol.Chem. 283, 9127-9135 (2008).</li>
<li>Wightman, B., Ha, I., Ruvkun, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Posttranscriptional+regulation+of+the+heterochronic+gene+lin-14+by+lin-4+mediates+temporal+pattern+formation+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Posttranscriptional regulation of the heterochronic gene lin-14 by lin-4 mediates temporal pattern formation in C. elegans.</a> Cell. 75, 855-862 (1993).</li>
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<li>Tursun, B., Cochella, L., Carrera, I., Hobert, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+toolkit+and+robust+pipeline+for+the+generation+of+fosmid-based+reporter+genes+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A toolkit and robust pipeline for the generation of fosmid-based reporter genes in C. elegans.</a> PLoS One. 4, e4625-e4625 (2009).</li>
<li>Bamps, S., Hope, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+gene+expression+pattern+analysis%2C+in+situ%2C+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Brief.+Funct.+Genomic.+Proteomic%22%5BJournal%5D)">Large-scale gene expression pattern analysis, in situ, in Caenorhabditis elegans.</a> Brief. Funct. Genomic. Proteomic. , (2008).</li>
<li>Dolphin, C. T., Hope, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caenorhabditis+elegans+reporter+fusion+genes+generated+by+seamless+modification+of+large+genomic+DNA+clones%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Caenorhabditis elegans reporter fusion genes generated by seamless modification of large genomic DNA clones.</a> Nucleic Acids Res. 34, e72-e72 (2006).</li>
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<li>Yang, X. W., Model, P., Heintz, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homologous+recombination+based+modification+in+Escherichia+coli+and+germline+transmission+in+transgenic+mice+of+a+bacterial+artificial+chromosome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Homologous recombination based modification in Escherichia coli and germline transmission in transgenic mice of a bacterial artificial chromosome.</a> Nat Biotechnol. 15, 859-865 (1997).</li>
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<li>Westenberg, M., Bamps, S., Soedling, H., Hope, I. A., Dolphin, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Escherichia+coli+MW005%3A+lambda+Red-mediated+recombineering+and+copy-number+induction+of+oriV-equipped+constructs+in+a+single+host%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Escherichia coli MW005: lambda Red-mediated recombineering and copy-number induction of oriV-equipped constructs in a single host.</a> BMC Biotechnol. 10, 27-27 (2010).</li>
<li>Warming, S., Costantino, N., Court, D. L., Jenkins, N. A., Copeland, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+and+highly+efficient+BAC+recombineering+using+galK+selection%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Simple and highly efficient BAC recombineering using galK selection.</a> Nucleic Acids Res. 33, e36-e36 (2005).</li>
<li>Penfold, R. J., Pemberton, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+suicide+vector+for+construction+of+chromosomal+insertion+mutations+in+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">An improved suicide vector for construction of chromosomal insertion mutations in bacteria.</a> Gene. 118, 145-146 (1992).</li>
<li>Praitis, V., Casey, E., Collar, D., Austin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Creation+of+low-copy+integrated+transgenic+lines+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Creation of low-copy integrated transgenic lines in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 157, 1217-1226 (2001).</li>
<li>Puig, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tandem+affinity+purification+%28TAP%29+method%3A+a+general+procedure+of+protein+complex+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">The tandem affinity purification (TAP) method: a general procedure of protein complex purification.</a> Methods. 24, 218-229 (2001).</li>
<li>Rigaut, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+generic+protein+purification+method+for+protein+complex+characterization+and+proteome+exploration%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A generic protein purification method for protein complex characterization and proteome exploration.</a> Nat.Biotechnol. 17, 1030-1032 (1999).</li>
<li>Achilleos, A., Wehman, A. M., Nance, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PAR-3+mediates+the+initial+clustering+and+apical+localization+of+junction+and+polarity+proteins+during+C.+elegans+intestinal+epithelial+cell+polarization%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">PAR-3 mediates the initial clustering and apical localization of junction and polarity proteins during C. elegans intestinal epithelial cell polarization.</a> Development. 137, 1833-1842 (2010).</li>
<li>Maduro, M., Pilgrim, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+cloning+of+unc-119%2C+a+gene+expressed+in+the+Caenorhabditis+elegans+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Identification and cloning of unc-119, a gene expressed in the Caenorhabditis elegans nervous system.</a> Genetics. 141, 977-988 (1995).</li>
</ol>

利害の衝突は宣言されません。

fosmidsから導入遺伝子の世代は、ネイティブなプロモーターエレメント、スプライシング変異体、および3&#39;UTR調節要素のすべてを保持することの利点を提供しています。これは、ネイティブの発現パターン、または他のアプローチは5失敗した機能的な導入遺伝子の構造をより反映し、導入遺伝子の構築につながることができます。その結果導入遺伝子は、GFPまたはTAPのタグを含むエピトープタグの様々を運ぶことができます。 導入遺伝子の構造は、すべてのSW106細菌の染色15で実施される3つの手順を関与。最初に、galKの遺伝子は、標的のフォスミドと相補的な相同性ア ​​ームに挟まれたPCR産物運ぶgalKでrecombineeringを介して変更するフォスミドで目的のサイトに統合されています。我々が開発した改良は、FLAG - GFP或いはFosmid変更の第1及び第2段階で使用されるとオリゴのコストを下げることにオリゴの単 ​​一のセットを可能にgalKカセットにTAPタグのいずれかの相同性...

