アルファウイルス形質導入システム：蚊で感染を可視化するためのツール
November 24th, 2010
in vitroおよび成虫の蛍光レポーターを表現するアルファウイルス形質導入システムを使用するための方法が説明されています。このテクニックは、の代わりに、またはレポーターに加えて、関心の任意のタンパク質を発現するように適合させることができる。
アルファウイルスは、最小限の細胞病理で感受性の高い蚊細胞に持続的に感染する蚊生まれのRNAウイルスです。このプロトコルは、ベクター感染およびウイルス感染の検出のための蛍光レポーターを発現する感染性アルファウイルス形質導入システムの有用性を示しています。まず、目的のアルファウイルスを含む血液粉をメスの蚊に与え、次に蚊の感染効率を決定し、マーカー遺伝子を発現する蚊のみを選択します。
次に、感染した蚊から唾液を採取し、採取した唾液を培養した蚊細胞に感染させることで感染力を示します。落射蛍光顕微鏡法によって得られた結果。GFPのようなタンパク質の報告を視覚化し、80種またはQE種の蚊によるベクター感染とウイルス感染を追跡します。
アルファウイルス発現システム(ATS)は、アルボウイルス研究だけでなく、蚊のトランスジェネシスなどのより困難な蚊の操作を行う前に、遺伝子発現とベクター蚊を迅速に評価するために使用できます。これらの手順を実演するのは、ケン・オルソン博士の研究室のイルマ・サンチェス・バルガス博士、エリック・モッセル博士、アーロン・フィリップスです。Bhk 21細胞でTSウイルスを産生するためには、in vitro転写後にGFPレポーターを発現するsymbis組換えウイルスを使用し、ゲノムαウイルス形質導入系RNAをbhk 21細胞にエレクトロレートします。
その後、感染する前にウイルスを救出し、増幅します。食物欠乏による人工フィーダーからの効率的な血液供給のためのプライム蚊。給餌の24時間前に砂糖と12時間前に水を取り除きます。
市販の除細動またはクエン酸化された動物の血液を調製した細胞培養物と混合し、蚊の効率的な中腸感染のためのTSウイルス懸濁液を調製した。血の食事のためのミリリットルあたりの7つのプラーク形成単位に10を処方し、蚊を刺激して充血させます。TPを最終濃度0.02モルまで追加します。
水ジャケット付きガラスフィーダーの口に細孔サインの腸膜を置きます。次に、摂氏37度の循環水でフィーダーをセットアップします。次に、食事をチャンバーにピペットで入れ、フィーダーをカートンにしっかりと置きます。
蚊に10〜30分間餌を与えた後、冷たく麻酔をかけた蚊を選別して、血液が充血した標本を探し出し、選択した蚊にTSウイルスが複製および拡散できるようにします。摂氏28度、相対湿度75%で8〜10日間インキュベートします。蚊を固定するために。
紙を保持しているカートンを摂氏4度で約15分間置きます。次に、5〜10匹の蚊を蛍光顕微鏡での使用に適したチルテーブルに移します。蛍光の有無に基づいて蚊を調べ、分類します。
選択した蚊を紙箱に戻して、必要に応じて使用します。このとき、蛍光強度を代理として感染効率を決定します。最後に、中腸、SIV腺、脂肪体などの組織を解剖し、蛍光をモニターします。
これらの臓器や組織は、必要に応じて早期に解剖することができます。餌をやる24時間前に蚊から砂糖源を奪います。50マイクロリットルのキャピラリーチューブを準備し、加熱し、引っ張って、3〜5マイクロリットルのカーギルで切り取ります。
蚊が逃げないようにするためのタイプBの浸漬油。彼らの足と翼を取り除きます。次に、プロボスをチューブに挿入します。
プロボスから浸漬油に滲み出る唾液の液滴を注意深く監視します。必要に応じて、蚊の胸部に1%のピロカルピンを一滴垂らして、60〜90分後に唾液分泌を増やし、蚊を取り除き、将来のウイルス分離のために保存します。ここで、毛細管から溶液を採取するために、唾液油混合物を500マイクロリットルの20%F-B-S-P-B-S滅菌のチューブに排出します。
0.2ミクロンのシリンジフィルターで接種物をろ過し、この接種物を使用して蚊細胞の培養細胞に感染させます。5 Prime DS MRE 16 GFP ウイルスの感染の有効性は、GFP の発現によって評価されます。時間の経過とともに、これらの細胞は感染の0.01倍でウイルスに感染しました。
エピ蛍光顕微鏡は、感染した蚊のGFPだけでなく、感染後10日でここにあるさまざまな体の部分のGFPを全身観察することができます。GFPの臓器選択的発現は、播種性感染を示しています。中腸は通常、感染後後半に後部中腸全体に広がるウイルスを含む血液粉を摂取した後、早い段階で明確な病巣感染を示します。
これらのイベントは、GFP と DS RED のレポーターによって通知されます。このトランスファクションアッセイは、5つのプライムDS MRE 16 GFPウイルスが外因性インキュベーション期間を通じてGFPを安定して発現することを示しています。ここの蚊では、GFPと蚊の唾液は感染後8日という早い時期に検出されます。
このビデオを見れば、A TSウイルスを蚊に経口感染させる方法、蚊のウイルス感染を視覚的に評価する方法、蚊からのウイルス感染を評価する方法について十分に理解できるはずです。
概要
この記事では、アルファウイルス転導システムを使用して、インビトロおよび成体の蚊で蛍光レポーターを発現させる方法について説明します。この技術により、任意のタンパク質の発現が可能となり、ベクター感染とウイルス伝播に関する研究を容易にします。
主要な研究構成要素
科学分野
- 神経科学
- ウイルス学
- 分子生物学
背景
- アルファウイルスは蚊媒介性のRNAウイルスです。
- これらは最小限の細胞病理学的変化で蚊細胞に感染します。
- 蛍光レポーターは、ベクター感染の検出に役立ちます。
- ウイルス伝播の理解は、アルボウイルスの拡散を制御する上で重要です。
研究目的
- 感染性アルファウイルス転導システムの有用性を示す。
- 蛍光マーカーを使用してベクター感染とウイルス伝播を追跡する。
- 蚊での遺伝子発現を評価するためのプロトコルを提供する。
使用した方法
- アルファウイルスを含む血液をメスの蚊に摂取させる。
