Name: ヒトTリンパ球におけるカルシウム放出、活性化カルシウム（CRAC）電流のホールセル記録 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 29 s
Description: 学ぶ ヒトTリンパ球におけるCRAC電流のホールセルパッチクランプ記録法。FSAガリンを用いてカルシウムストアを空にし、電気生理学的測定でT細胞のカルシウムシグナル伝達を解析する信頼性の高い手法です。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

私たちは、施設やイオンチャネルの研究のための優れた環境をご提供するための生理学と膜生物学、カリフォルニア大学デ​​ービス校の学科に感謝しています。

1。一休みするヒトTリンパ球の調製<ol><li> RosetteSepヒトT細胞の濃縮カクテルとRosetteSep密度培地を用いて、製造元の指示に従って、人間の血液サンプルからT細胞を精製する。結果として得られる細胞集団は95％CD3 +安静時のT細胞が含まれている必要があります。私たちは、カリフォルニア大学デ​​ービス校の内部審査委員会によって承認されたプロトコールに従って健康なボランティアから採取した末梢血サンプルからのヒトTリンパ球を精製する。 </li><li>単離後、10％ウシ胎児血清、2％グルタミン- I、1％RPMI 1640を添加した、グルタミンおよびHEPESを含むRPMI - 1640培地を含む細胞培養培地中で0.5 × 10 6細胞/ mLの密度で休んでT細胞を再懸濁ビタミンソリューション、1％RPMI 1640アミノ酸液、1％ピルビン酸ナトリウム、および0.03％β-メルカプトエタノール。 </li><li>場所細胞の細胞培養フラスコにサスペンション、°加湿インキュベーター中、5％CO 2で、最大24時間の前に実験に、37で維持する。 </li></ol> 2。記録チャンバーの準備<ol><li>以下は、録音室を準備するために必要とされる。）シリコンO -リング、b）のラウンドは、25mmの製造元の指示に従って調製Sylgard184を混ぜ、70％エタノールおよび蒸留H 2 Oで洗浄カバーグラス、C）、、およびd） 2つの60 X 15ミリメートルのペトリ皿。 </li><li>場所〜60x15 mmのシャーレに混合Sylgard184 0.5 mLの。 </li><li> Sylgard184使用して鉗子にO -リングの底部を浸します。 </li><li>このような別のペトリ皿のような清浄表面上にO -リングを配置することにより、O -リングの縁から過剰Sylgard184を削除します。 </li><li>カバースリップの上にリングを置き、それを押してください。 </li><li> 85℃40〜60分間、またはSylgard184まで、Cが重合されている時にチャンバーを加熱することによってSylgard184を治す。 </li><li>無塵容器に録音室に保管してください。 </li></ol> 3。パッチピペットの準備<ol><li>実験日に、ガラスキャピラリーやピペットプラーを使用して〜2μmの先端径でピペットを引き出します。私たちは、フィラメント（：1.5 mmとID：1.10 mm外径）とホウケイ酸塩チューブを使用してください。ほこりのない場所で保管してピペット。 </li><li>標準的な手順9に従ってSylgard184またはHIPEC R6101の半導体保護コーティング、とコートは、ピペットチップ。 </li><li>静かに実験前にピペットを火 - ポーランド語。 </li></ol> 4。パッチクランプのセットアップの準備<ol><li>あなたのパッチクランプアンプを制御するソフトウェアでgigaseal形成のためのマクロを設定し、保存します。我々は、Windows XPやデータ取得用のパルスソフトウェアでサポートされているEPC - 10アンプを使用してください。我々は、EPC - 10マニュアルによると、"オンセル"、および"細胞全体の"マクロ"をセットアップ"を設定し、すべての実験のためにそれらを使用してください。 </li><li>前の実験にお風呂のソリューションと、表1に記載されているピペットのソリューションを用意し、最大1週間は4℃で保管します。 </li></ol><table border="1"><tbody><tr><td>化学物質</td><td colspan="3">バスソリューション（MM） </td><td>ピペットソリューションズ（MM） </td></tr><tr><td></td><td>第1位</td><td> ＃2 </td><td>第3位</td><td></td></tr></tbody><tbody><tr><td> CH 3 SO 3のNa </td><td> 130 </td><td> 110 </td><td> 125 </td><td> - </td></tr><tr><td> NaClの</td><td> 2 </td><td> 4 </td><td> 5 </td><td> - </td></tr><tr><td>のCa（OH）2 </td><td> - </td><td> 20 </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> MgCl 2の </td><td> 3 </td><td> 1 </td><td> - </td><td> 5 </td></tr><tr><td> MgSO 4を </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> 2 </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> 10 </td><td> 10 </td><td> 10 </td><td> 15 </td></tr><tr><td> HEDTA </td><td> - </td><td></td><td> 10 </td><td> - </td></tr><tr><td> EDTA </td><td> - </td><td> - </td><td> 1 </td><td> - </td></tr><tr><td> CS -spartate </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> 125 </td></tr><tr><td> BAPTA </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> 12 </td></tr><tr><td>グルコース</td><td> 10 </td><td> 10 </td><td> 10 </td><td> - </td></tr></tbody></table> 表1。全細胞CARC現在のレコーディングのためのソリューション。 すべての化学物質はSigma - Aldrich、セントルイス、MOから購入した。 <ol start="3"><li>パッチピペット溶液及び各浴溶液10との間の液体接合のポテンシャル（LJ）を決定します。あなたの集録ソフトウェアを使用して適切な場所にLJの値を保存します。例えば、パルスのプログラムで"アンプ"ウィンドウで"LJ"の制御にLJの値を挿入します。 </li><li>実験前に買収のソフトウェアの適切な場所で、図1に示すように、刺激プロトコルを、構成し、保存します。パルスのプログラムでは、我々は"パルス生成"ウィンドウで、買収のプロトコルを設定します。 <img src="/files/ftp_upload/2346/2364fig1.jpg" alt="図1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図1"> 図1。 2の（5 - - 0.5 Hz）の刺激のプロトコルは、-120から持続時間50ミリ秒の100 mVまでの電圧ランプはすべての0.2に適用されます。ランプの間に保持電位（V H）が 30 mVに保持されます。 </li></ol> 5。顕微鏡ステージ上に取り付けセル<ol><li>細胞を播種前にして〜20分と洗浄H 2 Oとし、ハンクス平衡塩溶液（HBSS）を持つためのポリ- L -リジンでコーティング録音室を。 </li><li> 37℃で20分間チャンバー内でインキュベート中に0.2〜0.5 × 10 6個の細胞を含む細胞懸濁液のプレート500μL℃に</li><li>チャンバーのホルダーに付着した細胞と録音室を確保する。我々は、ベースはカバースリップの上に対して上部軽く押したまま、カバーの底部をサポートするカスタムメイドのチャンバーのホルダーを、使用してください。 </li><li>倒立顕微鏡のステージ上のチャンバホルダーを置きます。 </li><li>透過光で細胞に焦点を当てる。我々は、40X油浸対物レンズを使用。 </li><li>浴中にAg / AgCl参照電極を置きます。 </li><li> multibarrel、重力駆動型の灌流システムを合わせます。流入管の先端が視野にカバースリップの近くに45 °の角度で配置する必要があります。 </li><li>流入管の先端に吸引管の​​反対側に置きます。 </li><li>でチャンバーを灌流リン酸緩衝生理食塩水（PBS）またはHBSSは、細胞培養培地とゆるく付着した細胞を洗い流す。 </li></ol> 6。 CRACチャネル電流の記録<ol><li>しっかりとカバースリップに接続されているセルを見つける。我々は一般的に滑らかな外表面を持つ平均的なサイズの、円形セルを選択します。 </li><li> 3mMのMg 2 +の含有浴溶液SERCAポンプをブロックするために8〜10分間0.5から1μMのタプシガルギンを含む第1位（表1）、+ -遊離Ca 2録音室を灌流。我々は、前のgigaseal形成へのストアを枯渇させるために、この手順を実行します。 </li><li>エッペンドルフmicroloaderとP - 20変位のピペットを使用して、ピペット溶液（表1）でパッチピペットを記入し、アンプのヘッドステージ上にピペットホルダーにパッチピペットを挿入する。 のCa 2 +キレート剤BAPTAは、受動的に店舗を破壊すると+ -依存性のCRACチャネルの不活性化のCa 2を減らすためにピペット溶液に含まれています。 </li><li>パッチピペット内の風呂に入る前に、正圧（H 2 Oの〜3インチ）の少量を適用します。我々は、パッチピペット内部に、正または負圧を作成するための圧縮空気と真空ラインに接続されたカスタムメイドの圧力吸引装置を使用してください。 </li><li>顕微鏡を介して視覚的なコントロール下でバスにパッチピペットを下げます。 "オシロスコープ"ウィンドウでは、ピペットを流れる電流が表示されるはずです。電流振幅のステップ状の変化がプリセットマクロによって適用される小振幅の電圧パルス（試験パルス）によって誘発されるべきである。この時点では、ピペットの抵抗の値を決定することができるはずです。私たちのピペットの抵抗は、通常、MΩ5月6日です。 </li><li>ピペットと参照電極間に生成された"オフセット"の可能性を修正してください。 </li><li>それは細胞膜に触れるまで、顕微鏡を介して視覚的制御の下で、近い細胞にピペットの先端をもたらす。 </li><li>パッチピペット内部の負圧（H 2 Oの20〜40インチ）を適用します。 </li><li> "オシロスコープ"ウィンドウでgigaseal形成を監視します。あなたは、テストパルス、減少し、&gt; 5GΩにピペット抵抗の値が増加することによって誘導される電流の振幅を、表示されます。 FE以内gigasealフォームwの数秒が、それは安定したgigasealを達成するために1〜2分かかる場合があります。 </li><li>ピペット容量（"C -ファースト"）を補償する。 </li><li> 20ccの注射器を使用して追加の負圧を適用してパッチ膜を破る。 </li><li> 30 mVに保持電位を設定します。正の保持電位は、カルシウム依存CRACチャネルの不活性化を防ぐことができます。 </li><li>細胞の膜容量（"C -遅い"）を補償C -遅いの値を保存または記録する。 </li><li>アクセス抵抗"R s"の値を確認してください。我々の実験では、R sは 、通常、MΩ70から20までです。 </li><li>のCa 2 0.5 Hzの周波数（図1）+ -フリー3mMのMg 2 +を含有浴溶液＃1の電圧ランプのシリーズを適用し始める。 Mg 2 +のためのCRACチャネルの低透過性のために"リーク"現在と比較してこのソリューションでは、CRAC電流は無視できるほど小さいです。 "漏れ"電流のように将来の分析で浴溶液​​＃1に記録されている現在のトレースを保存して使用してください。 -100 mVで"リーク"電流の絶対振幅は、以下または5 pAのと同じである必要があります。セルが"漏れ"の場合は、新しいパッチピペットと新しいセルを使用する場合に比べて実験してスタートを停止する。 </li><li> CRACチャネル（I のCa - CRAC）経由でのCa 2 +電流を記録するには、 潅流バルブを切り替えることで20mMのCa 2 +の含有浴溶液＃2（表1）でのCa 2 + -フリー3mMのMg 2 +を含有浴溶液＃1を交換してください。これは、Ca 2 +のCRACチャネルを経由してフローすることを可能にし、内向き電流を生成する。 "オシロスコープ"ウィンドウでは、内側に私のCa - CRAC（図2）整流の開発が表示されます。負電圧での電流の振幅は、CRAC電流のCa 2 +依存性増強のために約1分間増加していきます。 </li><li>一過性のNa + CRACチャネルを介して電流を記録するために必要な5 Hzの、の電圧ランプの刺激の頻度を増加させる。 </li><li> Na +の含有二価カチオンを含まない灌流バルブを切り替えることにより、ソリューション＃3（表1）と20mMのCa 2 +の含有浴溶液＃2を交換してください。 "オシロスコープ"ウィンドウでは、内向きのNa + CRACチャネル（;図2 I のNa - CRAC）を介して電流整流大きな振幅の過渡的な開発が表示されます。 </li><li>一つは、現在の"リーク"を記録するために実験の終了時に1から5μMラ3 +を含む20mMのCa 2 +含有浴溶液＃2を適用される場合があります。しかし、我々は時間をかけて"リーク"電流が変化するため、このアプローチが有用見つけることができませんでしたし、それは実験の終了時に大きくまたは小さくなる場合があります。私たちは、"リ ​​ーク"現在として実験の開始時に現在のCa 2で記録した+ -フリー3mMのMg 2 +を含有浴溶液＃1を取ることを好む。 </li><li>さらに分析するために記録された現在のトレースを保存します。 </li></ol> 7。データ解析<ol><li>解析ソフトウェアに保存されている現在のレコードを取得。我々は分析のためにパルスプログラムを使用してください。 </li><li>初めに、電圧ランプの終わりに現在の振幅を測定します。我々は、通常、-100 mVで、パルスプログラムの"オシロスコープ"ウィンドウ内のカーソルのペアを使用して100 mVでの電流振幅を測定する。 </li><li>さらに分析およびグラフィカルなプレゼンテーションのためのグラフィックプログラムに現在の振幅の値をエクスポートします。我々は、Origin科学グラフと解析ソフトウェア、バージョン7を使用してください。 </li></ol> 8。代表的な結果<img src="/files/ftp_upload/2346/2346fig2.jpg" alt="図2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図2"> 図2。安静時のヒトT細胞におけるCRAC電流。（）、-100 mVの（黒丸）と+100 mVの（白丸）でのホールセル電圧クランプ構成で記録されたCRAC電流の時間経過。 gigaseal形成に先立って、細胞を、Ca 2年〜10分間プレインキュベーションした+ -フリー3mMのMg 2 +を含有浴溶液、0.5μMのタプシガルギンを含む第1位。ブレークイン後、お風呂のソリューションは、順番に次のように適用されました：のCa 2 + -フリー3mMののMg 2のCa 2 +含有浴溶液＃2 20 mMのそれに続く+含有浴溶液＃1（0のCa + 3mg）を、 （20 Ca）の、浴溶液＃2（20 Ca）のに続いて二価カチオンを含まない浴溶液＃3（DVF）、続いて。セルは、図1に示すように電圧ランプのシリーズで刺激した。ランプの周波数は、浴溶液＃3（DVF）とすべての他のソリューションでは0.5 Hzで5Hzのだ。 20mMのCa 2 +の含有浴溶液＃2とDVFの浴溶液＃3の私のNa - CRACの高速過渡開発のアプリケーションの後に私のCa - CRACの遅い開発に注意してください。 （B）、代表、現在のトレースは、+ -フリー3mMのMg 2 +を含有浴溶液＃1（のCa 2に電圧ランプの間に記録さ"リーク"）、20mMのCa 2 +の含有浴溶液＃2（20 Ca）の、そして浴溶液＃3（DVF）。 （C、D）、私のCa - CRAC（C）と私のNa - CRAC（D）の電流-電圧の関係は、20mMの電圧ランプ中のCa 2 +含有お風呂に記録された電流から"リーク"電流を差し引いたパネル（B）に示すように解第2位（20 Ca）の、そして浴溶液＃3（DVF）。

