Name: パーコール勾配を用いて脳と脊髄単核細胞の単離 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-02T17:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 58 s
Description: 学ぶパーコール勾配を用いたマウス脳・脊髄単核細胞単離法。組織を均質化し、30%と70%の不連続勾配で遠心分離後、界面から免疫細胞を回収します。フローサイトメトリーによる詳細な免疫表現型解析が可能となり、神経免疫学研究に有用です。

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この作品は、全国多発性硬化症協会（TA AECへの3021 - A1 / T）とテキサス大学サンアントニオ校によってサポートされていました。

試薬の調製 CAがない場合10X HBSSの一部でパーコールの9部を混合することにより、株式等張パーコール（SIP）、脳あたり4 mlを、準備+ +およびMg + +。 15 mlのポリプロピレンコニカルチューブに分注し、脳当たりのCa + +およびMg + +、2 mlのなく1X HBSSで70％でSIPを準備します。 注：これは、パーコールは室温で使用されることをお勧めします、風邪を使用する場合、細胞が塊に傾向があると細胞分離が少なく効率的です。 組織の収集と均質化氷冷した1 × HBSSで左心室経由でマウスと浸み込ませるの麻酔。脳と脊髄を摘出し、すべてのマウスを屠殺されるまで、フェノールレッドを含まないRPMIで維持する。 RPMI 3mlを含む7または15ミリリットルダウンスホモジナイザーの場所の組織は、優しく、さらに組織を解離するために締め付けフィッティング乳棒（Bサイズ）に続く、緩い乳棒（サイズ）で細胞懸濁液を作る。 RPMIで7 mlに細胞懸濁液の体積を完了します。 勾配は、セットアップ最終的に30％のSIPを作るために細胞懸濁液に、SIPの3 mlを加え徐々に層の70％SIPの上に10 mLの細胞懸濁液。これはプロシージャの中で最も重要なステップであり、70％、30％溶液の混合回避重力モードで設定されたピペットエイドを使用してください。非常に明確なフラットラインは70％-30％の接合部で表示する必要があります。 500G 18℃で30分間遠心操作する相間が乱されないように遠心分離機が最小限、あるいはまったくブレーキで停止することを確認してください。 転送ピペットを用いて、軽くチューブの上部からごみの層を除去し、1X HBSS 8mlを含むきれいなコニカルチューブに70％-30％の相間の2.0〜3.0ミリリットルを収集する。相間を含むパーコールは、3倍程度希釈されていることを確認し、18で500Gで反転しcentrifugre 7分で数回混ぜる℃に懸濁します細胞染色緩衝液1mlでペレットとは、1.5 mlチューブに移すと4℃で10,000 G 1分間℃でマイクロ遠心機を使用して、1つより多くの時間を洗う抗体染色ヤギCD16/CD32を精製した50μlに再懸濁し、ペレットは、Fc結合部位をブロックするために細胞の染色バッファーで1:200に希釈した。 10分間氷の上にインキュベートする。血球計算板を用いて細胞を数える。 氷上で30分間抗体のカクテルミックスとインキュベート（50μl）を加えます。各抗体は、最初に最適な希釈を評価するために滴定する必要があります。レーザーと、特定のフローサイトメーターのフィルタ設定の機能に従って、選択した適切な蛍光色素の組み合わせを使用してください。 細胞の染色バッファ100〜200μlの細胞の染色バッファー、再懸濁し、ペレットに細胞を洗浄し、血球計算器で直ちに分析し、あるいは細胞は4℃のPBSで調製した2％パラホルムアルデヒド（PFA）に再懸濁し、一晩保存することができます° C 。 代表的な結果： グラデーションを回転した後、70％-30％の相間には定義されている白いハロを持っているはず、と素朴なマウスから回収された細胞の定量は、マウスにつき3〜5 × 10 5細胞（脳プラス脊髄）でなければなりません。炎症を起こした脳は中枢神経系の侮辱や疾患モデル（図1）によって炎症細胞数の範囲かもしれない。 <img src="/files/ftp_upload/2348/2348fig1.jpg" alt="図1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図1"> 図1ピーク疾患におけるナイーブおよびEAE -脳から単核細胞の単離。脳細胞の懸濁液は、不連続70％/ 30％パーコール勾配を介して分離した。染色した細胞を氷上で30分間抗CD45抗体が続くのFc -ブロックとインキュベートした。細胞は、細胞の染色バッファーでリンスし、そしてLSR - IIの2％PFA買収前に修正されました。 CD45の強度は、3つの異なった集団が可視化するY軸、に測定されます。 CD45 ハイテク浸潤細胞の免疫表現型のさらなる特徴は、追加の抗体を使用して実装し、続いてフローサイトメトリーによって分析されます。

