パーコール勾配を用いて脳と脊髄単核細胞の単離
2011年2月2日
現在の記事は、効率的効果的にフローサイトメトリー分析に利用することができる脳や脊髄の組織から単核細胞を分離するために迅速なプロトコルを記述します。
免疫細胞は、感染、外傷、自己免疫、または神経変性の間に中枢神経系に浸潤します。組織化学的アプローチは、浸潤細胞の位置を特定し、関連する病理を解析するために使用できますが、これらの技術は同時に使用できる抗体の数によって制限されます。ここでは、解剖された組織を最初に均質化する、脳および脊髄組織からの単核細胞の迅速な単離の方法が示されています。
次に、ペロール勾配を設定し、遠心分離後、界面から単核細胞を回収します。最後に、細胞をすすぎ、抗体で染色します フローサイトメトリー分析により、血行性細胞と監視ミクログリアが区別され、疾患状態におけるそれらの相対的な比率を決定できます。この手法の主な利点は、アリス勾配法のような既存の方法や組織化学法に比べて、時間がかからないことです。
これにより、より多くの組織を同時に処理することができます。グラジエントセットアップのデモンストレーションは、私の研究室の技術者であるpalino このプロトコルに必要な試薬を準備します。まず、脳あたりSIPと呼ばれる4ミリリットルの純正ペロールのストックから始めます。
これを行うには、ペロールの9つの部分とHBSSの10倍の1つの部分を、カルシウムとマグネシウムを反転によって混合せずに組み合わせます。次に、準備したSIPをカルシウムとマグネシウムを含まないHBSSの1倍に混合しながら、通話ごとに70%を準備します。次に、コールあたり70%の2ミリリットルを15ミリリットルのポリプロピレンコニカルチューブに分注して、組織を収集します。
この手順では、すべての研究マウスの解剖された脳と脊髄を、10ミリリットルのRPMIを含むビーカーに氷の上に置きます。次に、組織を7ミリリットルまたは15ミリリットルのダウンホモジナイザーに移し、1×HBSSをルーズフィットサイズで3ミリリットル含みます。乳棒は細胞懸濁液を穏やかに作り、次にぴったりとフィットするサイズBの乳棒に切り替え、さらに組織を解離させます。
組織が均質化されたら、RPMIまたはHBSSの1倍を最終容量の7ミリリットルに加え、パーココグラジエントを設定するためのグラジエントの設定に進みます。まず、細胞懸濁液に3ミリリットルのSIPを添加し、最終的なPERCOCO濃度を30%にしますペロールは室温で使用する必要があることに注意してください。冷やして使用すると、細胞が凝集する傾向があり、細胞分離の効率が低下します。
次に、ピペットエイド設定重力モードを使用して、10ミリリットルのセル懸濁液を70%SIPの上にゆっくりと重ねます。70%と30%の溶液を混合することは避けてください。これは、手順の最も重要なステップです。
70〜30%のジャンクションに非常に明確なフラットラインが見えるはずです。一般的に、この方法に不慣れな個人は、レイヤリング中に3番目と70%のソリューションが混ざり合うため、苦労します。次のステップは、18°Cで500Gsの30分間のインターフェースCentrifugeを妥協します。
遠心分離機が最小限の中断または中断なしで停止することを確認して、インターフェースが妨げられないようにします。グラディエントを回転させた後、チューブの上部に厚くて粘性のある破片の層が蓄積するはずです。次の層は、コアあたり30%がかった黄色がかった層で、破片が含まれていることがあります。
次は 70 から 30 のインターフェースで、定義された白いハローを持ち、単核細胞が含まれている必要があります。最後に、チューブの底部には透明な70%ペロール層があります。界面が観察されない場合、細胞の収量は非常に低くなる可能性が高く、さらなる解析は非常に困難になります。
したがって、その時点で、汚染を減らすために新鮮な細胞懸濁液が必要になるかもしれません。チューブの上部から破片の層を慎重に取り除き、廃棄します。次に、プラスチックピペットを使用して、上部30%/コア層を通過し、70 30間相の2〜3ミリリットルを収集し、HBSSの1倍の8ミリリットルを含むきれいな円錐管に移します。
希釈した界面を反転して数回混合し、500GSで18°Cで7分間遠心分離します。スピン後、スープペナを取り外し、ペレットを再度懸濁します。1ミリリットルの細胞染色バッファーで、細胞懸濁液を1.5ミリリットルのチューブに移し、もう一度洗浄します。
抗体染色を行うために抗体染色を進める前に、摂氏4度で1分間10,000GSでマイクロ遠心分離機を使用し、精製された抗US CD 16、CD 32の50マイクロリットルでペレットを再懸濁し、FC結合部位をブロックするために細胞染色緩衝液で1〜200を希釈した。どのような染色手順でも、すべての抗体を適切に滴定し、氷上で10分間インキュベートすることが不可欠です。インキュベーション中に、2〜5マイクロリットルの細胞を取り出し、ヘモサイトメーターを使用してカウントします。
ナイーブな脳組織と脊髄組織の組み合わせは、マウス1匹あたり5個の細胞の約3〜5倍の10を生成するはずです。炎症を起こした脳は、それらが収集される時点と疾患モデルに応じて、さまざまな数の炎症細胞を持ちます CD 16およびCD 32とのインキュベーションに続いて、50マイクロリットルの免疫細胞特異的抗体カクテルミックスを追加します。この例で使用した混合物には、CD 45、CD four、および CD 19 に対する抗体が含まれており、氷上で 30 分間インキュベートします。