<ol><li>Parekh, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Store-operated+CRAC+channels%3A+function+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Store-operated CRAC channels: function in health and disease.</a> Nat Rev Drug Discov. 9, 399-410 (2010).</li>
<li>Feske, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRAC+channelopathies%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Arch%22%5BJournal%5D)">CRAC channelopathies.</a> Pflugers Arch. , (2010).</li>
<li>Lewis, R. S., Cahalan, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitogen-induced+oscillations+of+cytosolic+Ca2%2B+and+transmembrane+Ca2%2B+current+in+human+leukemic+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Regul%22%5BJournal%5D)">Mitogen-induced oscillations of cytosolic Ca2+ and transmembrane Ca2+ current in human leukemic T cells.</a> Cell Regul. 1, 99-112 (1989).</li>
<li>Zweifach, A., Lewis, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+inactivation+of+depletion-activated+calcium+current+%28ICRAC%29+due+to+local+calcium+feedback%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Physiol%22%5BJournal%5D)">Rapid inactivation of depletion-activated calcium current (ICRAC) due to local calcium feedback.</a> J Gen Physiol. 105, 209-226 (1995).</li>
<li>Zweifach, A., Lewis, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Slow+calcium-dependent+inactivation+of+depletion-activated+calcium+current.+Store-dependent+and+-independent+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Slow calcium-dependent inactivation of depletion-activated calcium current. Store-dependent and -independent mechanisms.</a> J Biol Chem. 270, 14445-1451 (1995).</li>
<li>Zweifach, A., Lewis, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium-dependent+potentiation+of+store-operated+calcium+channels+in+T+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Physiol%22%5BJournal%5D)">Calcium-dependent potentiation of store-operated calcium channels in T lymphocytes.</a> J Gen Physiol. 107, 597-610 (1996).</li>
<li>Prakriya, M., Lewis, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separation+and+characterization+of+currents+through+store-operated+CRAC+channels+and+Mg2%2B-inhibited+cation+%28MIC%29+channels%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Physiol%22%5BJournal%5D)">Separation and characterization of currents through store-operated CRAC channels and Mg2+-inhibited cation (MIC) channels.</a> J Gen Physiol. 119, 487-507 (2002).</li>
<li>Fomina, A. F., Fanger, C. M., Kozak, J. A., Cahalan, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+channel+properties+and+regulated+expression+of+Ca%282%2B%29+release-activated+Ca%282%2B%29+%28CRAC%29+channels+in+human+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Single channel properties and regulated expression of Ca(2+) release-activated Ca(2+) (CRAC) channels in human T cells.</a> J Cell Biol. 150, 1435-1444 (2000).</li>
<li>Sakmann, B., Neher, E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSakmann%2C+B+%22Single-Channel+Recording%22">Single-Channel Recording</a>. , 2nd edition, Plenum Press. New York. (1995).</li>
<li>Neher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correction+for+liquid+junction+potentials+in+patch+clamp+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Correction for liquid junction potentials in patch clamp experiments.</a> Methods Enzymol. 207, 123-1231 (1992).</li>
</ol>

