in vivoおよびアダプター、クラスリンの相互作用のin vitro試験

クラスリン媒介エンドサイトーシス中、クラスリンの多面体格子は、SL oneなどのクラスリン結合アダプタタンパク質を介して膜タンパク質または脂質に結合し、SL oneはそのバリアントであるクラスリンボックスまたはVCBを介してクラスリンに結合します。このビデオでは、クラスリンSLA 1の相互作用の分析に3つの方法を使用します。まず、GFPタグ付きネイティブおよびVCB変異体SLA oneを発現する酵母細胞を、スピニングディスク共焦点顕微鏡を用いてイメージングします。

次に、タイムラプス動画を解析して、突然変異がエンドサイトーシスの動態に及ぼす影響を判断します。第2の酵母細胞質抽出物は、クラスリンの供給源として野生型細胞から調製され、G-S-T-V-C-B融合タンパク質プルダウンアッセイは、クラスリンVCB相互作用をin vitroで調べるために行われます。第3に、全抽出物は、未変性およびVCB変異体を発現する酵母細胞から調製されます。

SLA oneおよびcoun沈殿は、in vivoでのSLA oneクラスリン結合の親和性に対する有効な変異を調べるために行われます。最終的に、得られたデータは、VCBの変異がエンドサイトーシスを遅らせ、SLAのクラスリンへの結合が失われることを示しています。これらの変異体では、この方法はエンドサイトーシスにおけるアダプターのダイナミクスについての洞察を提供することができます。

また、分泌経路の小胞内の他のタンパク質タンパク質相互作用にも適用できます。一般に、光退色は内因性遺伝子座からのタグ付きタンパク質の低発現から蛍光シグナルを分離する可能性があるため、この方法は困難であることは、個人が理解していました。このプロトコルは、画像解析と物理的相互作用の生化学的研究を組み合わせたものであるため、エンドサイトーシスを制御するメカニズムを研究するための非常に強力なアプローチです エンドサイトーシス中のクラスリンアダプター相互作用を研究するために、クラスリンアダプトタンパク質SLのGFPタグのネイティブバージョンと変異バージョンを発現する酵母株が生成されます。最初に、GFPタグが相同組換えによってSLに1つのC末端が追加されます。

次に、特定のSL1に隣接する配列を持つRA3遺伝子を含むフラグメントを用いて、SLA one遺伝子を選択的に破壊することにより中間酵母株を作製し、染色体遺伝子座から変異体SL oneを発現するための機能遺伝子を再生します。URA 3は、クラスリン結合モチーフまたはVCBに点変異が組み込まれたVCBを含むSL oneフラグメントで置き換えられます。得られた酵母株は、SLA one dynamicsの顕微鏡分析に使用されます。

エンドサイトーシス部位では、同様のアプローチが、TVY 6 1 14のようなタグなしSLA One株にVCB変異を導入するために利用され、生化学実験に適した酵母株SLA one GFPおよびSLA one 変異株SLA one A-A-A-G-F-Pを、4ミリリットルの補充されたSD培地で、30°Cのローテーターで暗闇の中で増殖させることから始まる。酵母が0.1〜0.4のOD 600に達したら、各培養物の1ミリリットルをマイクロ遠心チューブに移し、スピン後の室温で1分間4,000Gで回転させ、残りの液体に約950マイクロリットルのSUP被覆細胞を廃棄します。細胞懸濁液の3マイクロリットルを顕微鏡スライドに堆積させ、ガラスカバースリップで覆います。

焦点顕微鏡上の回転ディスク上の光からサンプルを保護します。スライドを100 x油浸対物レンズに取り付けます。明視野照明または適切なフィルターを備えた488ナノメートルレーザーを使用して、適切な焦点面を見つけます。GFPを励起および検出します。露光時間が500ミリ秒の細胞内のSLA one GFPおよびSLA one A-A-A-G-F-Pのタイムラプス画像をキャプチャします。1秒あたり1枚の画像間隔で150秒間。

GFPで標識されたPunteは、原形質膜の内面に現れます。数秒間持続し、信号がすぐに消え、コートの分解を示すため、セルの中心に向かって移動します。ソフトウェアを使用して、スポットが現れるのが見られる野生型SLA one GFPのタイムラプス画像の一部を選択します。

