Name: ロックされた核酸修飾オリゴヌクレオチドによるトランスフェクションおよび蚊細胞における標的遺伝子の変異 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 25 s
Description: 学ぶロック核酸修飾オリゴヌクレオチドを用いたAnopheles蚊細胞のトランスフェクションと標的遺伝子変異法。フローサイトメトリーで遺伝子変換頻度を定量化し、遺伝子機能解析と病媒制御戦略への応用を示す。

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我々は、フローサイトメトリーと彼女の援助のためのカリフォルニア国立霊長類研究センターでのアビースピナーを感謝したいと思います。この研究は、国立アレルギー感染症研究所（NIAID）国立衛生研究所（NIH）AI073745、AI080799、およびAI078183からの資金によって支えられている。

<ol><li>前のプロトコルを開始するために、それは実験で使用されている蚊の細胞が健康と付着した場合〜80％コンフルエント（図1）が表示されていることを決定することが重要です。草に覆われたまたは不健康な細胞は、低トランスフェクション効率になりますし、矛盾した結果を返します。 </li><li> 30分間28℃のウォーターバスで使用する前にすべてのメディアをウォームアップ。 <ol class="lalpha"><li> MEM、アールのw /グルタミン、5％熱不活性化FCS、0.2％D -グルコース、1％ペニシリン-ストレプトマイシン系抗生物質、および1％非必須アミノ酸：A.ハマダラカ MSQ43細胞はE5メディアが必要です。 </li><li>シュナイダーのショウジョウバエ培地、5％熱不活化FCS、および1％ペニシリン-ストレプトマイシン系抗生物質：A. gambiae SUA5B細胞はS2培地を必要とする</li></ol></li><li>すべてのトランスフェクション試薬の材料、プラスミド、および氷の上でオリゴヌクレオチドを​​解凍して保存する。 </li><li>すべての手順は無菌操作を用いて組織培養フード内で行ってください。 </li><li>接着細胞の場合（A. gambiae SUA5B、A.ハマダラカ MSQ43）、細胞を乱すことなく、古いメディアをオフ吸引° C〜28に温められてきた新鮮な培地と同等のボリュームを追加し、その後の底面から細胞を洗い流すピペットを用いてフラスコ。 </li><li>細胞の濃度を決定し、1 × 10 6細胞/ mlの最終濃度に調整する必要があります。トランスフェクション試薬の材料を準備しながら細胞は室温で保存することができます。 </li><li> 6ウェルプレートの各ウェルに蚊細胞（1 × 10 6細胞/ mL）1 mLを追加します。各実験条件（下記参照）のためにプレートを設定します。 表Iは、一般的なトランスフェクションのためのピペッティングスキームです。表IIは、BFP -固有のLNA - ONSを使用して単一のヌクレオチドの正常変異誘発をテストするための5つの条件の概要を説明します。最初の二つ、pGFPとpBFPは、それぞれ、正と負のコントロールです。残りは、BFP -固有のLNA - ONS濃度の増加とpBFPsの実験条件である。 〜12ステップ8では、各条件に応じて試薬の適切なボリュームを追加。 </li><li>滅菌済み1.5 mLのマイクロ遠心チューブにプラスミドDNAを移し、ECバッファの適切な量を追加します。 <ol class="lalpha"><li> 1μLプラスミドDNA（1μg/μLの）については、ECバッファの99μLを加える。 </li><li> 1μLpGFP（μL/1μgの）については、ECのバッファの99μLを加える。 </li><li> 1μLpBFP（μL/1μgの）については、ECのバッファの99μLを加える。 </li><li> 1μLpBFP（μL/1μgの）とON 1μL（μg/μLの）については、ECのバッファの98μLを加える。 </li><li> 1μLpBFP（μL/1μgの）とON 5μL（μL/1μgの）については、ECのバッファの94μLを加える。 </li><li> 1μLpBFP（μL/1μgの）とON 10μL（μL/1μgの）については、ECのバッファの89μLを加える。 </li></ol></li><li>その後、徐々に使用される1μgのDNAあたりのエンハンサーを追加。 <ol class="lalpha"><li> 1μLプラスミドDNAの場合、8μLエンハンサーを追加。 </li><li> 1μLpGFPについては、8μLエンハンサーを追加。 </li><li> 1μLpBFPについては、8μLエンハンサーを追加。 </li><li> ON 1μLpBFPと1μLの場合は、16μLエンハンサーを追加。 </li><li> ON 1μLpBFPと5μL、48μLエンハンサーを追加。 </li><li> ON 1μLpBFPと10μL、88μLエンハンサーを追加。 </li></ol></li><li>渦は、1秒のためのDNA /バッファ/エンハンサー混合し、溶液のすべてが、チューブの底にあることを確認してください。その後、5分間室温でインキュベートする。 </li><li> 10秒に1μgのプラスミドDNAと渦あたりEffectene試薬を追加。ソリューションのすべてが、チューブの底にあることを確認してから10分間室温でインキュベートする。 <ol class="lalpha"><li> 1μLプラスミドDNAについては、10μLEffectene（表I）を追加します。 </li><li> 1μLpGFPについては、10μLEffectene（表II）を追加します。 </li><li> 1μLpBFPについては、10μLEffectene（表II）を追加します。 </li><li> ON 1μLpBFPと1μL、20μLEffectene（表II）を追加します。 </li><li> 1μLpBFPとON 5μL、60μLEffectene（表II）を追加します。 </li><li> 1μLpBFPとON、10μLの場合は、110μLEffectene（表II）を追加します。 </li></ol></li><li> DNA /バッファ/エンハンサー/ Effectene混合物に滴下して暖めたメディアを追加することにより、1000μLの最終容量に各チューブを持参。メディアが短すぎるために追加された場合DNAは、この時点で沈殿することができる。穏やかに3〜4回上下にピペッティングして混ぜる。 <ol class="lalpha"><li> 1μLプラスミドDNAについては、882μLのメディア（表I）を追加します。 </li><li> 1μLpGFPについては、882μLのメディア（表II）を追加します。 </li><li> 1μLpBFPについては、882μLのメディア（表II）を追加します。 </li><li> ON 1μLpBFPと1μLの場合は、864μLメディア（表II）を追加します。 </li><li> ON 1μLpBFPと5μLの場合は、792μLメディア（表II）を追加します。 </li><li> ON 1μLpBFPと10μLの場合は、702μLメディア（表II）を追加します。 </li></ol></li><li>次のゆっくりを各ウェルに一度にドロップを適切なDNA /エンハンサー/ Effectene混合物を1 mLを加える。 </li><li>細胞とトランスフェクション混合物の均一な分布を確保するために穏やかにプレート渦巻く。 Incubat通常の培養条件でE細胞。 </li><li>トランスフェクション後のある日は、静かにメディアを吸引除去し、徐々に新鮮な温めたメディアと同等のボリュームに置き換えます。これを行う際にウェルの底に細胞層を妨げないすることが重要です。 </li><li>トランスフェクション後の二日後には、トランスフェクション効率（図2）を決定するために蛍光顕微鏡下でpGFPでトランスフェクトしたポジティブコントロール細胞を調べます。 </li><li> SUA5B細胞は非常に急速に成長し、生い茂ったになります。古いメディアを吸引し、徐々に新鮮な温めたメディアと同等のボリュームを追加することによって、これらの細胞の薄いトランスフェクション後の四日間。 </li><li>ウェルに新しいメディアを追加した後、上下ペッティングすることにより、各ウェルの底からすべてのセルを切り離し、細胞の混合物の半量（1 mL）を破棄し、2に最終的なボリュームを持って新鮮な温めた培地1 mLを加えmLの。 </li><li>彼らは必要に応じて薄く、健康と草に覆われていないことを確認するために、毎日細胞を確認してください。 </li><li>セルが分析のためにそれらを収集する前に5〜7日後にトランスフェクションのために、通常の条件下で成長することができます。 </li><li> 5〜7日後にトランスフェクションでは、全てのウェルに、古いメディアをオフ吸引し、各ウェルに無菌室温度1mlのPBSを添加することにより細胞を収集する。 </li><li>と上下にピペッティングでウェルの底から細胞を剥離し、5mLのスナップキャップチューブに細胞混合物を転送し、すぐにフローサイトメトリーを介して細胞を分析する。 </li></ol>代表的な結果<img src="/files/ftp_upload/2355/2355fig1.jpg" alt="図1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図1"> 図1トランスフェクトされていない健康なA.ハマダラカ MSQ43（A）とA.約80％コンフルエントでgambiae SUA5B（B）細胞。 <img src="/files/ftp_upload/2355/2355fig2.jpg" alt="図2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図2"> 図2。A. ハマダラカ MSQ43（A）とA.を発現するプラスミド、ポジティブコントロールのGFPをトランスフェクションgambiae SUA5B（B）細胞。 <img src="/files/ftp_upload/2355/2355fig3.jpg" alt="図3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図3"> BFP -特定のロックされた核酸修飾オリゴヌクレオチド（LNA - ONS）を持つ単一のヌクレオチド以下のトランスフェクションの変異誘発を介してGFPにBFPの変換を確認する図3。フローサイトメトリーデータ。 SUA5B細胞は陰性コントロールとして、またはpBFPとBFP固有のLNA - ONSの濃度の増加とともに（pBFP）を発現するプラスミドBFPと、ポジティブコントロールとして（pGFP）を発現するプラスミドGFPをトランスフェクトした。左から右に示すフローサイトメトリーのデータのための（）ゲーティング戦略：生細胞、ヨウ化プロピジウム（PI）陰性細胞、およびGFP陽性細胞の前方対側方散乱五日、次のトランスフェクション。 （B）GFP陽性細胞の割合のグラフは（）でpBFPとLNA - ONS濃度の増加と、次のトランスフェクションを示す。 <img src="/files/ftp_upload/2355/2355table1.jpg" alt="表1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="表1"> 表I.トランスフェクション条件。 <img src="/files/ftp_upload/2355/2355table2.jpg" alt="表2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="表2"> 表II。図1で使用されるトランスフェクション条件。