利害の衝突は宣言されません。

これらの細胞中の内因性CRAC電流振幅が小さいセルサイズ（安静時のヒトT細胞の直径は5〜8μmの範囲にある）のために小さいため、ヒトT細胞の休止のCRAC電流の電気生理学的研究は困難な作業です。ここで、我々は確実に末梢血単核細胞から単離されたヒトTリンパ球を休んでCRAC電流を記録するためにステップバイステップの手順を示します。この技術は、私たちはより良い正常および病的な免疫細胞応答の性質を理解するために休止期T細胞のCRACチャネルの生理機能と機能発現を調べることができます。このプロトコルを使用して、一つはそのような活性化ヒトT細胞、単球、およびマクロファージのような他の免疫細胞にだけでなく、ヒトT細胞を休息にCRAC電流を測定することができます。

<table><tbody><tr><td>RosetteSepヒトT細胞濃縮カクテル</td><td>幹細胞技術</td><td>15061</td><td></td></tr><tr><td>RosetteSep密度勾配培地</td><td>幹細胞技術</td><td>15705</td><td></td></tr><tr><td>グルタミン/HEPES含有RPMI 1640培地</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH3025501</td><td></td></tr><tr><td>胎児牛血清</td><td>Omega Scientific</td><td>FB-01</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX-I (100倍濃縮溶液)</td><td>Invitrogen</td><td>35050</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 ビタミン溶液 (100倍濃度)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7256</td><td></td></tr><tr><td>1640アミノ酸溶液 (50倍濃縮)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R7131</td><td></td></tr><tr><td>ピルビン酸ナトリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8636</td><td></td></tr><tr><td>&amp;#946;-メルカプト&amp;#8211;エタノール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7522</td><td></td></tr><tr><td>イノシトール三リン酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>19766</td><td></td></tr><tr><td>BAPTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4926</td><td></td></tr><tr><td>ポリ-L-リシン臭化水素酸塩</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2636</td><td></td></tr><tr><td>塩化ランタン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>262072</td><td></td></tr><tr><td>タプシガルギン</td><td>Calbiochem</td><td>586005</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184 シリコンエラストマーキット</td><td>Dow Corning</td><td>3097358-1004</td><td></td></tr><tr><td>HIPEC R6101 半導体保護コーティング</td><td>Dow Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>63-500シリーズ 高性能除振光学定盤</td><td>テクニカル・マニュファクチャリング社</td><td>63-540</td><td></td></tr><tr><td>ヘッドステージ付きEPC 10パッチクランプアンプ</td><td>HEKA Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>マイクロマニピュレーター </td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>MP-285</td><td></td></tr><tr><td>40倍油浸対物レンズを備えたOlympus 1X71倒立顕微鏡</td><td>オリンパス株式会社</td><td>1X71</td><td></td></tr><tr><td>Windowsコンピュータ</td><td>Dell</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pulseソフトウェア</td><td>HEKA Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Origin Scientific グラフ作成および解析ソフトウェア</td><td>OriginLab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>パッチピペットプラー</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>フィラメント付きホウケイ酸ガラス（外径：1.5mm、内径：1.10mm）</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>BF150-110-7.5</td><td></td></tr><tr><td>ナラシゲ&amp;rsquo;Microforge</td><td>Tritech Research, Inc.</td><td>MF-830</td><td></td></tr><tr><td>シリコンOリング </td><td>McMaster-Carr</td><td>111 S70</td><td></td></tr><tr><td>カバーガラス 25 mm </td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-102 25 mm 25CIR.-1</td><td></td></tr></tbody></table>