重要なのは、各抗体を最初に滴定する必要があるということです。最適な希釈を評価するには、レーザーの能力と特定の流量のフィルター設定に応じて選択された適切な蛍光色素の組み合わせを使用してください。Cytometerは、細胞を染色した後、細胞染色バッファー1ミリリットルを添加し、1分間回転させることにより、細胞染色バッファーで細胞染色バッファーで洗浄します。
スピンに続く10, 000 Gsで、仰臥位の薬剤を廃棄し、その後、パレットを100〜200マイクロリットルの細胞染色緩衝液に再懸濁して、後の分析のための即時フローサイトメトリー分析を行います。Reusは、PBSで調製した2%parのホルムアルデヒドに細胞を懸濁し、摂氏4度で一晩保存します。ここに示されているのは、得られた単核細胞をFCブロックでインキュベートし、続いて抗CD45、CD4、およびCD19抗体です。
フローサイトメトリーにより実証されたプロトコールに従って、CD45染色は、CD45、DIM監視ミクログリアからCD45高血行性細胞を良好に分離する。この図は、ナイーブから単離された細胞と、実験的自己免疫性脳脊髄炎を発症するように誘導されたマウスから炎症を起こした脳とを比較したものです。CD 45 PCの強度は、ナイーブな脳で3つの異なる集団が視覚化されるY軸上に示されています。
CD 45高細胞の数は非常に少ないです。通常、孤立した総人口の2%未満です。これに対し、EAEに罹患したマウスの脳は、脳に動員された血液細胞の大量流入を示しています。
CD11b、CD4、CD8などの他の細胞表面マーカーの添加は、CD45高集団のさらなる特徴付けを可能にする。この手順に参加する際には、フローサイトメトリーによる免疫表現型と組み合わせた組織学的アプローチが、CNS炎症性浸潤物の組成を完全に特徴付けるために重要であることを覚えておくことが重要です。
完全なトランスクリプトを表示し、数千本の科学動画にアクセス
概要
この記事では、脳と脊髄組織から単核細胞を分離し、フローサイトメトリ分析を容易にする迅速なプロトコルを提示します。この方法は従来の技術と比較して効率性を高めます。
主要な研究構成要素
科学の分野
- 神経科学
- 細胞生物学
- 免疫学
背景
- 様々な中枢神経系疾患において、免疫細胞の浸潤が見られます。
- 組織化学的方法には抗体使用に制限があります。
- フローサイトメトリにより、免疫細胞集団の詳細な分析が可能になります。
- 迅速な分離技術により研究効率を向上させることができます。
研究目的
- 中枢神経系組織から単核細胞を分離する迅速な方法を開発すること。
- これらの細胞の効果的なフローサイトメトリ分析を可能にすること。
- 疾患状態における血液由来細胞とミクログリアを区別すること。
使用された方法
- 脳と脊髄組織の解剖とホモジネーション。
- 細胞分離のためのパーコル勾配の設定。
- インターフェースから単核細胞を回収するための遠心分離。
- フローサイトメトリ用抗体による細胞の洗浄と染色。
主要な結果
- 単核細胞の効率的な分離が達成されました。
- フローサイトメトリにより細胞集団の分析が可能になりました。
- 疾患状態における免疫細胞の相対的な割合が決定されました。
- この方法は既存の技術と比較して時間がかかりません。
結論
- この迅速な分離プロトコルはフローサイトメトリ分析に効果的です。
- この技術は中枢神経系における免疫反応の研究を強化できます。
- 今後の研究は、この方法の向上した効率性から恩恵を受けることができます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Efficient isolation of CNS-infiltrating mononuclear cells is critical for de-risking neuroinflammation targets and enabling high-confidence immune phenotyping in neurodegenerative and autoimmune disease models. This protocol supports rapid, reproducible preparation of brain and spinal cord immune cell suspensions, directly impacting early discovery and translational research pipelines. By facilitating robust flow cytometry-based characterization, it enhances predictive confidence and portfolio triage for CNS-targeted therapeutics.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of immune cell infiltration mechanisms in CNS disease models.
- Supports functional target validation by distinguishing hematogenous cells from resident microglia.
- Provides quantitative immune cell composition data for mechanistic de-risking.
- Facilitates portfolio triage by clarifying immune involvement in neuroinflammatory pathologies.