数秒間そのままにして消えます。タイムラプス画像のフレームごとに、画像のこのセクションを切り抜きます。次に、ソフトウェアを使用して、ここで経過時間に対応する軸に沿ってフレームを揃えることにより、152回目のタイムラプス画像の各フレームでこのセクションを表すチャイムグラフを生成します。

各スポットが存在するタイムラプスフレームの数を手動でカウントすることにより、各スポットの滞留時間を計算します。チャイムグラフで、結果をスプレッドシートに記録します。各スポットは、セルが消えるにつれて、セルの内部に向かって曲がる必要があることに注意してください。

エンドサイトーシスとコートの分解を反映しています。約40個の細胞について、細胞ごとに5つのスポットを解析します。次に、このプロセスをSLA one A-A-A-G-F-Pで繰り返して、GSTタンパク質アフィニティーアッセイで使用する酵母細胞質抽出物を取得します。

添付のテキストの指示に従って、適切な酵母株の3リットルを準備することから始めます。ペレットを3〜5ミリリットルの滅菌水に再懸濁し、ペレットが完全に再懸濁されるまで上下にペットを動かします。次に、250ミリリットルのプラスチックビーカーに約150ミリリットルの液体窒素を注ぎます。フラッシュ。

酵母を液体窒素に円形に滴下して凍結します。凝集を避けるために、ペレットを解凍させないでください 液体窒素を追加してください 必要に応じて、液体窒素をステンレス製のブレンダー容器に注ぎ、冷やします。液体窒素がほぼ完全に蒸発するのを待ちます。

次に、冷凍酵母ペレットを追加します。冷たいゴム栓でブレンダーを閉じ、酵母ペレットを10秒間挽きます。3〜4回反転させて内容物を混ぜ合わせ、粉砕ステップを挽いた2回繰り返します。

冷凍酵母は、液体窒素を含む50ミリリットルの円錐形チューブを備えた外観のチラー漏斗のような粉末を持ちます。コールドファンネルを使用して、粉砕した酵母をチューブに移します。凍結した挽いた酵母は、マイナス80°Cで保存することも、すぐに使用することもできます。

細胞質抽出物を得るためには、15ミリリットルの円錐管中に3グラムの凍結粉砕テレビY 6 1 4酵母を秤量し、3ミリリットルの室温で懸濁する。含有プロテアーゼ阻害剤カクテルキャップを緩衝し、内容物が完全に解凍されるまでチューブを数回反転させます。氷の上に置きます。

抽出物を摂氏4度で20分間、300, 000 Gで超遠心分離し、スピン後、パーペットを使用して、氷上の円錐形のチューブにサピネートまたは細胞質抽出物を慎重に移します。200マイクロリットルの先端の端を切り取り、それを使用して、緩衝液A中の50%グルタチオンスフェロスラリー100マイクロリットルを細胞質抽出物に加えます。サンプルを15分間回転させた後、チューブを摂氏4度のローテーターに置きます。

氏4度で遠心分離によりビーズをスピンダウンします 1000 Gで、細胞質抽出物であるスナットを新しいチューブに移します 入力制御サンプル用に50マイクロリットルを確保します。この時点では、フリーズはお勧めしません。抽出物は常に氷上に置いて、実験を続けます。

GST融合タンパク質アフィニティーアッセイを行うには、バッファーAにPBS1ミリリットル、50%グルタチオンスフェロスラリー30マイクロリットル、透析G-S-T-G-S-T-V-C-Bまたは変異G-S-T-V-C-Bを標識フュージチューブに加えます。室温で30分間回転させて結合させます。ビーズをPBSで2回、バッファーA遠心分離機で1回洗浄します。

各洗浄後、5, 000 Gで10秒、次に1ミリリットルの酵母細胞質抽出物を追加します。サンプルを1時間回転させた後、チューブを摂氏4度のローテーターに置きます。5、000 G.Washで0.1%tritton X 101時間を含む緩衝液Aとビーズを3回スピンダウンします 摂氏4度で遠心分離機を4°Cで10秒間遠心分離

最後の回転の後の5、000 Gで。ゲルローディングチップを使用して、できるだけ多くの液体を取り除きます。この時点で、サンプルは摂氏マイナス20度で保存できます。

後で続行するには、ラムリーサンプルバッファーの2倍を15ミリリットル各チューブに加えます。サンプルをヒートブロックに置き、摂氏96度で5分間インキュベートします。次に、サンプルを 5 、 000 G で 10 秒間遠心分離して、サンプルをチューブの底に持ってきます。