ヒトtリンパ球におけるカルシウム放出、活性化カルシウム（crac）電流のホールセル記録

Whole-Cell Recording of Calcium Release-Activated Calcium (CRAC) Currents in Human T Lymphocytes

Tリンパ球で、細胞内Ca 2 +ストアからのCa 2 +枯渇は、カルシウムのリリース-活性化カルシウム（CRAC）チャネルと呼ばれる細胞膜のCa 2 +チャネルの活性化につながる。 CRACチャネルは、T細胞の増殖と遺伝子発現の調節において重要な役割を果たしている。 T細胞の異常なCRACチャネル機能は、重症複合免疫不全や自己免疫疾患1、2にリンクされています。ヒトT細胞のCRACチャネルの機能を研究することは正常な免疫反応を調節する新たな分子メカニズムを明らかにし、関連するヒト疾患の原因を解明することができる。膜電流の電気生理学的記録は、機能的なチャネルのプロパティとその規制の最も正確な評価を行うこと。 Jurkat T細胞、ヒト白血病T細胞株、のCRACチャネル電流の電気生理学的評価が最初に20年以上前に3を実行された、しかし、正常なヒトT細胞におけるCRAC電流測定は困難な課題である。正常T細胞でCRACチャネル電流を記録するの難しさは、血液由来のTリンパ球は、Jurkat T細胞よりもはるかに小さいサイズと、従って、内因性の細胞全体のCRAC電流は振幅が非常に低いものであるという事実によって悪化されています。ここで、我々は日常的に健康なボランティアの末梢血から単離されたヒトT細胞の休止のCRACチャネル経由でのCa 2 +又はNa +電流を記録するために使用するステップバイステップの手順を与える。ここで説明する方法は、Jurkat T細胞および活性化ヒトT細胞4-8にCRAC電流を記録するために使用される手続きから導入されました。

我々は、末梢血単核細胞由来のヒトTリンパ球におけるカルシウム放出、活性化カルシウム（CRAC）電流の全細胞パッチクランプ記録のためのステップバイステップのプロトコルを提供しています。

ヒトTリンパ球におけるカルシウム放出、活性化カルシウム（CRAC）電流のホールセル記録

Tリンパ球において、細胞内Ca2+ストアからのCa2+枯渇は、カルシウム放出活性化チャネル（Calcium Release-Activated...）と呼ばれる細胞膜Ca2+チャネルの活性化を引き起こします。