Screening & Assay Development
- Prepares validated CNS-derived cell suspensions for downstream flow cytometry assays.
- Standardizes immune cell isolation, improving reproducibility across studies and teams.
- Delivers quantitative outputs suitable for screening compound effects on immune cell populations.
- Enables scalable processing of multiple samples, supporting high-throughput workflows.
Translational & Preclinical Research
- Aligns immune phenotyping with disease-relevant CNS models for translational biomarker discovery.
- Ensures continuity from early discovery through preclinical validation of neuroimmune targets.
- Supports risk-adjusted advancement decisions by providing robust immune cell readouts.
- De-risks mechanistic hypotheses regarding CNS immune infiltration in disease progression.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol integrates at the interface of early discovery, target validation, and preclinical immune profiling in CNS research pipelines.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing on immune cell infiltration and CNS pathology relationships.
- Screening: Provides reproducible, quantitative immune cell suspensions for assay development and compound screening.
- Analytics: Delivers flow cytometry-based measurements to compare immune cell populations across conditions.
- Translational Research: Connects immune phenotyping outputs to disease models for biomarker alignment.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized, scalable workflow for CNS immune cell isolation across programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in neuroimmune target validation and reduces mechanistic ambiguity.
- Operational Value: Improves standardization, reproducibility, and scalability of CNS immune cell isolation.
- Strategic Value: Enables better go/no-go decisions and reduces late-stage biological risk in neuroinflammation portfolios.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of CNS-targeted therapeutic programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in CNS tissue dissection and flow cytometry analysis.
- Needs access to centrifugation equipment and validated antibody panels.
- Demands cross-team standardization of gradient setup and antibody titration.
- Adaptable to both naive and inflamed CNS tissues, with yield variability based on disease state.
- Careful gradient layering and temperature control are critical for optimal cell recovery and purity.
