Name: アイソレーションと試験管内で活性化線虫（Caenorhabditis elegans）精子 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-01-31T19:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 46 s
Description: 学ぶ線虫Caenorhabditis elegansの精子アイソレーションと試験管内活性化法。プロテアーゼ処理によるスペルマチッド活性化と顕微鏡観察で精子形態を可視化し、生殖生物学研究への応用を示します。

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我々は、サミュエルウォードに感謝、ダイアンC.はこの手法を開拓するためシェイクスとグレゴリーネルソン。我々は、活性化精子を示すビデオをパヴァーヌKadandaleとブライアンGeldzilerに感謝、有用な議論のためのシンソンの研究室のメンバーは、CGC株とNIHの助成金（R01HD054681）を通じて私たちをサポートするために。

男性人口の1）濃縮<ol><li>実験的な必要性に応じて、男性の多数は、次のいずれかの方法を用いることにより得ることができます。 <ol><li>野生型の雄の大規模な人口は、NGMプレートの中央にOP50シードの小さな芝生の5野生型の男性と1雌雄同体を横断することによって得ることができる。後続世代の約50％が野生型の男性になります。 </li><li> 彼- 5（e1490）または彼- 8（e1489）雌雄同体は彼- 5。男性の多数を投げると彼- 8男性は肥沃であり、精子の形態と機能には明らかな欠陥はありません。そう、 彼- 5または彼- 8の男性は、多くの実験のために野生型の男性の代わりに使用することができます。 </li></ol></li></ol>男性の2）の同定と分離<ol><li>ワームの尾の形態を調べ、男性、ワームの尻尾は丸められます。 </li><li> L4ステージの男性を選んで、E.を接種したNGMプレートに移す大腸菌 OP50と、それらが一日か二日のために成長しましょう。雌雄同体の存在下で成長している独身男性は精子の損失を防ぐため、精子の数が多いが、実験手順の実行中に利用できるようになる。 </li><li>解剖の日に、細菌なしでNGMプレートに上の独身男性を転送し、それらを数分間クロールができます。このステップでは、E.の小さい層を除去するのに役立ちます大腸菌は、ワームの表面に付着。また、バッファに時計のガラスと転送雄ではM9バッファー（1リットル当たり6グラムのNa 2 HPO 4、3G KH 2 PO 4、5グラムのNaCl、0.25グラムのMgSO 4 · 7H 2 O）のピペット少量。 </li></ol> 3）男性とin vitroでの活性化の解剖は、 <ol><li>スライドガラスを取り出し、PAPのペンを使って小さな円をマーク。ピペット1X精子中期の30〜50μL（50mmのHEPES、25mMのKClを、45ミリのNaCl、1mMのMgSO 4を用い 、5mMの塩化カルシウム、10mMのブドウ糖、pH7.8）中の円内。疎水性の円は、その境界内の精子の培地を維持するのに役立ちます。 </li><li>精子の培地に5-10人の男性を転送します。 </li><li>顕微鏡下でスライドを表示して、あなたの手の両方で27ゲージの針を取り付けた2つのシリンジを保持する。 </li><li>ワームを"ホールド"と精子を放出する男性の後端をカットするために他の針を使用するもの針を使用してください。 </li><li>ワームをカットすると、通常は瞬時に精子細胞の膨大な数を排出。精子細胞は、実体顕微鏡下で分"顆粒"として表示されます。しかし、時には一部または精子細胞のほとんどは、死体の中に保持されることがあります。その場合には、静かにスライドガラス上の死体"をドラッグすると、"死体からの精子の放出を容易にすることができる。 </li><li>精子細胞を有効にするには、プロナーゼE（20μg/ml）を含む1X精子のミディアムでワームを細かく分析し、それらを5分間放置します。 </li><li>スライドは、実験の任意の時点でドライになるようにしてください。必要に応じてより多くの1X精子のミディアムを追加。 </li></ol> 4）spermtidsと精子の可視化<ol><li>優しく解剖試料の表面にカバースリップを配置。 </li><li>低倍率（10倍）下で精子のフィールドを見つける</li><li>通常100X油浸で - 精子または精子の細部がより高い倍率に移動して観察することができます。 </li></ol> 5）代表者の結果男性の線虫から単離された精子のDIC画像の例を図1に示されています。精子は球形で、核が顕著である。 試験管内活性化の精子では 、図2に示す。 <img src="/files/ftp_upload/2336/2336fig1.jpg" alt="図1"> 図1℃のDIC画像線虫の精子。 <img src="/files/ftp_upload/2336/2336fig2.jpg" alt="図2"> 図2。 試験管内活性化C言語でのDIC画像elegansは精子。