<ol><li>Sedgwick, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+direct+characterization+of+resident+microglial+cells+from+the+normal+and+inflamed+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Isolation and direct characterization of resident microglial cells from the normal and inflamed central nervous system.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88, 7438-7442 (1991).</li>
<li>Ponomarev, E. D., Shriver, L. P., Maresz, K., Dittel, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglial+cell+activation+and+proliferation+precedes+the+onset+of+CNS+autoimmunity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Res%22%5BJournal%5D)">Microglial cell activation and proliferation precedes the onset of CNS autoimmunity.</a> J. Neurosci. Res. 81, 374-389 (2005).</li>
<li>Ford, A. L., Goodsall, A. L., Hickey, W. F., Sedgwick, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normal+adult+ramified+microglia+separated+from+other+central+nervous+system+macrophages+by+flow+cytometric+sorting.+Phenotypic+differences+defined+and+direct+ex+vivo+antigen+presentation+to+myelin+basic+protein-reactive+CD4%2B+T+cells+compared%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Normal adult ramified microglia separated from other central nervous system macrophages by flow cytometric sorting. Phenotypic differences defined and direct ex vivo antigen presentation to myelin basic protein-reactive CD4+ T cells compared.</a> J Immunol. 154, 4309-4321 (1995).</li>
<li>Cardona, A. E., Huang, D., Sasse, M. E., Ransohoff, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+murine+microglial+cells+for+RNA+analysis+or+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Isolation of murine microglial cells for RNA analysis or flow cytometry.</a> Nat. Protoc. 1, 1947-1951 (2006).</li>
<li>Juedes, A. E., Ruddle, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resident+and+infiltrating+central+nervous+system+APCs+regulate+the+emergence+and+resolution+of+experimental+autoimmune+encephalomyelitis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Resident and infiltrating central nervous system APCs regulate the emergence and resolution of experimental autoimmune encephalomyelitis.</a> J. Immunol. 166, 5168-5175 (2001).</li>
<li>Prinz, M., Priller, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tickets+to+the+brain%3A+Role+of+CCR2+and+CX%283%29CR1+in+myeloid+cell+entry+in+the+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroimmunol%22%5BJournal%5D)">Tickets to the brain: Role of CCR2 and CX(3)CR1 in myeloid cell entry in the CNS.</a> J Neuroimmunol. , (2010).</li>
<li>Mildner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+in+the+adult+brain+arise+from+Ly-6ChiCCR2%2B+monocytes+only+under+defined+host+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Microglia in the adult brain arise from Ly-6ChiCCR2+ monocytes only under defined host conditions.</a> Nat. Neurosci. 10, 1544-1553 (2007).</li>
<li>Djukic, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+monocytes+engraft+in+the+brain%2C+differentiate+into+microglia+and+contribute+to+the+pathology+following+meningitis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Circulating monocytes engraft in the brain, differentiate into microglia and contribute to the pathology following meningitis in mice.</a> Brain. 129, 2394-2403 (2006).</li>
</ol>

利害の衝突は宣言されません。

正常および炎症のマウス組織から中枢神経系の白血球の細胞表面マーカーの分析は、1月3日数十年にわたって利用されている。分離プロトコルは密度遠心4によるミクログリアと白血球の分離に基づいています。ここでは、不連続パーコール勾配を用いて、CNSの白血球を分離するの迅速かつ効果的な方法を説明します。細胞の単離の後、次のような - ではなく、CD45に限られた種々の抗体で染色、CD4、CD8、CD11b、CD19、など特定の病理学の誘導時にCNSに浸潤する免疫個体群の同定が可能になります。他の神経細胞間の神経細胞、アストロサイトやオリゴデンドロサイトで構成される（1）CD45陰性人口、（2）CD45 LOまたは中間（3）、主に監視者ミクログリア細胞を含む、抗CD45抗体で染色すると、フローサイトメトリーによるつの異なる集団を明らかに血行性白血球の浸潤から成るCD45 ハイテクの人口。中枢神経系の病理の間に骨髄細胞の寄与を研究することに挑戦されています。しかし、様々な細胞表面マーカー5、6、骨髄キメラマウスの使い方の組み合わせは、CNSの炎...

