パーコール勾配を用いて脳と脊髄単核細胞の単離

感染、外傷、自己免疫疾患、または神経変性疾患において、免疫細胞が中枢神経系に浸潤します。浸潤細胞の部位の特定や関連する病理学的解析に組織化学的なアプローチを用いることができますが、これらの手法は同時に使用できる抗体数に制限があります。本手法では、脳および脊髄組織から単核細胞を迅速に単離する方法を示しており、まず摘出した組織をホモジナイズします。

次に、ペリコール勾配を形成し、遠心分離後、界面から単核細胞を回収します。最後に、細胞を洗浄し、抗体で染色します。フローサイトメトリー解析を通じて、血行性細胞と監視状態のミクログリアを区別し、疾患状態におけるそれらの相対的な割合を決定できます。アリザリン勾配や組織化学的手法などの既存の方法と比較した本手法の主な利点は、所要時間が短いことです。

これにより、より多くの組織を同時に処理することが可能になります。グラジエントの設定手順については、私の研究室の技術者が実演します。本プロトコルに必要な試薬を準備してください。まず、脳1個あたり4 mLの等張ペルオールストック液（SIPと呼称）を用意します。

この操作を行うには、perol 9部とカルシウムおよびマグネシウムを含まない10倍濃度HBSS 1部を合わせ、転倒混和します。次に、調製したSIPとカルシウムおよびマグネシウムを含まない1倍濃度HBSSを混合し、70% per callを調製します。その後、組織を回収するために、70% per cole 2 mLを15 mLポリプロピレン製コニカルチューブに分注します。

この手順では、解剖したすべての研究用マウスの脳と脊髄を、氷上の10 mLのRPMIを含むビーカーに入れます。次に、組織を、3 mLの1倍HBSSを含む7 mLまたは15 mLのダウンホモジナイザーに移します。まず緩いサイズのペッスルを用いて緩やかに細胞懸濁液を作成し、その後、密着度の高いサイズBのペッスルに切り替えて、組織をさらに解離させます。

組織のホモジナイズが完了したら、最終容量が7 mLになるようにRPMIまたは1倍HBSSを加え、PERCOCO勾配の作製に進みます。まず、細胞懸濁液に3 mLのSIPを加え、最終的なPERCOCO濃度を30%にします。なお、PERCOCOは室温で使用してください。冷えた状態で使用すると、細胞が凝集しやすくなり、細胞分離の効率が低下します。

次に、ピペットエイドをグラビティモードに設定し、10 milliliterの細胞懸濁液を70%SIPの上にゆっくりと重層します。70%溶液と30%溶液が混ざり合わないように注意してください。これが本手順において最も重要なステップです。

70%と30%の境界に、非常に明確な水平線が見えるはずです。一般的に、この方法に不慣れな方は、積層中に3層目と70%の溶液が混ざり合ってしまうため、苦労することがあります。次のステップとして、界面を安定させるため、18°Cで500 Gにて30分間遠心分離を行います。

界面が乱れないよう、遠心分離機をブレーキなしまたは最小限のブレーキで停止させるようにしてください。勾配遠心後、チューブの最上部に厚く粘性のあるデブリ層が蓄積します。その次の層は黄色い30% Percoll層であり、ここにデブリが含まれている場合があります。

次は70%と30%の界面で、ここには明確な白いハロー（後光状の帯）が見え、単核細胞が含まれています。最後に、チューブの底部には透明な70% Percoll層があります。界面が観察されない場合、細胞の回収率は非常に低くなる可能性が高く、その後の解析が極めて困難になります。

したがって、この時点で、コンタミネーションを減らすために新鮮な細胞懸濁液が必要になる場合があります。チューブ上部のデブリ層を慎重に取り除き、廃棄します。次に、プラスチックピペットを使用して、上層の30%を通過し、70 30界面の2〜3 mLを回収して、8 mLの1× HBSSを含む清潔なコニカルチューブに移します。

希釈した界面を転倒混和で数回混ぜた後、18 °Cで500 GSにて7分間遠心分離します。遠心後、上清を除去し、ペレットを再懸濁します。1 mLの細胞染色バッファーを用いて、細胞懸濁液を1.5 mLチューブに移し、もう一度洗浄します。

抗体染色に進む前に、4°Cで1分間、10,000 GSでマイクロ遠心分離機を用いて遠心分離を行います。次に、Fc結合部位をブロックするため、細胞染色バッファーで1:200に希釈した50 µLの精製抗US CD 16, CD 32にペレットを再懸濁します。あらゆる染色手順と同様に、すべての抗体を適切にタイトレーションすることが不可欠です。氷上で10分間インキュベートします。インキュベーション中に、2〜5 µLの細胞を分注し、血球計数計を用いて細胞数をカウントします。

正常な脳および脊髄組織を合わせたもので、マウス1匹あたり約3～5×10⁵個の細胞が得られるはずです。炎症を起こした脳に含まれる炎症細胞の数は、採取した時点や疾患モデルによって異なります。CD16およびCD32でのインキュベーション後、免疫細胞特異的抗体カクテルミックスを50 µL添加します。この例で使用したミックスには、CD45、CD4、およびCD19に対する抗体が含まれています。氷上で30分間インキュベートしてください。

重要な点として、各抗体はまずタイトレーションを行う必要があります。最適な希釈倍率を評価するために、使用するフローサイトメーターのレーザーおよびフィルター設定の性能に応じて選択した適切なフルオロクロムの組み合わせを使用してください。細胞を染色した後、細胞染色バッファーを1 mL加え、1分間遠心分離することで、細胞染色バッファーで洗浄します。

遠心後、10,000 Gsで上清を除去し、ペレットを100から200 µLの細胞染色バッファーに再懸濁して、直ちにフローサイトメトリー解析または後の解析に供します。細胞をPBSで調製した2%パラホルムアルデヒドに再懸濁し、4 °Cで一晩保存します。ここでは、単核細胞を回収し、FCブロックで処理した後、抗CD45、CD4、およびCD19抗体でインキュベートした様子を示しています。

フローサイトメトリーによるCD 45染色の実証済みプロトコルに従うことで、CD 45高発現の造血細胞と、CD 45低発現（DIM）の監視マイクログリアを良好に分離できます。この図では、ナイーブマウスおよび実験的自己免疫性脳脊髄炎を誘導した炎症マウスの脳から単離した細胞を比較しています。Y軸にCD 45のAPC強度を示しており、ナイーブ脳においては3つの異なる細胞集団が可視化されています。

CD 45高発現細胞は極めて少数しか検出されません。通常、単離された全細胞集団の2%未満です。対照的に、EAE罹患マウスの脳では、脳へ動員された血球細胞の大量の流入が認められます。

CD 11 b、CD 4、CD 8などの他の細胞表面マーカーを追加することで、CD 45 high集団をさらに詳細に特性解析することが可能です。この手法を習得し、適切に実施すれば、3〜4時間で完了させることができます。本手順を行う際は、中枢神経系（CNS）の炎症性浸潤物の構成を完全に特性解析するためには、フローサイトメトリーによる免疫表現型解析と組織学的アプローチを併用することが不可欠であるという点に留意することが重要です。