ファージディスプレイライブラリーからのペプチドは、間葉系細胞における遺伝子発現を調整するとUnicortical骨欠損に骨形成を増強する

この実験の全体的な目的は、間葉系細胞の分化を増強し、骨修復を促進する配列を同定することです。最初のステップでは、バイオパンニングによって骨に結合するファージを単離します。続いて、間葉系細胞に結合するペプチド配列を同定し、その後の遺伝子発現の変化を明らかにします。

ペプチド配列を再生目的で骨にどのように送達できるかを決定するための実験を行います。最終ステップとして、骨修復を組織学的に検討します。これらの結果を総合することで、in vitroにおける細胞分化のメカニズムおよびin vivoにおける骨修復に関する重要な知見を得ることができます。ファージディスプレイライブラリを用いたバイオパニング技術を使用する利点は、骨を標的とするペプチドを同定でき、それを間葉系細胞の分化誘導および骨修復の増強に利用できることです。

最終的に、これらのペプチド配列は、骨修復や、骨減少症や骨粗鬆症などの骨量減少の治療に向けた治療法において有用である可能性があります。ULAとPascalが、バイオパンニングを用いて血管を標的とするペプチド配列を単離できることを示した研究に基づき、我々はこの手法を骨におけるメカニズムの探索に適応させることとしました。in vivo バイオパンニングの手順として、10¹⁰ plaque forming units の N-E-B-P-H-D 12 ファージディスプレイペプチドライブラリーを、生後10週のvalve Cマウスの心臓から灌流させました。

約5分後、マウスを安楽死させ、大腿骨を露出させて解剖し、両端を切断して骨髄を除去します。左大腿骨の内外をPBSで10回すすぎます。その後、骨をER 2 5 3 7細菌に加えます。

非結合ファージを除去するため、2%脱脂スキムミルクを21ゲージ針付きシリンジに入れ、右大腿骨の中間管を10回洗浄します。次に、塩酸グリシン緩衝液（1 M Trisで中和し pH 2.2 に調整したもの）を用いて、中間管から結合ファージを溶出させます。

ファージを増幅させるために、EITをER 2 5 3 7細菌に加え、4.5時間培養します。上清を慎重に新しいチューブに移し、ポリエチレングリコールナトリウム塩溶液を添加して、ファージを3回沈殿させ、チューブを4°Cで一晩インキュベートします。

最後に、ペレットを0.02% Sodium azideを含むTBSで再懸濁します。ファージをプレートにプラッキングし、増幅したEITsのプラーク形成単位（PFU）を決定します。溶出したファージと非溶出ファージの両方について、in vivo バイオパニングの手順を4回繰り返します。

細菌培養液中でプールしたファージを増幅させます。ファージディスプレイキットに付属のプライマー98を用いて、最終的なファージDNAであるDNA配列を精製し、定量します。重要な点として、ファージDNA配列の出現頻度を算出してください。

次に、Gly-Gly-Gly-Ser-Lys配列を含むペプチドを合成し、当研究室で樹立されたマウス多能性骨髄間葉系幹細胞株であるD1細胞を90%コンフルエントまで増殖させます。細胞をトリプシン処理し、遠心分離してペレット化して細胞数を計測します。ペプチド染色のために、ゼラチンコートしたチャンバースライドに細胞を播種し、24時間培養します。

細胞をPBSで洗浄し、4%パラアルデヒドで30分間固定します。次に、グリシンを用いてブロッキング処理を行い、続いてBSA、Aden、およびBBSAビオチンブロッキング溶液でインキュベートします。

ビオチン化L7およびR1ペプチドを100 µM添加します。PBSを用いて細胞を5分間ずつ3回洗浄します。LORストリッピンを1:1000に希釈して添加し、カバーとホイルで遮光して暗い引き出しの中で30分間インキュベートします。

細胞を洗浄し、Vector Shield封入剤を用いてカバーガラスを封入します。手術の24時間前に、蛍光顕微鏡でスライドを解析してください。ジェルフォームシリンダーを浸します。

20 µMのペプチド（L7またはR1）、あるいはペプチドを含まないPBSバッファーを浸透させたゲルフォームシリンダーを、滅菌済みの12ウェル培養皿に移し、手術のタイミングに合わせて4 °Cで一晩冷蔵保存する。使用直前まで、ゲルフォーム複合体を氷上に置いておく。

生理食塩水で灌流しながらニューマチックバーを用い、幅3 mm、長さ8 mmの大きな長方形の一層皮質欠損を作成します。準備したゲルフォームを、軽く叩きながらすべてのインプラント・スキャフォールドを挿入し、骨欠損部を処置します。ラットを安楽死させ、規定の時点で脛骨を採取します。骨欠損部を慎重に確認し、採取した脛骨を10%中性緩衝ホルマリンで固定し、パラフィン切片を作成します。

最後に、すべての組織切片をヘマトキシリン・エオジンで染色し、骨マトリックスを標識します。フルオレセインイソチアネート標識アデニンを用いることで、in vitroで培養した細胞におけるペプチドの結合を顕微鏡で検出することが可能になります。ここでは、培養した間葉系細胞にペプチドを結合させ、細胞に対するペプチドの骨形成効果を判定します。

培養されたin vitroの間葉系細胞に試験ペプチドを処理することで、細胞形態の変化を判定できます。例えば、4日目になると細胞が集聚し始め、時間の経過とともに集聚体が拡大して結節を形成します。興味深いことに、H&E染色を施した骨切片は、UV光下で自家蛍光を示しました。

骨組織と非骨組織のコントラストが高まることで、gelfoamとペプチドを併用して処置した欠損部における骨修復を判定するための、切片中の骨存在量の定量分析が容易になります。gelfoam単独の場合と比較して、ここではペプチドを併用して充填した欠損部において、時間の経過とともに最も多くの皮質骨修復が認められました。この手順を行う際は、最終的なペプチド群を選定するまでに不可避的に膨大な数の検体が蓄積するため、データ入力において非常に計画的かつ細心の注意を払うことが重要です。

骨を標的とするペプチドを同定する手法としてin vivoバイオパンニングが開発されたことで、骨修復および骨量減少の治療に使用できる潜在的な薬剤が得られるようになりました。骨修復の根底にあるメカニズムの一つは、骨量減少にも関与しています。これらのメカニズムをより詳細に理解し、遅延癒合や骨粗鬆症などの疾患の治療に使用できるツールを持つことは、ヘルスケアのために考案される治療法の向上に寄与します。