モーターニューロンとターゲットゼブラフィッシュの骨格筋からの対のパッチクランプ記録

この手順の全体的な目的は、運動ニューロンの活動電位と、それに伴う標的筋肉におけるシナプス応答を同時に電気生理学的に記録することです。まず、魚の上面の皮膚を除去します。次に、上層にある背側の筋肉細胞をすべて除去することで、脊髄を露出させます。

手順の3番目のステップは、緩筋の上層を取り除いて、標的となる速筋を露出させることです。手順の最終ステップは、コドル一次ニューロンまたはキャップニューロンをカレントクランプし、標的の骨格筋をボルテージクランプすることです。最終的に、運動ニューロンのカレントクランプと標的筋のボルテージクランプを同時に行うことで、運動ニューロンの活動電位の発生に伴う筋肉内のシナプス応答を示す結果を得ることができます。

LaVar Super Fishは、ペアとなる運動ニューロンと骨格筋の記録を容易にするという利点を兼ね備えており、筋肉のサイズが小さいため効果的なボルテージクランプが可能であり、また、頭部運動ニューロンの定型的な特徴によって、容易な識別およびアプローチが可能です。それでは、ニューロンと筋肉の両方にパッチクランプを確立するために必要な手順を順に説明します。処置を開始する前に、Bath solution、Trica含有bath solution、IDE含有bath solution、ニューロン用内部溶液、および筋肉用内部溶液の5つの主要な溶液を準備してください。

次に、72から96時間齢のゼブラフィッシュ幼魚を1匹採取し、tricaを含むバス溶液に入れます。麻酔剤にさらされてから1分以内に、魚は反応しなくなります。魚をプラスチック製ディッシュの上に置き、実体顕微鏡を用いて両刃カミソリで斬首します。

魚を、サルディング（sard）でコーティングし、バス溶液（bass solution）を満たしたガラス製記録室に移します。ピンを用いて、魚の吻側端付近に皮膚フラップを作成し、精密ピンセットで十分に把持できるようにします。吻側のピン付近を精密ピンセットで掴み、上層の皮膚を除去します。

皮膚を取り除くため、尾の方に向かってゆっくりと剥がします。記録の妨げとなる筋肉の収縮を抑制するため、IDEを含むバス溶液 3 mL で 3〜5 分間処理します。その後、通常バス溶液で 5 回洗浄します。

タングステンのピンの側面で軽く掻き出すようにして、5〜6セグメントにわたる筋肉の表層の一部を取り除きます。電気的なノイズを遮断するため、魚をファラデーケージ内に設置された正立顕微鏡へ移します。この顕微鏡には、固定ステージ、長作動距離の40倍対物レンズ、および0.5倍から4倍のズーム機能が備わっています。

顕微鏡は電動XY移動ステージに設置されています。高倍率下で神経と筋肉の間を移動させる際、微分干渉コントラスト（DIC）光学系を使用することで、0.5倍ズームでニューロンを視認することが容易になります。口径の広い15 µmピペットを用いて、上層の筋肉を除去し、脊髄を露出させてください。

3 ccの使い捨てシリンジを用いて陰圧をかけ、筋細胞を一つずつ除去します。この手順を骨格筋の背側セグメント5〜6個分に対して繰り返します。同じワイドボアピペットを使用して、腹側筋肉の上層2層も除去し、標的となる速筋を得ます。

これでペア記録の準備が完了し、顕微鏡のズームを約1.6倍に上げます。クリーンなセグメントをスキャンして、キャップニューロンを探索します。脊髄の各HEMIセグメントには、直径10 µmの大きなキャップ運動ニューロンが1つ含まれています。

この涙滴状の細胞体は、分節境界の最も尾側端に近い、脊髄下層に浅く位置しています。記録用のニューロンが選択され、関連する尾側分節の腹側標的筋肉領域をスキャンして完全性を確認します。記録のために2つのパッチ電極を配置し、一方はニューロンに、もう一方は筋肉に適用します。

上部電極は、強靭な脊髄硬膜を貫通させるため緩やかなテーパー形状となっており、先端の開口部は約2µmです。下部電極は、骨格筋の低抵抗ボルテージクランプ記録に適した、より急峻なテーパー形状をしています。脊髄硬膜を貫通させるため、ニューロン電極を約30度の角度で配置してください。

選択したキャップニューロンから吻側へ約0.5セグメント進み、約60 mmHgの緩やかで持続的な正圧をかけながら、軸方向駆動マニピュレーターを用いて電極を進めます。電極が硬膜を突き抜ける際、電極からの灌流によってキャップニューロンが変位することがあり、焦点の再調整が必要になる場合があります。電極がキャップニューロンの細胞体（SOMA）に接触すると正圧を解除し、通常、即座にギガシールが形成されます。

しかし、シールが形成されない場合には、緩やかな陰圧をかける必要があります。シール形成後、電極電位を-80 mVに調整し、陰圧をかけることで細胞膜を破裂させます。キャップニューロンは、140から180 MΩの入力抵抗と、+40 mVを超えるオーバーシュートを伴う活動電位を特徴としています。

これは、活動電位が誘発されるまで、カレントクランプ下で脱分極ステップを段階的に増加させて注入することでテストされます。次に、XY電動ステージを使用して、顕微鏡を腹側筋肉へと移動させます。高倍率下で、標的視野から速筋細胞を選択します。

正圧をかけながら筋電極を標的の筋細胞へと進め、圧力を解放してギガシールを形成します。電極電位を-50 mVに調整し、ナトリウムチャネルを不活性化させます。その後、緩やかな吸引を加えて細胞膜を破裂させます。抵抗値が100～200 MΩまで低下し、大きな容量性過渡応答が急激に現れたことで、記録準備が整ったことが示されます。

運動ニューロンに、活動電位が誘発されるまで段階的に電流注入量を増やして脱分極させ、記録します。この時点で、筋肉に終板電流が誘発されるはずです。運動ニューロンに1 Hzで刺激を継続すると、脱落することなく終板電流が認められます。刺激周波数を100 Hzに上げると、終板電流の振幅が変動し、刺激開始から10秒以内に機能的枯渇が起こります。

通常、ニューロンの記録は1時間まで安定していますが、筋細胞は直列抵抗の増加に反映されるように劣化します。これが起こった場合は、実験を終了するか、別の筋細胞をパッチクランプします。すべての記録は1時間以内に完了させてください。

1組の習得が終われば、録音は1時間から1時間半で完了します。また、隣接するセグメントにおいて1組または2組の追加ペアを得ることも可能です。通常の1日の録音で、2組から3組のペアが得られます。

運動ニューロンと骨格筋のペア記録は、神経筋伝達の基礎的な仕組みを探索するための独自の機会を提供します。これをMotility変異魚ラインと併用することで、神経筋機能不全の原因を特定し、転移性症候群などのヒト疾患の背景にあるメカニズムに新たな知見を得ることができます。