腹腔内感染後に免疫細胞の人身売買蛍光プリオンロッドの時間を監視

この手順の主な目的は、感染後数時間以内における免疫細胞によるプリオンの取り込みと輸送をモニタリングすることです。まず、感染脳から凝集したプリオンロッドを精製し、蛍光色素で標識します。次に、これらのプリオンロッドをマウスの腹腔内に接種します。2時間後、腹腔、脾臓、および縦隔・腸間膜リンパ節から細胞を回収します。最後に、回収した細胞を免疫表現型マーカーで染色し、プリオンの保持を分析します。

例えば、フローサイトメトリーの結果を用いて、プリオンロッドが主にマクロファージと樹状細胞によって保持および輸送され、次いで単球、さらにB細胞によって輸送されることを示すことができます。この実験系は、感染直後にどの細胞がPreOnを取り込むのか、それらをどこへ運び、どのくらいの速さで到達するのかといった重要な疑問に答えることで、プリオンのリザーバー（貯蔵庫）と潜在的な治療標的に光を当てるよう設計されています。

この手順の実演を行うのは、私の研究室の大学院生であるCrystal、Mt.And Brady Michaelです。PreOnタンパク質を回収するため、PreOnに感染した脳組織100 mgを、氷冷した900 mLのホモジナイズ緩衝液中で、市販のブレンダーを用いて最大速度で1分間ホモジナイズし、直ちに氷上で2分間静置します。タンパク質の収量を増やすため、この工程を3回繰り返します。

ホモジネートを 3000 Gs、4 °C で 10 分間遠心分離します。上清を除去し、氷上で保存します。ペレットを 1 L の hp で再懸濁し、ホモジナイズと遠心分離の手順を繰り返します。

次に、snatを合わせて、0 °Cで100,000 gで60分間遠心分離します。上清を捨てます。ペレットを100 mLのTBSTで再懸濁します。

Bradford法でタンパク質濃度を測定し、TBSTを用いてタンパク質濃度を5 mg/mLに調整する。氷上で30分間冷却する。再度、0 °Cで100,000 gで30分間遠心分離を行う。

SNAを捨て、まず50 millilitersのTBSTでペレットを洗浄します。次に、得られたペレットを1% sarcas sealおよびproteus inhibitor cocktailを含む100 millilitersのone XPBSに再懸濁し、37 degrees Celsiusで120分間撹拌します。ショ糖密度勾配遠心を行うには、サンプルを900 millilitersの320 millimolar sucroseの上に重層し、60分間遠心分離します。

100,000 g、10 °Cで遠心分離します。上清を捨て、ペレットを10 mLの2.3 M 塩化ナトリウム、5% Sarcosylに再懸濁します。次に、最大出力の70%で40秒間の超音波処理を、1分間隔で5回行います。

サンプルの1 mLをエッペンドルフチューブに入れ、4 °Cで13,000 ×gにて15分間遠心分離します。ペレットをTBSで2回洗浄し、ストックを-70 °Cで保存します。製造元のプロトコルに従い、DITE 649蛍光色素1バイアルを用いて、精製したPreOn rod 1本分のチューブを共役させます。

最後に、フィルターカラムを用いた遠心分離により、ダイラベル用バッファーをPBSに交換します。20 µLずつ分注し、使用時まで遮光して-70 °Cで保存してください。このセクションでは、腹腔内への投与、プリオンの接種、およびD loop蛍光プリオンを使用する直前に行う、腹腔、縦隔および腸間膜リンパ節、ならびに脾臓からの細胞回収について説明します。

PBS scruff miceを1匹から50匹まで、親指と人差し指で背中の首皮を掴んで固定します。マウスをゆっくりとこちらに向け、小指で尾を固定します。マウスを仰向けにし、後躯を頭より高く持ち上げて、わずかに逆さまの状態にして保持します。

30ゲージのインスリン注射器を用いて、蛍光パイオンロッド100 µLを、正中線から外側に1 cm、仙腸関節から前方に1～2 cmの部位に注入します。針を皮膚から1 cm挿入し、45度内側に向けます。対照群のマウスには、蛍光ビーズの1/50希釈液またはPBSのみを使用します。実験計画に従い、解析を開始するまでマウスを規定の時間インキュベートします。

承認された動物実験委員会のプロトコルに従って、マウスを安楽死させます。12 mLシリンジと25G針を用いて、PBS 10 mLを腹腔内に注入します。マウスを前後方向に1分間ゆっくりと揺らした後、マウスの解剖に進みます。