<table><tbody><tr><td>FosmidMAX kit</td><td>Epicentre Biotechnologies</td><td>FMAX046</td><td></td></tr><tr><td>GoTaq</td><td>Promega Corp.</td><td>M7122</td><td></td></tr><tr><td>MOPS培地</td><td>TEKnova, Inc.</td><td>M2120</td><td></td></tr><tr><td>0.132 M リン酸カリウム溶液</td><td>TEKnova, Inc.</td><td>M2102</td><td></td></tr><tr><td>D-ガラクトース</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G0750</td><td></td></tr><tr><td>2-デオキシガラクトース</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4407</td><td></td></tr><tr><td>ビオチン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B4639</td><td></td></tr><tr><td>ロイシン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L8000</td><td></td></tr><tr><td>NH&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;Cl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9434</td><td></td></tr><tr><td>Phusion DNAポリメラーゼ</td><td>New England Biolabs</td><td>F-530S</td><td></td></tr><tr><td>マッコンキー寒天培地ベース</td><td>BD Biosciences</td><td>281810</td><td></td></tr><tr><td>アラビノース</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3131</td><td></td></tr><tr><td>クロラムフェニコール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1919</td><td></td></tr><tr><td>リン酸二ナトリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5136</td><td></td></tr><tr><td>リン酸一カリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5655</td><td></td></tr><tr><td>塩化ナトリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5886</td><td></td></tr><tr><td>グリセロール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G2025</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Agar</td><td>BD Biosciences</td><td>214010</td><td></td></tr></tbody></table>

の生産 c.エレガンス</emとrecombineering経由>トランスジーン galk選択可能なマーカー

The Production of C. elegans Transgenes via Recombineering with the galK Selectable Marker

トランスジェニック動物の作成 ​​が広く、Cで利用されている興味またはタンデムアフィニティー精製の ​​世代の遺伝子の調節と発現パターンを研究するためにGFPの融合タンパク質の使用を含む線虫の研究（TAP）その精製を容易にするために特定の遺伝子のタグ付きバージョン。一般的に導入遺伝子はGFPレポーター遺伝子または目的のcDNAの上流にプロモーターを配置することで生成され、これはしばしば代表的発現パターンを生成します。しかし、このような3&#39;非翻訳領域または別のプロモーターの制御要素として遺伝子調節の重要な要素は、このアプローチによって検出し損ねる可能性がある。さらに、単一のスプライスバリアントは、通常はこの方法で研究することができる。対照的に、フォスミドDNAクローンによって運ばの使用ワームのゲノムDNAは、おそらくほとんどの場合ではない本物の発現パターンとタイミングをキャプチャする大きな能力を許可する生体内で遺伝子の調節に関与するすべての要素が含まれています。フォスミドDNAを用いて導入遺伝子の生成を容易にするために、我々はE.を説明大腸菌は遺伝子の任意の場所にGFP、TAP -タグ、または興味の他の配列を挿入するrecombineering手順をベースに。手順は、高効率で目的の変更を取得、その結果recombineeringで正と負の選択の手順の両方のための選択マーカーとしてgalK遺伝子を使用しています。さらに、一般的に使用されるGFPとTAPの融合遺伝子に相同性ア ​​ームに挟まれたgalKの遺伝子を含むプラスミドは、GFPまたはTAP融合タンパク質を生成する際に50％のオリゴのコストを減少する可能です。これらのプラスミドは、豊富なPCR産物の精製の必要性を排除R6Kの複製起点を使います。最後に、我々はまた、フォスミドを直接注入またはトランスジェニック動物を生成するためにワームに砲撃できるようにするフォスミドバックボーンへのUNC - 119マーカーを統合する手法を示す。このビデオでは、このメソッドを使用してrecombineeringを経由して導入遺伝子の生成に関わる手順を示しています。

のために導入遺伝子を産生する能力<em&gt;線虫（Caenorhabditis elegans）</em&gt;ネイティブ調節要素のすべてが保持されるようにfosmidsによって運ばれるゲノムDNAを使うことが特に魅力的です。説明でrecombineering経由導入遺伝子の生産のためのシンプルで堅牢な手続きです。<em&gt; galK</em&gt;選択可能なマーカー。