<ol><li>Corby-Harris, V. D. A., Watkins de Jong, L., Pakpour, N., Antonova, Y., Ziegler, R., Ramberg, F., Lewis, E. E., Brown, J. M., Luckhart, S. L., Riehle, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+strategy+for+controlling+malaria+transmission+in+the+mosquito+Anopheles+stephensi%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">A novel strategy for controlling malaria transmission in the mosquito Anopheles stephensi.</a> PLOS Pathogens. , Forthcoming (2010).</li>
<li>Braasch, D. A., Corey, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Locked+nucleic+acid+%28LNA%29%3A+fine-tuning+the+recognition+of+DNA+and+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Locked nucleic acid (LNA): fine-tuning the recognition of DNA and RNA.</a> Chem Biol. 8, 1-7 (2001).</li>
<li>Andrieu-Soler, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+transmission+of+targeted+gene+modification+using+single-stranded+oligonucleotides+with+flanking+LNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Stable transmission of targeted gene modification using single-stranded oligonucleotides with flanking LNAs.</a> Nucleic Acids Res. 33, 3733-3742 (2005).</li>
<li>Parekh-Olmedo, H., Drury, M., Kmiec, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+nucleotide+exchange+in+Saccharomyces+cerevisiae+directed+by+short+oligonucleotides+containing+locked+nucleic+acids%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Targeted nucleotide exchange in Saccharomyces cerevisiae directed by short oligonucleotides containing locked nucleic acids.</a> Chem Biol. 9, 1073-1084 (2002).</li>
<li>Rhee, W. J., Santangelo, P. J., Jo, H., Bao, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Target+accessibility+and+signal+specificity+in+live-cell+detection+of+BMP-4+mRNA+using+molecular+beacons%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Target accessibility and signal specificity in live-cell detection of BMP-4 mRNA using molecular beacons.</a> Nucleic Acids Res. 36, e30-e30 (2008).</li>
<li>Marras, S. A., Kramer, F. R., Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genotyping+SNPs+with+molecular+beacons%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Genotyping SNPs with molecular beacons.</a> Methods Mol Biol. 212, 111-128 (2003).</li>
<li>Tyagi, S., Bratu, D. P., Kramer, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicolor+molecular+beacons+for+allele+discrimination%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Multicolor molecular beacons for allele discrimination.</a> Nat Biotechnol. 16, 49-53 (1998).</li>
<li>Blandin, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissecting+the+genetic+basis+of+resistance+to+malaria+parasites+in+Anopheles+gambiae%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Dissecting the genetic basis of resistance to malaria parasites in Anopheles gambiae.</a> Science. 326, 147-150 (2009).</li>
<li>Niare, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+loci+affecting+resistance+to+human+malaria+parasites+in+a+West+African+mosquito+vector+population%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genetic loci affecting resistance to human malaria parasites in a West African mosquito vector population.</a> Science. 298, 213-216 (2002).</li>
<li>Riehle, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+malaria+infection+in+Anopheles+gambiae+is+regulated+by+a+single+genomic+control+region%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Natural malaria infection in Anopheles gambiae is regulated by a single genomic control region.</a> Science. 312, 577-579 (2006).</li>
</ol>