組織の均質化とグラデーション<ul><li>パーコール（Amersham社） </li><li>カルシウムとマグネシウムのない10Xハンクス平衡塩溶液、（ギブコ） </li><li>フェノールレッドを含まないRPMI培地1640（Gibco社） </li><li> 7 - mlまたは15 mlのダウンスティッシュグラインダ（VWR） </li></ul>フローサイトメトリー<ul><li>細胞の染色バッファー（Biolegend） </li><li>精製ラット抗マウスCD16/CD32（マウスBD Fcをブロック）、BD Pharmingen社</li><li>血球計（フィッシャー） </li><li>抗マウスCD45（クローン30 - F11）、CD4（クローンRM4 - 5）、CD19（クローン6D5）、BioLegend </li><li> 10Xリン酸塩はカルシウムとマグネシウムなしで、緩衝生理食塩水（サーモサイエンティフィック） </li><li>パラホルムアルデヒド（シグマアルドリッチ） </li><li> LSR II（BD Biosciences社）を使用して実行フローサイトメトリー分析</li></ul>

パーコール勾配を用いて脳と脊髄単核細胞の単離

Isolation of Brain and Spinal Cord Mononuclear Cells Using Percoll Gradients

感染症、外傷、自己免疫疾患または神経変性における中枢神経系（CNS）に浸潤する免疫細胞の単離は、しばしばそれらの表現型とエフェクター機能を定義する必要があります。組織化学的アプローチは、浸潤細胞の位置を決定するために、病理関連したCNSを分析するための手段です。しかし、現場組織化学および免疫蛍光染色の技法は、特定の組織に免疫細胞のサブタイプを特徴付けるために一度に使用できる抗体の数によって制限されています。したがって、フローサイトメトリーによる免疫フェノタイピングと一緒に組織学的なアプローチは、完全にローカルのCNS浸潤の組成を特徴づけるために不可欠です。このプロトコルは、不連続パーコール勾配以上のCNSの細胞懸濁液の分離に基づいています。現在の記事は、効率的効果的にフローサイトメトリーにより、単一のサンプル中の様々な免疫細胞集団の同定に利用することができる脳や脊髄の組織から単核細胞を単離するために迅速なプロトコルを記述します。

現在の記事は、効率的効果的にフローサイトメトリー分析に利用することができる脳や脊髄の組織から単核細胞を分離するために迅速なプロトコルを記述します。

感染、外傷、自己免疫疾患、または神経変性疾患の際に中枢神経系（CNS）に浸潤する免疫細胞の分離は、しばしば必要とされます...