の生産 C.エレガンス</emとRecombineering経由>トランスジーン galK選択可能なマーカー

トランスジェニック動物の作製は、GFP融合タンパク質を用いて制御を研究するなど、C. elegansの研究において広く活用されています。

本実験の全般的な目的は、SMIDライブラリークローンに含まれる線虫ゲノムDNAを用いてトランスジェネシスを行うことです。ゲノムDNAを使用することで、3' UTR領域のエンハンサーなどのすべての天然の制御エレメントを保持することができます。これは、FO smidをSW 1 0 6 E. coli株に導入し、誘導可能なλ-red組み換え機構を利用することで達成されます。第2段階として、GAL K遺伝子をFO smidの目的の位置に挿入し、ここにGFPまたはtapタグを配置する部位を標識します。次に、相同組換えによりGade遺伝子をGFPまたはtap TACに置換し、続いてデオキシガラクトースを用いたネガティブセレクションを行い、改変導入遺伝子を作成します。コロニーPCRによるT挿入の確認により、これらの導入遺伝子を迅速かつ確実に作成できるという結果が得られています。こんにちは、Love Shipです。ピッツバーグ大学のFisher研究室に所属しています。本日は、C. elegansのトランスジェニック系統を作製する手法について実演します。GKを選択マーカーとして組み換える理由について説明します。Coganトランスジェニックを作成する既存の手法と比較して、本手法の主な利点は、目的遺伝子のゲノムDNAを使用することです。これにより、従来の標準的なクローニングベースのアプローチでは見落とされる可能性のある、3' UTR領域の制御エレメント、選択的スプライシング転写物、代替プロモーター、および遠位エンハンサーなど、遺伝子調節のあらゆる重要な要素を網羅することができます。それでは、始めていきましょう。WormBaseをガイドとして、遺伝子サービスから目的遺伝子（GOI）のFO smidクローンを注文します。クローンの選択にあたっては、配列の中央にGOIが位置するものを選びます。隣接する遺伝子を含まないクローンが好ましい場合もありますが、培養株を見つけるのが難しいことがあります。12.5 µg/mLのクロラムフェニコールを含むLB培地で、GOIのSMIDクローンを培養します。SMIDはEPI 300株に導入されており、37 °Cで生育可能です。次に、SMIDを1.5 mLの量で37 °Cで一晩培養し、SMID DNAのミニプレップを行います。Epicenter SMID prep kitを使用し、指示書に記載されている、より早い段階でRibo shorter mixを添加する代替プロトコルに従います。その後、FOSS DNA濃度を測定します。分光光度計を用いた測定では、通常、値は非常に低くなりますが、電撃法を成功させるには十分です。14 mLのスナップキャップチューブを用い、LB培地にて32 °Cで5 mLのオーバーナイト培養を行い、10⁶個の電撃コンピテントSW細胞を調

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生物学

このビデオでは、トランスジェニック動物を作成するために線虫の生殖巣にマイクロインジェクションのテクニックを示しています。...

マイクロインジェクションを使用して安定したトランスジェニック線虫の世代

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トランスジェニックの世代 C.エレガンスバイオリスティック変換による

我々は、タンパク質の発現と局在の後胚レギュレータを識別するための増感方法について説明します。...

の後胚表現型を識別するためのRNAiスクリーニング C.エレガンス</em

体系的、大規模合成遺伝子（遺伝子遺伝子またはエピスタシス）対話画面が遺伝的冗長性と経路のクロストークを探索するために使用することができます。ここで、我々は上位性の関係を解明するとの遺伝的相互作用ネットワークを探索するために開発されeSGAと呼ばれるハイスループット定量合成遺伝子配列のスクリーニング技術を記述...

細菌機能ネットワークとPathwaysでのマッピング<em&gt;大腸菌</em&gt;合成遺伝子配列を用いて

このプロトコルは、紫外線(UV)照射を使用して、トランスジェニック染色体外アレイを線虫ゲノムに組み込むための迅速かつ低材料消費の手順を説明しています。さらに、このプロトコールは、染色体外アレイを高速で伝達するトランスジェニックラインに特に適しています。...

C.エレガンスゲノムへの高透過率の染色体外アレイを組み込むための迅速なプロトコール

タンパク質は、多くの場合、異なる細胞機能を発揮することができ、複数のドメインを含みます。遺伝子ノックアウト（KO）は、この機能的多様性を考慮していません。ここでは、様々な機能ドメインまたはタンパク質の変異体の分子解剖を可能KO胚性幹細胞における組み換え媒介カセット交換（RMCE）ベースの構造と機能のアプローチを報告しています。...

リコンビナーゼ媒介カセット交換を用いて、マウス胚性幹細胞における構造と機能の研究

ここでは、CRISPR Cas9 ribonucleoproteins と相同性依存修理テンプレートを使用して線虫のゲノム エンジニア...

迅速かつ安易なパイプラインを生成する突然変異点ゲノムにc. の elegansを用いた CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

ここで説明する、フラミジア・トラコマティスにおける標的化されたマーカーレス遺伝子欠失の方法であり、フロキサセット対立遺伝子交換変異誘発、FLAEMを用いた。...

クラミジア・トラコマティスにおけるフロキセカセットアレリック交換変異誘発によるマーカーレス遺伝子欠失

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解離性とC. elegansの神経筋接合部から録音する

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