の生産 C.エレガンストランスジーン galK選択可能なマーカー

本実験の全体的な目的は、SMIDライブラリクローンに含まれる線虫ゲノムDNAを用いてトランスジェンを作製することです。ゲノムDNAを使用することで、3' UTR領域のエンハンサーなどのすべての天然の制御エレメントを保持できます。これは、誘導性λ-Red組み換え機構を利用するために、FO smidをSW 106 E. coli株に導入することによって達成されます。

第二のステップとして、GAL K遺伝子をFO smidの目的の位置に挿入し、GFPまたはtapタグを配置する部位を標識します。次に、相同組み換えによりGade遺伝子をGFPまたはtap TACに置換し、続いてデオキシガラクトースを用いたネガティブセレクションを行い、改変トランスジェンを作製します。コロニーPCRによる挿入の確認の結果、これらのトランスジェンを迅速かつ正常に作製できることが示されました。

こんにちは。ピッツバーグ大学のFisher研究室で研究しております、Love Shipです。本日は、C. elegansのトランスジェニック系統の作製方法について実演します。

選択マーカーとしてGKを用いて組み換えを行う理由について説明します。Coganトランスジェニックを作成する既存の手法に対する本手法の主な利点は、目的遺伝子のゲノムDNAを使用することです。これにより、従来の標準的なクローニングベースの手法では見落とされる可能性がある、3' UTR領域の制御要素、選択的スプライシング転写産物、代替プロモーター、および遠位エンハンサーなどの遺伝子調節におけるすべての重要な要素を網羅することができます。それでは、始めていきましょう。

WormBaseをガイドとして、遺伝子サービスから目的遺伝子（GOI）のFO smidクローンを注文します。クローンの選択にあたっては、配列の中心にGOIが位置しているものを選びます。近接する遺伝子を含まないクローンが好ましい場合もありますが、そのような培養株を見つけるのは困難な場合があります。

12.5 µg/mLのクロラムフェニコールを含むLB培地で、GOIのSMIDクローンを培養します。SMIDはEPI 300株に導入されており、37 °Cで増殖可能です。次に、SMIDの1.5 mLオーバーナイト培養を37 °Cで行い、SMID DNAをミニプレップします。Epicenter SMID prep kitを使用し、指示書に記載されているRibo shorter mixをより早い段階で添加する代替プロトコルに従います。その後、FOSS DNA濃度を決定します。

分光光度計を使用する場合、吸光度は通常非常に低いですが、十分な値が得られます。エレクトロポレーションを成功させるために、14 mLスナップキャップチューブを用い、LB培地で32 °Cで一晩培養して、5 mLのSW 106細胞の電気穿孔能細胞（エレクトロコンピテントセル）を調製します。

翌朝、2Lのフラスコに入れた100mLのLB培地に、培養液を1mL接種します。SW 1 0 6細菌を、OD 600が0.6から0.8になるまで培養します。

ヒートショックは行わない。5,000 Gsで5分間遠心分離し、細胞をペレット化する。氷冷した10% glycerol 1 mLの中で、穏やかにボルテックスしてペレットを再懸濁する。

次に、氷冷した10% glycerolを50 milliliters加えます。この洗浄ステップをもう一度繰り返します。最後に、再び遠心分離してSW 1 0 6をペレット化し、各上澄み液のうち約500 microlitersを残してすべて除去し、再懸濁します。

ペレットを穏やかなボルテックスで懸濁し、100 µL分注したものを液体窒素またはドライアイスで凍結し、形質転換まで-80 °Cで保存します。0.1 cmギャップキュベットを用い、EOR 2510エレクトロポレーターで1,350 Vにて、約50 ngのfos DNAを電撃的に導入し、電気穿孔能を持つSW106細胞にfos DNAを形質転換させます。1 mLのLB培地中で32 °C、1時間、細菌を回復させ、クロラムフェニコール containing LBプレートに塗抹し、32 °Cで一晩培養します。

12.5 µg/mLのクロラムフェニコールを含むLB培地を用い、32 °Cで5 mLの overnight培養を行い、コロニーPCRによって目的遺伝子の存在を確認します。次に、0.5 µLの培養液を、隣接するオリゴヌクレオチドを用いた標準的なPCR反応液に加え、反応前の細菌を溶解させるため、95 °Cの初期インキュベーション時間を5分に延長します。最後に、目的遺伝子を保持するFO smidにgal K遺伝子を挿入するため、長期保存用のグリセロールストックを作製します。

まず、0.2%ガラクトースを含むMOPS最小培地プレートを調製します。レシピについては、本プロトコルの記述部分を参照してください。次に、P mod four gal, k, g または P mod four gal K GT カセットをPCR増幅します。

FusionまたはGo Taqゲルを使用します。得られたPCR産物を精製します。ゲルの確認またはNanoDrop分光光度計を用いて、収量を定量します。

PCR産物は、使用するまで4 °Cで保存します。SW 106細胞（Foss DNA含有）を5 mLのクロラムフェニコール含有LB培地に接種し、32 °Cで一晩培養します。一晩培養した培養液1 mLを、100 mLのクロラムフェニコール含有LB培地に加えます。2 Lのフラスコを用い、ODが0.6〜0.8になるまで培養します。

通常、培養の成長には3～4時間かかります。ホルダーに滅菌済みの250 milliliterフラスコをセットし、シェーキングウォーターバスを42 °Cに設定して予熱しておきます。高効率を得るためには、次のステップでシェーキングウォーターバスを使用することが極めて重要です。