細胞膜に位置するカルシウム放出活性化カルシウムチャネル（CRACチャネル）は、T細胞の増殖および遺伝子発現において重要な役割を果たしています。抗原によるT細胞受容体の刺激は、セカンドメッセンジャーであるイノシトール三リン酸の生成と、イノシトール三リン酸受容体を介したストアからのカルシウム放出の活性化をもたらします。ストア内のカルシウム濃度の低下は、CRACチャネルの活性化を誘導し、その結果、細胞質内のカルシウム濃度が上昇します。T細胞におけるCRACチャネル機能の異常は、重症複合免疫不全症や自己免疫疾患を含む多くの疾患に関連しています。ここでは、ヒトT細胞から内因性のカルシウムおよびナトリウムCRACチャネル電流を信頼性高く再現性をもって記録する方法を提示します。まず、カルシウム非含有の細胞外液または3 mMのマグネシウムを含む溶液中で、sarcoplasmic/endoplasmic reticulum Ca²⁺-ATPaseの阻害剤であるFSAガリンを投与し、ストアを枯渇させます。この手順によりクラックチャネルは開口しますが、クラックチャネルのマグネシウムに対する透過性が低いため、クラック電流は誘発されません。その後、T細胞膜を用いてホールセル電圧クランプを確立します。細胞には、高濃度のカルシウムキレート剤ptaを含むピペット溶液を灌流します。次に、カルシウム含有溶液または二価陽イオン除去細胞外液を順次適用し、crackチャネルを介した測定可能なカルシウム電流およびナトリウム電流を活性化させます。得られたデータは、静止期にあるヒトT細胞におけるcrackチャネルの機能的発現レベルを示します。crackチャネルを介した膜電流の調査は、crackチャネルの調節と機能に関する貴重な情報を提供し、正常な免疫応答および免疫疾患におけるcrackチャネルの役割を解明することにつながります。一般的に、この手法に不慣れな方は、ヒトTリンパ球のサイズが小さいことや、これらの細胞における内因性クラック電流の振幅が低いことに苦労します。本実験に使用したCD3陽性ヒトTリンパ球は、健康なボランティアの末梢血サンプルから得たものであり、TEP human T-cell enrichment cocktailおよびTEP密度勾配媒体を用いて単離しました。付属の書面プロトコルの指示に従い、細胞は二酸化炭素インキュベーター内、37 °CのT細胞培養培地で維持しました。以下の溶液を調製する。溶液1：3 mM マグネシウムを含み、カルシウムを含まない溶液。溶液2：20 mM カルシウムを含む溶液。溶液3：10 mM カルシウムキレート剤 EDTA を含み、二価イオンを含まない溶液。および、12 mM カルシウムキレート剤 BTA を含むピペット溶液。これらの溶液は4 °Cで最大1週間保存する。実験当日に、ガラスキャピラリーとピペットプラーを用いて、先端径約2 µmのピペットを作製する。ここに示し、付随するテキストに記載されている仕様のフィラメント付きシリカチューブを使用します。ピペットチップを延伸した後、PEC R 61 0 1 半導体保護コーティングでコーティングし、火炎研磨を行います。ピペットホルダーなどの防塵場所に保管してください。ここでパッチクランプアンプを制御するソフトウェアを開きます。E PC 10パッチクランプアンプはpulseソフトウェアで制御されます。ギガシール形成およびホールセル構成の確立に使用する、cellおよびwhole cellマクロのセットアップを設定し、保存します。次に、データ収集ソフトウェアにおいて、クラック電流を記録するための刺激プロトコルを構成して保存します。パルス生成ウィンドウの収集プロトコルを、-120から+100 mVまで、持続時間50 msの電圧ランプに設定します。ランプ電圧刺激周波数を0.5 hertzとfive hertzに設定した2つの刺激プロトコルを作成し、パルス生成ウィンドウにそれぞれramp oneおよびramp twoという名前で保存します。記録用の細胞準備のため、ポリリジンコートされたカバースリップにシリコンOリングを取り付けた記録チャンバーに、0.2 to 0.5 million個の細胞を含む細胞懸濁液500 microlitersを播種します。37 degrees Celsiusで20分間インキュベートします。インキュベーション後、レコーディングチャンバーをチャンバーホルダーに固定します。ここではカスタムメイドのチャンバーホルダーを使用しており、底部でチャンバー底面のカバースリップを支持し、上部でカバースリップの上端を圧迫して固定する構造になっています。40倍油浸対物レンズと明視野照明を用いて、倒立顕微鏡のステージ上にチャンバーホルダーを設置します。細胞の視野を特定し、ピントを合わせます。銀-塩化銀参照電極をバスに入れます。次に、流入チューブの先端をカバースリップに対して45度の角度で視野の近くに配置し、吸引チューブをチャンバーホルダーの上部に挿入することで、マルチバレル重力駆動灌流システムを調整します。吸引チューブが流入チューブの反対側に来るまでチャンバーホルダーの上部を回転させ、適切なチャンネルに設定します。電流記録は、灌流システムのバルブを開き、記録チャンバーをカルシウムフリーで、3 mMのマグネシウムを含むBAT溶液1（0.5～1 µMのAP l-argonを添加）で8～10分間灌流させ、CIRCAポンプをブロックすることから開始します。このステップでカルシウムストアを枯渇させます。次に、P 20 空気置換式ピペットを備えたEinorマイクロローダーを使用します。ピペットにピペット溶液を満たすには、ここにあるアンプリファイアヘッドステージのホルダーにピペットを挿入してください。特注の圧力吸引装置を、加圧空気ラインおよび真空ラインに接続します。パッチピペット内に正圧または負圧を作成するには、接続チューブを介してピペットを圧力吸引装置の出口に接続し、ピペット内部に約3インチ水柱のわずかな正圧をかけます。コンピュータ画面上のEPC 10パッチクランプウィンドウにあるセットアップコントロールキーをクリックしてください。セットアップマクロを実行します。カバースリップにしっかりと付着しており、外表面が滑らかで平均的な大きさの円形細胞を探します。次に、オシロスコープウィンドウ内の顕微鏡による視覚制御下で、パッチ電極をバス内に降ろします。ピペットをバス溶液に浸した後、ピペットに流れる電流を確認できます。セットアップマクロによってピペットに印加される5 mVの電圧テストパルスにより、電流振幅にステップ状の変化が生じます。パルスソフトウェアがピペット抵抗を自動的に算出し、膜抵抗ウィンドウに表示します。コンピュータ画面上のピペット抵抗は、通常5〜6 MΩです。コンピュータ画面のアンプリファイアウィンドウにあるオートコントロールキーをクリックし、ピペットと参照電極の間に生じたオフセット電位を補正します。これにより、ベースライン電流がゼロ電流レベルに移動します。マイクロマニピュレーターを使用して、ピペットチップを細胞膜に接触させます。接触すると、テストパルスによって誘発される電流の振幅が減少します。パッチピペットに20～40 inches of waterの陰圧をかけます。