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</ol>

利害の衝突は宣言されません。

SPE変異体を分析することに加えて、このプロトコルは、加齢に伴う精子の形態を分析するなど、他の重要なアプリケーションを、持っています。このプロトコルを使用して単離した精子と精子は野生型と変異体精子8、9、スライド10、生理学的測定9、11、あるいは人工授精12日の精子の運動性の免疫染色、などの他の下流の実験に使用することができます。

<table><tbody><tr><td>ツベルクリン注射器</td><td>BD Biosciences</td><td>309623</td><td>シリンジ：1 ml、針：&lt;br/&gt;27G X &amp;#189; in</td></tr><tr><td>Papペン</td><td>Zymed Laboratories, Inc.</td><td>00-8888</td><td></td></tr><tr><td>VWR VistaVision HistoBond 顕微鏡スライドグラス</td><td>VWR international</td><td>16004-406</td><td>サイズ：&lt;br/&gt;75X25X1mm</td></tr><tr><td>カバーガラス</td><td>VWR international</td><td>48366045</td><td></td></tr><tr><td>プロテアーゼ</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-6911</td><td></td></tr></tbody></table>

アイソレーションと試験管内で</emの>活性化線虫（caenorhabditis elegans）精子

Isolation and In vitro Activation of Caenorhabditis elegans Sperm

男性と雌雄同体の線虫 C. elegansの2つの自然に存在性的なフォームです。アメーバ精子は、男性と雌雄同体の両方で生産されています。約300 - - 配偶子形成の初期段階では、雌雄同体の生殖細胞は精子の数が限らへと分化し、貯精嚢と呼ばれる小さな&quot;袋&quot;に格納されています。その後、雌雄同体は、継続的に卵母細胞 1を生成する。対照的に、男性は自分の成人期を通じて独占的に精子生成。男性はそれが典型的な大人のワーム2の全細胞の&gt; 50％を占めていることそんなに精子を生成する。したがって、男性から精子を分離する雌雄同体のものと比べて簡単です。 男性のわずかな割合は、自然にX染色体3の自発的な非分離のために生成されます。より便利に、男性またはで雌雄同体を横断、彼を生じさせる変異の導入（男性の発生率が高い）表現型は1つが男性の人口3を豊かにできるような戦略の一部です。 男性は、簡単に尾の形態4を観察することにより、雌雄同体と区別することができる。雄の尾部が嵌合構造で丸められるのに対し、両性具有の尾は、指摘されている。 テールをカットすると、雄の生殖器官の内部に格納されて精子細胞の膨大な数を解放します。解剖は、27ゲージの針を使用して実体顕微鏡下で行われる。精子細胞が物理的に他のセルと接続されていないので、油圧は精子2を含む男性の体の内部の内容を、排出します。 男性は、直接&quot;精子の中&quot;の小滴に解剖されています。精子は、pHの変化に敏感です。したがって、HEPES、良好な緩衝能を持つ化合物は、精子のメディアで使用されています。グルコースと精子のメディアに存在する他の塩は、精子の整合性を維持するために浸透圧を維持するのに役立ちます。 精子への精子の後の減数分裂分化は、精子や精子の活性化と呼ばれます。 5揺れ、そしてネルソン6以前に円形精子細胞はここでは、Cのin vitroでの精子で実証プロナーゼE.を含む様々な活性化合物を添加することにより精子に分化誘導できることを示したプロナーゼEを使用して線虫の精子成功した精子は生殖能力の前提条件であり、したがって、精子形成の欠損変異株が無菌である。これまでいくつかの変異体は、特に精子形成の過程7で不良品であることが示されている。異常が小説SPE（精子形成の不良）のin vitroでの活性化に変異体は、私たちはこのイベントに参加する追加のプレーヤーを知る手助けになる際に発見。