感染、外傷、自己免疫疾患、または神経変性疾患において、免疫細胞が中枢神経系に浸潤します。浸潤細胞の部位の特定や関連する病理学的解析に組織化学的なアプローチを用いることができますが、これらの手法は同時に使用できる抗体数に制限があります。本手法では、脳および脊髄組織から単核細胞を迅速に単離する方法を示しており、まず摘出した組織をホモジナイズします。次に、ペリコール勾配を形成し、遠心分離後、界面から単核細胞を回収します。最後に、細胞を洗浄し、抗体で染色します。フローサイトメトリー解析を通じて、血行性細胞と監視状態のミクログリアを区別し、疾患状態におけるそれらの相対的な割合を決定できます。アリザリン勾配や組織化学的手法などの既存の方法と比較した本手法の主な利点は、所要時間が短いことです。これにより、より多くの組織を同時に処理することが可能になります。グラジエントの設定手順については、私の研究室の技術者が実演します。本プロトコルに必要な試薬を準備してください。まず、脳1個あたり4 mLの等張ペルオールストック液（SIPと呼称）を用意します。この操作を行うには、perol 9部とカルシウムおよびマグネシウムを含まない10倍濃度HBSS 1部を合わせ、転倒混和します。次に、調製したSIPとカルシウムおよびマグネシウムを含まない1倍濃度HBSSを混合し、70% per callを調製します。その後、組織を回収するために、70% per cole 2 mLを15 mLポリプロピレン製コニカルチューブに分注します。この手順では、解剖したすべての研究用マウスの脳と脊髄を、氷上の10 mLのRPMIを含むビーカーに入れます。次に、組織を、3 mLの1倍HBSSを含む7 mLまたは15 mLのダウンホモジナイザーに移します。まず緩いサイズのペッスルを用いて緩やかに細胞懸濁液を作成し、その後、密着度の高いサイズBのペッスルに切り替えて、組織をさらに解離させます。組織のホモジナイズが完了したら、最終容量が7 mLになるようにRPMIまたは1倍HBSSを加え、PERCOCO勾配の作製に進みます。まず、細胞懸濁液に3 mLのSIPを加え、最終的なPERCOCO濃度を30%にします。なお、PERCOCOは室温で使用してください。冷えた状態で使用すると、細胞が凝集しやすくなり、細胞分離の効率が低下します。次に、ピペットエイドをグラビティモードに設定し、10 milliliterの細胞懸濁液を70%SIPの上にゆっくりと重層します。70%溶液と30%溶液が混ざり合わないように注意してください。これが本手順において最も重要なステップです。70%と30%の境界に、非常に明確な水平線が見えるはずです。一般的に、この方法に不慣れな方は、積層中に3層目と70%の溶液が混ざり合ってしまうため、苦労することがあります。次のステップとして、界面を安定させるため、18°Cで500 Gにて30分間遠心分離を行います。界面が乱れないよう、遠心分離機をブレーキなしまたは最小限のブレーキで停止させるようにしてください。勾配遠心後、チューブの最上部に厚く粘性のあるデブリ層が蓄積します。その次の層は黄色い30% Percoll層であり、ここにデブリが含まれている場合があります。次は70%と30%の界面で、ここには明確な白いハロー（後光状の帯）が見え、単核細胞が含まれています。最後に、チューブの底部には透明な70% Percoll層があります。界面が観察されない場合、細胞の回収率は非常に低くなる可能性が高く、その後の解析が極めて困難になります。したがって、この時点で、コンタミネーションを減らすために新鮮な細胞懸濁液が必要になる場合があります。チューブ上部のデブリ層を慎重に取り除き、廃棄します。次に、プラスチックピペットを使用して、上層の30%を通過し、70 30界面の2〜3 mLを回収して、8 mLの1× HBSSを含む清潔なコニカルチューブに移します。希釈した界面を転倒混和で数回混ぜた後、18 °Cで500 GSにて7分間遠心分離します。遠心後、上清を除去し、ペレットを再懸濁します。1 mLの細胞染色バッファーを用いて、細胞懸濁液を1.5 mLチューブに移し、もう一度洗浄します。抗体染色に進む前に、4°Cで1分間、10,000 GSでマイクロ遠心分離機を用いて遠心分離を行います。次に、Fc結合部位をブロックするため、細胞染色バッファーで1:200に希釈した50 µLの精製抗US CD 16, CD 32にペレットを再懸濁します。あらゆる染色手順と同様に、すべての抗体を適切にタイトレーションすることが不可欠です。氷上で10分間インキュベートします。インキュベーション中に、2〜5 µLの細胞を分注し、血球計数計を用いて細胞数をカウントします。正常な脳および脊髄組織を合わせたもので、マウス1匹あたり約3～5×10⁵個の細胞が得られるはずです。炎症を起こした脳に含まれる炎症細胞の数は、採取した時点や疾患モデルによって異なります。CD16およびCD32でのインキュベーション後、免疫細胞特異的抗体カクテルミックスを50 µL添加します。この例で使用したミックスには、CD45、CD4、およびCD19に対する抗体が含まれています。氷上で30分間インキュベートしてください。重要な点として、各抗体はまずタイトレーションを行う必要があります。最適な希釈倍率を評価するために、使用するフローサイトメーターのレーザーおよびフィルター設定の性能に応じて選択した適切なフルオロクロムの組み合わせを使用してください。細胞を染色した後、細胞染色バッファーを1 mL加え、1分間遠心分離することで、細胞染色バッファーで洗浄します。遠心後、10,000 Gsで上清を除去し、ペレットを100から200 µLの細胞染色バッファーに再懸濁して、直ちにフローサイトメトリー解析または後の解析に供します。細胞をPBSで調製した2%パラホルムアルデヒドに再懸濁し、4 °Cで一晩保存します。ここでは、単核細胞を回収し、FCブロックで処理した後、抗CD45、CD4、およびCD19抗体でインキュベートした様子を示しています。フローサイトメトリーによるCD 45染色の実証済みプロトコルに従うことで、CD 45高発現の造血細胞と、CD 45低発現（DIM）の監視マイクログリアを良好に分離できます。この図では、ナイーブマウスおよび実験的自己免疫性脳脊髄炎を誘導した炎症マウスの脳から単離した細胞を比較しています。Y軸にCD 45のAPC強度を示しており、ナイーブ脳においては3つの異なる細胞集団が可視化されています。CD 45高発現細胞は極めて少数しか検出されません。通常、単離された全細胞集団の2%未満です。対照的に、EAE罹患マウスの脳では、脳へ動員された血球細胞の大量の流入が認められます。CD 11 b、CD 4、CD 8などの他の細胞表面マーカーを追加することで、CD 45 high集団をさらに詳細に特性解析することが可能です。この手法を習得し、適切に実施すれば、3〜4時間で完了させることができます。本手順を行う際は、中枢神経系（CNS）の炎症性浸潤物の構成を完全に特性解析するためには、フローサイトメトリーによる免疫表現型解析と組織学的アプローチを併用することが不可欠であるという点に留意することが重要です。

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