次に、SW 1 0 6 培養液 50 milliliters を 250 milliliter フラスコに移し、シェーキングウォーターバスを用いて 42 degrees Celsius、100 RPM で正確に 20 分間ヒートショックを行います。残りの細菌は 32 degrees Celsius で保持し、非誘導コントロールとして使用します。誘導した細菌と非誘導の細菌を氷上で 10 分間冷却します。

サンプルを2本の滅菌遠心チューブに移し、約5,000 Gsで5分間遠心してペレット化します。上清をすべて捨て、穏やかにボルテックスして、ペレットを1 mLの氷冷10%グリセロールで再懸濁させます。さらに49 mLの氷冷10%グリセロールを加えます。

この洗浄を繰り返し、もう一度遠心してペレット化します。チューブを倒して上清を除去し、残った少量の液体でペレットを再懸濁して、100 µLのサンプルに分注します。ドライアイスで凍結し、−80 °Cで翌日まで保存します。

1,350 Vに設定したInvitrogen 25 tonエレクトロポレーターを用い、0.1 cmギャップキュベットを使用して、誘導および非誘導SW 1 0 6細胞に150 ngの調製済みPCR産物をエレクトロポレーションします。14 mLファルコンチューブに入れた1 mLのLBで細菌を回収します。

細菌を13,200 RPMで15秒間遠心分離してペレットとし、M9培地で再懸濁させた後、32 °Cで4時間30分間インキュベートします。組成については、本プロトコルの記述部分を参照してください。この洗浄工程を2回繰り返します。

富栄養培地を除去するため、細胞をもう一度遠心してペレット化し、1 mLのM9最小培地に再懸濁してから、MOPS最小培地上の連続希釈平板に播種します。インキュベーター内で32 °Cで3〜5日間培養します。真の陽性株は増殖が遅いため、忍耐強く待ちます。コロニーをMaconアガーにストリークしてコロニーを精製し、GLK陽性であることを確認してください。

コロニーは鮮やかなピンク色に変わるはずです。単一のコロニーをピックアップし、5 mLのlbおよびクロラムフェニコールを含む培地に接種し、32 °Cで一晩培養します。隣接するオリゴを用いてPCRを行い、galカセットが正しい位置に挿入されていることを確認してください。

本プロトコルの解説部分にある表1を参照してください。オリゴヌクレオチド配列については、標準的なPCR反応液に0.5 µLの培養液を加え、細菌を溶菌させるために最初の95 °Cでのインキュベーション時間を5分に延長してください。GAL K遺伝子の存在により、PCR産物のサイズはシフトして大きくなるはずです。

最後に、保存用のグリセロールストックを調製します。0.2% 2-deoxy-D-galactose（DOG）および 0.2% glycerol を含む MOPS 最小培地プレートを調製します。レシピについては、本プロトコルの書面部分を参照してください。PCR。

第1ラウンドで使用したものと同じオリゴ、または、より短いGFPまたはtap特異的オリゴを用いて、PMO 4G FP PBS 1761またはPBS 1479からタグ断片を増幅します。複数のコンストラクトを作成する場合、同一のPCR産物をすべてのコンストラクトに使用できるため、短いオリゴを使用することが特に有用です。PCR産物をゲル精製し、ゲルまたは分光光度計で濃度を測定します。前述の方法に従い、Gale K遺伝子を含むSMIDを保持する、誘導および非誘導のコンピテントW 1 0 6細胞を調製します。0.1 cmギャップのキュベットを用い、1,350 Vに設定したEINOR 25 10 アトレーターを使用して、誘導および非誘導のSW 1 0 6細胞に約100 ngのPCR産物を電気穿孔します。

14 mLのスナップキャップチューブ内で1 mLのLVを用いて回復させ、32 °Cのシェーカーで4時間30分間インキュベートします。前述のように、M9で細胞を洗浄し希釈します。0.2% DOGおよび0.2% Glycerolを含むMOPS最小培地に細菌をプレートし、32 °Cで3日間インキュベートして、挿入の有無を確認します。

4つのコロニーを用いて、12.5 µg/mLのクロラムフェニコールを含むLB培地5 mLで一晩培養します。前述の手順に従ってコロニーPCRを行います。正しいインサートと正しい部位であることを確認するため、GFPタップ特異的な短鎖オリゴヌクレオチドと、その隣接領域を挟むオリゴヌクレオチドの両方を使用します。

GFPは約800 bpです。TAPは約550 bpで、gal KTは1.4 kbです。最後に、長期保存用のグリセロールストックを調製します。

リコンバイニングによるFO smedの改変は堅牢な結果をもたらし、ネガティブセレクションステップにおいて通常90%以上の成功率が観察されます。さらに、本プロトコルは完了まで約2週間で済むため、トランスジェンの調製をかなり迅速に行うことができます。DOGプレート上で同定された48個のコロニーをflag GFPオリゴを用いてコロニーPCRに供したところ、本実験ではGFPインサートが増幅されました。48個のコロニーのうち47個が正しく、1個のコロニーは正しく改変されていませんでした。DOGプレート上で同定された48個のコロニーをflag GFPオリゴを用いてコロニーPCRに供し、本実験においてGFPインサートが増幅された結果を示しています。

48個のコロニーのうち46個が正しく、2個のコロニーは正しく修飾されていません。この実験を行う際に最も留意すべき点は、SW 1 0 6菌を32 °Cで培養し、より高い温度で培養しないことです。なぜなら、高温での培養はLambda red機構を損なう変異を持つ変異体を選択してしまうためです。それでは、実験の成功をお祈りします。