70%ethanolを用いてマウスの腹側の被毛を十分に濡らします。肋骨直下の正中線にある皮膚をピンセットで持ち上げ、ハサミで皮膚に小さな切開を加えます。そこから頭側と尾側の両方向に3〜5cmの長さで皮膚を切開します。

正中線から外側へ2 cmの切開を両端に入れ、皮膚を剥離してピンで固定し、腹腔と胸腔を露出させます。16ゲージの針を装着した同じシリンジを使用して、腹腔から細胞懸濁液を回収します。滲出液を15 mLコニカルチューブに入れ、氷上で保存します。

腹膜を包む薄い半透明の膜を慎重に切開し、胸部を反転させて縦隔を露出させます。次に、気管の腹側付近で、腕頭動脈に内側で隣接し、胸腺のわずかに背側および外側に位置する縦隔リンパ節を2～4個見つけて摘出します。続いて、腸を後腹壁に固定している白色の柔らかい腸間膜組織に埋もれている腸間膜リンパ節を、最大6個まで見つけて摘出します。

摘出したリンパ節は、解剖が完了するまで1 mLのPMI 1640培地に入れ、氷上で保存します。最後に、脾臓を探して摘出します。脾臓は、マウスの左側で正中線のすぐ外側、腸の背側に位置する、細長い暗赤色の臓器です。

1 mLシリンジのプランジャーを用いてリンパ節をすり潰し、40 µmのメッシュストレーナーを通して、プラスチック製ペトリ皿に入れた3 mLのPBS中に押し出します。ストレーナーをさらに2 mLのPBSで洗浄し、合計5 mLの細胞懸濁液を15 mLコニカルチューブに移します。また、ペトリ皿をさらに5 mLのPBSで洗浄し、同じチューブに移します。

サンプルを250 gsで5分間遠心分離します。上清を捨て、細胞ペレットを再懸濁します。分離した細胞を1 mLのfaxバッファーとともに1.5 mLのEORチューブに移します。

通常、この染色プロトコルは、十分に特性解析された免疫細胞表面マーカーに対する蛍光抗体を用い、免疫細胞サブセットを同定するために使用できます。すべての抗体を FACS バッファーに溶解させます。使用直前に、細胞数をカウントし、10⁶ 個の細胞をエッペンドルフチューブに分注します。遠心分離によって細胞をペレット化し、1 mL の FACS バッファーでペレットを 2 回洗浄して、内因性 FC 受容体をブロックします。

細胞を2 ng/mLのラット抗US CD 163抗体100 µLとともに氷上で20分間インキュベートし、遠心してペレット化させ、FACSバッファーで洗浄します。次に、各サンプルに1 ng/mLの適切な蛍光標識抗体を100 µL加え、氷上で1時間インキュベートします。コントロール細胞にはFACSバッファーのみを100 µL加え、同様に遠心してペレット化させ、FACSバッファーで2回洗浄します。

細胞を1 mLのactバッファーで再懸濁し、氷上で1分間インキュベートします。赤血球を溶血させるため、細胞をペレット化してfaxバッファーで洗浄し、その後、細胞を1 mLのfaxバッファーで再懸濁します。通常、405 nm、488 nm、および633 nmの励起レーザーと5〜10個の蛍光検出器を備えたフローサイトメーターでサンプルを分析します。

粗プリオンである感染脳ホモジネートには、プリオンが高度に濃縮されています。精製プロセスでは、E2エルク脳ホモジネートの界面活性剤による可溶化および超遠心分離が行われます。得られた産物はプロテアーゼ耐性を有します。

特定の細胞集団におけるK耐性fax解析により、抗原提示細胞が2時間以内に腹腔へ遊走し、蛍光ビーズおよびプリオンロッドを保持していることが示されました。ビーズおよびプリオンを接種したマウスの細胞では、特に単球、樹状細胞、およびマクロファージにおいて顕著な蛍光が認められました。

PreOnを担う単球、樹状細胞、およびマクロファージが縦隔リンパ節でも認められました。接種から2時間後、経口または腸間膜リンパ節にはビーズおよびPreOnロッドは検出されませんでした。本実験のビデオでは、腹腔内投与を行うために感染脳から凝集したプリオンロッドを精製するいくつかのプロトコル、リンパ節を正しく同定および分離する方法、そして最終的に免疫細胞を分離し染色する方法について解説しています。