オシロスコープのウィンドウでギガシール形成をモニターします。ピペット抵抗の値が5 GΩ以上に増加するにつれて、テストパルスによって誘発される電流の振幅が徐々に減少します。通常、ギガシールの接触は迅速に形成されますが、安定したギガシールを達成するまでに1〜2分かかる場合もあります。ギガシールが形成されたら、接続チューブを出口から外して、ピペットホルダーを吸引装置から切り離します。コンピュータ画面上のonsellコントロールキーをクリックし、実験前に設定しておいたonsellマクロを実行します。EPC 10のマニュアルに従い、cfatウィンドウのオートコントロールキーをクリックして、ピペット容量を補正します。オシロスコープのウィンドウで電流過渡応答が消失すると、cfatウィンドウにピペット容量の値が表示されます。ピペット内部の細胞膜を破断させるため、接続チューブを介してピペットを20 cubic centimeterのシリンジに接続し、プランジャーを引いてピペットにさらなる陰圧をかけます。ピペット内部の細胞膜が破裂すると、細胞膜が新しい電圧レベルまで充電されることで、2つの電流過渡応答が現れます。コンピュータ画面上のホールセル制御キーをクリックし、プリセットされたホールセルマクロを実行してください。次に、V membraneウィンドウに保持電位を+30 mVに設定します。正の保持電位は、カルシウム依存性クラックチャネルの活性化を防ぐのに役立ちます。続いて、C slowウィンドウのauto controlキーをクリックします。オシロスコープウィンドウで細胞容量が補正されると、電流過渡応答が消失します。細胞容量および直列抵抗の値は、それぞれ C slow および R series ウィンドウに表示されます。直列抵抗は通常、7〜20 MΩ の範囲内になります。細胞容量に対応する C slow の値は、通常 1.5〜2.5 pF の範囲になります。静止期のヒトT細胞において、オシロスコープウィンドウのramp oneコントロールキーをクリックし、周波数0.5 hertzの一連の電圧ランプを印加します。これにより、実験前にオシロスコープウィンドウで作成し保存した刺激プロトコルが実行されます。電圧ランプによって誘発された電流が表示されます。記録してください。これらは、3 mMのマグネシウムを含むカルシウムフリー溶液1における電流波形です。この溶液では、マグネシウムに対するクラックチャネルの透過性が低いため、クラック電流は非常に小さくなります。今後の解析において、これらの波形をリーク電流として使用してください。-100 mVにおけるリーク電流の絶対振幅は、5 pA以下である必要があります。細胞にリークがある場合は、実験を中止し、新しいパッチピペットと新しい細胞を用いて最初からやり直してください。次に、CRACチャネルを介したカルシウム電流を記録するため、灌流バルブを切り替え、バス溶液1を20 mMのカルシウムを含むバス溶液2に置換します。これにより、カルシウムイオンがCRACチャネルを介して流入し、オシロスコープのウィンドウに内向き電流が生成されます。CRACチャネルを介した内向き整流性カルシウム電流は、負電位で電流振幅を発現し、CRAC電流のカルシウム依存性増強により、約1分間にわたって増大し続けます。オシロスコープウィンドウのランプ2コントロールキーをクリックして、プリセットされた刺激プロトコルを実行します。これにより、電圧ランプによる刺激周波数が5 Hzに変化します。刺激周波数を上げることで、一過性の性質を持つCRACチャネルを介した最大ナトリウム電流の記録が可能になります。次に、オシロスコープウィンドウで灌流バルブを再度切り替え、バス溶液2を、ナトリウムを含む2価陽イオンフリー溶液3に置換します。すると、CRACチャネルを介して、より大きな振幅を持つ一過性の内向き整流ナトリウム電流が発生します。実験終了後、ファイルを閉じると、後でデータを解析するために記録された電流トレースが保存されます。保存された電流記録を解析ソフトウェアに読み込ませます。ここでは、Pulseソフトウェアのオシロスコープウィンドウにあるカーソルペアを用いて解析を行います。電圧ランプの開始時と終了時の電流振幅を測定してください。電流振幅は-100 mVおよび+100 mVで測定します。電流振幅の値を、Originなどの科学的グラフ作成および解析ソフトウェアにエクスポートしてください。さらなる解析およびグラフ表示のため、本手法を用いて健康なヒト被験者由来のCD3陽性静止期T細胞においてリーク電流を測定しました。この図は、ホールセル・ボルテージクランプ法にて記録したリーク電流の経時変化を示しており、塗りつぶされた円は-100 mV、白抜きの円は+100 mVにおける値を示しています。ギガシール形成前に、細胞をカルシウムフリーの 3 mM マグネシウム含有浴液1（0.5 µM オルソグン含有）で約 10 分間プレインキュベートしました。ブレークイン後、浴液を次のように順次適用しました。まずカルシウムフリーの 3 mM マグネシウム含有浴液1、次に 20 mM カルシウム含有浴液2、続いて二価陽イオンフリーの浴液3、最後に再び 20 mM カルシウム含有浴液2を適用しました。その後、ここに示すように、-120 mV から +100 mV までの連続的な電圧ランプを用いて細胞を刺激しました。電圧ランプは、2価陽イオン不含のBAT溶液第3剤では200ミリ秒ごと（周波数5 Hz）、その他のすべての溶液では2秒ごと（周波数0.5 Hz）に印加した。20 mMのカルシウムを含むBAT溶液第2剤の投与後、CRACチャネルを介したカルシウム電流の立ち上がりが緩やかであること、および2価陽イオン不含のBAT溶液第3剤において、CRACチャネルを介したナトリウム電流が急速に一過性に立ち上がることに注目されたい。この図は、カルシウム不含条件下での電圧ランプ中に記録された代表的な電流波形を示している。3 mMマグネシウム含有バス溶液1、20 mMカルシウム含有バス溶液2、および2価陽イオン不含バス溶液3を用います。個々の電圧ランプにおけるカルシウム電流およびナトリウム電流のトレースは、20 mMカルシウム含有バス溶液2および2価陽イオン不含バス溶液3で記録された電流から、カルシウム不含3 mMマグネシウム含有バス溶液1で記録された電流を差し引くことで得られます。得られた電流トレースにおいて、CRACチャネルを介したカルシウム電流およびナトリウム電流に典型的な電流-電圧関係がここで示されています。この手法を習得し、手順のすべての段階を適切に実行できれば、1日に5〜10個の細胞からクラックチャネル電流を記録することが可能です。このビデオを視聴することで、ヒトT細胞の静止状態における補正電流の記録方法について十分に理解できるはずです。この手順に従えば、活性化ヒトT細胞、単球、マクロファージ、および細胞株などの他の免疫系細胞においても、補正電流を記録できるようになります。電気生理学的。免疫系細胞におけるクラックチャネル電流の記録により、免疫細胞のカルシウム恒常性におけるそれらの役割を解明できる可能性があります。