利害の衝突は宣言されません。

ここでは、AにLNA - ONSのトランスフェクション後エピソーム、遺伝子をターゲットに単一のヌクレオチドの標的変換のためのin vitro法と証拠の提示ハマダラカとA. gambiae細胞 。 LNA - ONを介した遺伝子変換は、サイト固有のDNA修復応答の誘導が必要です私たちのデータでは、蚊の細胞は、部位特異的突然変異誘発のためのこのメカニズムをサポートできることを示している。ここで紹介するメソッドはエピソームターゲットの変換に基づいていますが、我々のデータは、それが他のシステムにされているとしてLNA - ONを介した変換が蚊細胞における染色体のターゲットに合​​わせて最適化できること。示唆遺伝子変換は、従って、複雑なプロトコルと長い薬剤の選択制度なし​​で安定に形質転換された蚊の細胞株の生成を促進するであろう。生細胞におけるmRNAの特異的蛍光標識が5月7日生物学的研究のための変換染色体遺伝子の標的と蚊細胞をソートし、豊かにするために活用することができます。の使用に基づいてさらに、既存の技術<p class=...

<table><tbody><tr><td>Effectene トランスフェクション試薬</td><td>Qiagen</td><td>301425</td><td></td></tr><tr><td>GFP コントロールプラスミド (pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR-neg)</td><td>Invitrogen</td><td>K4935-00</td><td></td></tr><tr><td>BFP プラスミド (pcDNA5/FRT/TO)</td><td></td><td></td><td>Dr. Concordetからの提供&lt;sup&gt;3&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>LNA-ONs </td><td></td><td></td><td>Dr. Concordetからの提供&lt;sup&gt;3&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>MEM, Earle&amp;rsquo;s グルタミン含有</td><td>Invitrogen</td><td>11095</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清 (FCS)</td><td>Invitrogen</td><td>16000</td><td></td></tr><tr><td>Schneider&amp;rsquo;s &lt;em&gt;Drosophila&lt;/em&gt; 培地</td><td>Invitrogen</td><td>11730</td><td></td></tr><tr><td>非必須アミノ酸</td><td>Invitrogen</td><td>11140</td><td></td></tr><tr><td>10% D-グルコース</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5767</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン 抗生物質</td><td>Invitrogen</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>6-ウェル培養プレート</td><td>Corning</td><td>3516</td><td></td></tr></tbody></table>

ロックされた核酸修飾オリゴヌクレオチドによるトランスフェクションおよび蚊細胞における標的遺伝子の変異

Transfection and Mutagenesis of Target Genes in Mosquito Cells by Locked Nucleic Acid-modified Oligonucleotides

マラリア原虫、マラリアの原因物質は、毎年2億5千万以上の新しい感染症で、その結果感染したハマダラカ蚊の刺咬を介して送信されます。数十年にわたる研究にもかかわらず、マラリアに対するワクチンは、全く新しい制御戦略の必要性を強調し、まだありません。一つの革新的なアプローチが効果的にマラリア原虫の伝送を制御する遺伝子組み換え蚊の使用です。標的特異的変異を経由して蚊の細胞シグナル伝達経路の意図的な変化が、、寄生虫の開発1を調節することが見出されている。これらの研究から、我々は、変換のための潜在的な遺伝子標的を同定するために始めることができます。標的変異誘発は、伝統的に標的遺伝子と大きなDNA分子間の相同組換えに頼っている。しかし、安定に形質転換細胞株の生成のためのこのような複雑なDNA分子の構築および使用は、コストと時間がかかり、非効率的です。したがって、ロックされた核酸修飾オリゴヌクレオチド（LNA - ONS）を使用しての戦略はエピソームおよび染色体DNAの遺伝子標的（2レビュー）に人工的な単一の塩基置換を導入するための有用な代替手段を提供します。 LNA - ONを介した標的突然変異誘発は、酵母やマウスの3,4の両方の培養細胞で目的の遺伝子に点突然変異を導入するために使用されています。我々は、LNA - ONSがハマダラカとハマダラカの細胞の両方において、緑色蛍光タンパク質（GFP）の発現に青色蛍光タンパク質（BFP）の式からスイッチの結果そのトランスフェクトされたエピソームターゲット内の単一のヌクレオチドの変化を導入するために使用できることをここに示す。この変換は、蚊細胞における標的遺伝子の効果的な変異導入がLNA - ONSによって媒介されることを初めて示し、この手法は、in vitroおよび in vivo で染色体ターゲットの突然変異誘発に適用される可能性があることを示唆している。

オリゴヌクレオチドは、特に両方でトランスフェクトされた標的遺伝子の一塩基の置換サイトに使用することができます<em&gt;ハマダラカ</em&gt;と<em&gt;ハマダラカ</em&gt;細胞。

マラリアの原因菌であるプラスモジウム原虫は、感染したアノフェレス蚊の吸血によって伝播し、年間2億5,000万件以上の新規感染を...