クラスリン重鎖に対する抗体を用いたイムノブロッティングによりサンプルを分析し、共沈実験用の全細胞抽出物を取得します。今回と同様に、野生型SL1を発現するTVYシックス14株、TY 614でL-L-D-L-QからA-A-A-L-Q変異を持つSLワンAを用いて、凍結酵母試料を調製した。背景は、GPY3 1 3 0のようなSL一遺伝子の欠失を運ぶSL一デルタ株である。

2グラムの冷凍挽いた酵母を円錐形のチューブに入れてレウスに入れます。それらを2ミリリットルの室温緩衝液、プロテアーゼ阻害剤カクテルおよび2%トリトンX 100キャップを含むものに懸濁し、完全に解凍されるまでチューブを数回反転させ、次いで氷上で10分間インキュベートする。反転による定期的な混合。

材料をマイクロ遠心分離管に移し、摂氏4度で16, 000で15分間回転させます。ペレットを乱さないように慎重にG。sup、natantまたは全細胞抽出物を氷上の円錐形のチューブに移します。

ピペットを使用して、100マイクロリットルの50%タンパク質、緩衝液中のスフェロスラリーを加え、摂氏4度で15分間回転させます。次に、ビーズを摂氏4度で遠心分離し、1000 Gで2分間スピンダウンし、S上清を新しいチューブに移します。インプットコントロール用に50マイクロリットルの抽出物を予約する co免疫沈降アッセイを実施します。

PBS1ミリリットル、50%タンパク質30マイクロリットルを追加します。緩衝液Aとウサギ抗SLAの2マイクログラムのスフェロスラリー。標識マイクロ遠心チューブに対する抗体1本。

室温で30分間回転させます。ビーズをPBSで2回、バッファーで1回洗浄します。1%トリットン×100を含むA。

全酵母抽出物の1ミリリットルを追加します。SLA 1、SLA 1 A A、SLA 1 デルタ。摂氏4度で1時間回転させます。

5, 000 G で 10 秒間回転し、スピン後にビーズをペレット化します。SUPナタントを捨て、0.1%Tritan X 101時間を含むバッファーAでビーズを3回すばやく洗浄します。ビーズをもう一度スピンダウンし、ゲルローディングチップを使用して、できるだけ多くの液体を取り除きます。

この時点で、サンプルは摂氏マイナス20度で保存できます。後で続行するには、各チューブに15マイクロリットルの2倍lalyサンプルバッファーを追加します。摂氏96度で5分間インキュベートし、5, 000 Gで10秒間回転させます。クラスリン重鎖に対する抗体を使用して免疫ブロッティングによりサンプルを分析します。ここは。

野生型と変異型SLのライブセルイメージング結果を左で比較します。単一の酵母細胞は、細胞末梢のSLA 1陽性エンドサイトーシス領域を緑色で示しています。白い線の間の領域は、ブライトに示されているクラフトが生成された領域に対応します。

変異体におけるエンドサイトーシス部位は、野生よりも有意に長く、約80秒持続し、約30秒のタイプであり、コート形成の欠陥を示していることに留意されたい。クラスリンとsla 1バリアントクラスリンボックスとの間の物理的相互作用は、GST Fusion Proteinによって評価されました。アフィニティーアッセイ、GSTは、配列L-L-D-L-Qを含む1つのフラグメントAA 7 98〜8 1 3をSLAに融合しました。

対応するA-A-A-L-Q変異体またはGST単独をグルタチオン、血清ビーズに結合させ、野生型酵母細胞由来の細胞質抽出物とインキュベートした。関連するタンパク質は、ここに見られるように、クラスリン重鎖の免疫ブロッティングによってほのめかされ、分析されました。クラスリンは、GSTまたはG-S-T-V-C-B変異体に対してG-S-T-V-C-B変異体に結合せず、SLAがクラスリンに結合するためには無傷の変異体クラスリンボックスが必要であることを示唆しています。

この手順を試行する間は、この手順に従ってGS培養物の汚染を避けるために、常に炎の近くで作業することが重要です。RFPなどの他の蛍光タンパク質のタグ付けを行うことで、異なるタンパク質の共局在を調べることができます。このビデオを見れば、生化学的および蛍光細胞イメージング技術を使用してタンパク質タンパク質相互作用を研究する方法について十分に理解できるはずです。