whole-cell-recording-calcium-release-activated-calcium-crac-currents

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

このビデオでは、T細胞におけるT細胞受容体によるカルシウム流入を解析しています。抗CD3抗体はT細胞シグナル伝達経路を活性化し、Indo-1色素と結合する細胞内カルシウムイオンを増加させます。フローサイトメトリーでは、カルシウムフリー状態からカルシウム結合状態へのスペクトルシフトは、T細胞受容体によって誘発されるカルシウム流入と相関しています。...

カルシウム指示色素を用いたT細胞受容体誘導性カルシウム流入の評価

我々は、細胞内Caために使用することができ、ヒト心房筋細胞の単離を記載...

カルシウムの同時測定のための人間の心房筋細胞の分離<sup&gt; 2 +</sup&gt;過渡と膜電流

カルシウムは、多くの生理学的および病態生理学的なシグナル伝達経路に関与している。生細胞イメージングは​​、特殊な設備を必要とし、時間がかかる可能性がある。懸濁液中に持ち込ま付着上皮細胞における細胞質カルシウムの相対的変化を決定するために、フローサイトメーターを使用して迅速に、簡単な方法を最適化した。...

フローサイトメトリーによる腎上皮細胞における細胞質ゾルカルシウム測定

ここでは、簡単な手動タンパク質沈殿ステップとオンラインカラム抽出を使用して、乾燥血液スポット中の免疫抑制剤タクロリムスを定量するための高速液体クロマトグラフィー-タンデム質量分析(HPLC-MS/MS)アッセイについて説明します。...

LC-MS / MSを用いて乾燥血液スポット上で免疫抑制タクロリムスの定量化

この原稿では、T細胞抗原受容体(TCR)と抗原性ペプチドをロードしたMHC分子との間の結合ダイナミクスを測定するための(単一分子)フェルスター共鳴エネルギー移動(FRET)ベースのアッセイの実施方法について説明します。これらの機能化された平面支持脂質二重層と接触しているT細胞の免疫学的シナプス内で発生します。...

TCR-のpMHCが結合を測定します<em&gt;その場で</em&gt; FRETベースの顕微鏡アッセイを使用して

マウスモデルは、不整脈形成の重要なメカニズムを研究することを可能にする。そのためには、パッチクランプ測定を行うために高品質の心筋細胞が必要です。ここでは、カルシウム一過性物質とL型カルシウム電流を同時に測定できる逆行性酵素ベースのランゲンドルフ灌流を介してマウス心房筋細胞と心室筋細胞を分離する方法について説明します。...

Ca2+過渡現象とL型カルシウム電流の同時測定のための高品質マウス心房および心室筋細胞の分離

ここでは、エプスタインバーウイルスで内因的に発現するRYR1変異の機能的効果を研究するために用いられる方法について、ヒトBリンパ球および筋生検由来衛星細胞をミオチューブに分化した不死生のヒトリンパ球が説明されている。...

内在的に発現したヒトRYR1変異体の機能特性評価

T細胞シグナル伝達の尺度であるカルシウム流入は、T細胞受容体刺激に対する応答を分析するための効果的な方法です。Indo-1を細胞表面分子に向けられた抗体のパネルでマルチプレックス化するためのこのプロトコルは、フルスペクトルフローサイトメトリーの非常に柔軟な機能を利用しています。...

フルスペクトルフローサイトメトリーによる初代マウスT細胞におけるT細胞受容体誘導性カルシウム流入の解析

ここでは、蛍光顕微鏡法を用いて、初代マウスおよびヒトT細胞におけるCa2+マイクロドメインとして知られる初期の局所Ca2+シグナルを分離するための包括的なプロトコールを提供します。このプロトコルは、免疫細胞内のCa2+シグナル伝達経路を研究し、その機能をさらに解明するための研究者にとって貴重なリソースとして機能します。...

初代T細胞における初期Ca2+ マイクロドメインのイメージング

この記事では、Fura-2/AM色素を用いたシングルセルCa2+イメージングを使用して、細胞内のカルシウムイオン(Ca2+)濃度をリアルタイムで定量的にモニタリングする方法を紹介します。この技術により、効率的な色素ローディングと、蛍光強度比によるCa2+レベルの正確な計算が可能になり、研究アプリケーションのためのシンプルで迅速なアプローチが可能になります。...

カルシウムイオンチャネルの活性化を研究するためのシングルセルカルシウムイメージング

学ぶ ヒトTリンパ球におけるCRAC電流のホールセルパッチクランプ記録法。FSAガリンを用いてカルシウムストアを空にし、電気生理学的測定でT細胞のカルシウムシグナル伝達を解析する信頼性の高い手法です。

ヒトTリンパ球におけるカルシウム放出、活性化カルシウム（CRAC）電流のホールセル記録

さらに動画を探す