本手順の目的は、アノフェレス蚊細胞における部位特異的変異導入の新しい戦略を実演することです。まず、トランスフェクション用に健全な培養細胞を調製します。その後、トランスフェクション試薬を添加することにより、適切なコントロールDNAおよび試験用DNAを細胞に導入します。手順の次のステップでは、コントロール細胞の蛍光をモニタリングし、実験群細胞の密度を低減させます。最後に、トランスフェクションから5〜7日後にフローサイトメトリーを用いて、実験群細胞における遺伝子変換頻度を測定できます。最終的に、ロック核酸オリゴヌクレオチド誘発DNA修復による、エピソーム遺伝子標的の部位特異的突然変異導入を示す結果が得られます。こんにちは。カリフォルニア大学デービス校医学微生物学・免疫学部のShirley Lockhart博士の研究室に所属しております、Nazy Pacor博士です。本日は、アナフェレス・モスキート細胞における部位特異的変異導入の新しい手順をご紹介します。私たちは、この手順を用いて部位特異的変異導入を行い、蚊の自然免疫応答遺伝子の機能を研究しています。それでは開始します。プロトコルを始める前に、健康な状態で、コンフルエンスが約80%に達している蚊の細胞を用意してください。細胞が過成長していたり、不健康であったり、あるいは接着性が低い場合は、トランスフェクション効率が低下し、結果にばらつきが生じます。このプロトコルでは、anais Gambier SUA five B細胞を用いて実演します。ただし、Ananais ensi MS Q4 three細胞も使用可能です。まず、S two培地を28 °Cのウォーターバスで30分間温めて、トランスフェクションの準備を開始します。すべてのトランスフェクション試薬、プラスミド、およびオリゴヌクレオチドを氷上に置きます。組織培養フード内で無菌操作を用い、細胞を乱さないように古い培地を吸引し、同量の温めた新鮮な培地を加えて、フラスコの底から細胞を洗い流します。ピペットを用いて細胞濃度を測定し、最終濃度が 1 × 10⁶ cells/mL になるように調整します。最終濃度を調整した後、6ウェルプレートの各ウェルに蚊の細胞を1 mLずつ分注します。トランスフェクション試薬を準備している間、細胞は室温で保持できます。転移プラスミドDNAを滅菌済みのマイクロ遠心チューブに移します。ここでは、緑色蛍光タンパク質発現プラスミドをポジティブコントロールとして、青色蛍光タンパク質発現プラスミドをネガティブコントロールとして使用します。テスト用DNAにはBFP発現プラスミドも含まれますが、BFP特異的なロック核酸修飾オリゴヌクレオチド（LNA os）を濃度を上げて添加します。DNAを分注した後、プラスミドDNAおよびLNA os 1 µgあたり99 µ

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

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RNAiのトリガ配信へ<em&gt;ハマダラカ</em&gt;蛹

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CRISPR/Cas9を使用してヌル突然変異を生成するための Culex 蚊の胚の調製と注入

アノフェレスガンビアにおける機能遺伝学のGAL4-UASシステムの使用

このプロトコルは、φC31システムを使用してアノフェレスマラリア蚊のゲノムにおいて部位特異的修飾を達成する方法を記述している。記載される改変には、attP含有ドッキングラインのゲノムにおけるトランスジェニックカセットの統合および交換の両方が含まれる。...

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遺伝子組み換えアノフェリン蚊の小さいケージ実験室の試験

この記事では、CRISPR/Cas9によって誘導されるインデルの迅速な同定と、高解像度の溶融分析を用いた蚊 Aedes aegypti の突然変異線の選択のためのプロトコルについて詳しく説明します。...

モスキートAedes aegyptiにおける高解像度メルト分析を用いたCRISPR/Cas9突然変異誘発に続くインデル検出

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