男性から精子を分離し、活性化するためのプロトコル<em&gt; C.エレガンス</em&gt;ここで説明されています。男性のリリースの精子細胞の後端をカット。精子細胞は、プロテアーゼの添加によって活性化することができます。

アイソレーションと試験管内で</emの>活性化線虫（Caenorhabditis elegans）精子

線虫C. elegansにおいて、自然に存在する性の形態には、雄と雌雄同体という2つの形態があります。アメーバ状の精子は、雄と...

この手順の全体的な目的は、精子の形態を可視化することです。まず、解剖に備えて前日にオスを単離します。次に、オスを解剖して精子を放出させます。本手順の第3ステップでは、精子の形態を可視化します。最終ステップでは、下流のアプリケーションに向けて精子を調製します。最終的に、精子の形態およびin vitro活性化剤による処理を通じて活性化する能力を示す結果を得ることができます。精子の分離および活性化プロトコルは、30年以上前にSam Ward、Diane Shakes、およびGregory Nelsonによって初めて開発されました。私たちは現在、C. elegansにおける精子の機能と受精能を変化させる変異を特性解析するために、この手順を使用しています。この手順の全般的な目的は、C. elegansの精子形態を可視化することです。これは、解剖の1日前にオスを隔離して禁欲させることで行われます。第2の手順では、オスを解剖して円形の非モーダル精細胞を放出させます。第3の手順は、精細胞がin vitroで活性化し、成熟したAME精子の形態になる様子を可視化することです。本手順は、精子を単離させるため、研究室のポストドクター3名（Matt Marchello博士、Chatterjee博士、Guna SLU博士）によって実演されます。まず、5匹の野生型オスと1匹の雌雄同体を、線虫増殖培地（NGMプレート）の中央に播種した少量のE. coli OP50細菌のローン上で交配させ、多数のオスを得ます。次世代の約50%は、採取対象となる野生型の雄となります。L4期の雄について、解剖顕微鏡下で発生段階と尾部の形態を確認します。尾部の形態に基づいてL4期の線虫をピックアップします。雄の虫は尾部が丸みを帯びており、一方、雌雄同体は尾部が尖っています。白金線を用いて、1回の実験につきL4期の雄を7～10匹選び、OP 50が播種されたNGMプレートに移して1～2日間育成します。雌雄同体が存在しない環境で独身の雄を育成することで精子の喪失を防ぎ、実験操作時に大量の精子を利用できるようになります。解剖を開始する前に、1LのM9バッファーを調製します。組成は、DIリン酸水素ナトリウム 6g、リン酸一カリウム 3g、塩化ナトリウム 5g、硫酸マグネシウム七水和物 0.25g、および精子培地 5mL（1Lあたり）です。精子の活性化に使用するM9バッファーと精子培地は、オートクレーブまたはフィルター滅菌したストック溶液から調製します。解剖当日に、独身の雄を細菌を含まないNGMプレートに移し、数分間這わせます。この工程により、線虫の表面に付着した大腸菌の薄い層を除去することができます。あるいは、ウォッチグラスに少量のM nine bufferをピペットで分注し、そこに雄を移します。次に、パットペンを使用して

isolation-and-in-vitro-activation-of-caenorhabditis-elegans-sperm

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

から細胞外液のヴァンパイア·アイソレーション<em&gt;線虫（Caenorhabditis elegans）</em

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