- 感染した蚊から唾液を採取して伝播可能性を評価する。
- 上部蛍光顕微鏡を使用してタンパク質発現を可視化する。
- 蛍光と感染効率を監視するために組織を解剖する。
主な結果
- 蛍光強度によって感染効率を決定できます。
- GFP発現は感染と伝播の成功を示します。
- 伝播アッセイは、潜伏期間全体を通じてGFPの安定した発現を示します。
- 血液摂取後の中腸に感染の明確な焦点が観察されます。
結論
- このプロトコルは、蚊におけるウイルス感染と伝播を効果的に追跡します。
- アルファウイルス発現システムは、アルボウイルス研究に有用です。
- この方法は、さまざまなタンパク質に適応できます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Alphavirus transducing systems (ATSs) enable rapid, visual assessment of gene expression and viral infection dynamics in mosquito vectors, supporting early-stage vector-pathogen research. The use of fluorescent reporters provides direct, quantitative readouts for infection efficiency and transmission, enhancing predictive confidence in vector competence studies. These capabilities are critical for de-risking vector-borne disease models and informing portfolio decisions in infectious disease R&D.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Facilitates interrogation of vector-pathogen interactions through real-time visualization of infection.
- Enables functional validation of gene expression and viral replication in mosquito models.
- Supports predictive confidence in vector competence and transmission potential.
Screening & Assay Development
- Provides standardized, reproducible infection assays using fluorescent or bioluminescent reporters.
- Enables quantitative measurement of infection rates and dissemination in vector populations.
- Supports scalable screening of genetic constructs or antiviral interventions in mosquito systems.
Translational & Preclinical Research
- Aligns vector infection models with disease-relevant transmission endpoints.
- Enables continuity from discovery of vector-pathogen mechanisms to preclinical validation of interventions.
- Supports risk-adjusted advancement of vector-targeted strategies.
Pipeline & Workflow Integration
ATS-based infection and reporter assays position within the early discovery to preclinical continuum, enabling hypothesis testing, assay development, and translational validation in vector-borne disease research.
- Discovery Biology: Supports mechanistic studies of viral replication, gene expression, and vector competence.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative infection assays for evaluating genetic or chemical interventions.
- Analytics: Provides direct fluorescent readouts for infection efficiency and transmission assessment.
- Translational Research: Bridges laboratory infection models with field-relevant transmission outcomes.
- Enterprise Reuse: Offers a modular platform adaptable to diverse gene targets and reporter systems.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in vector competence and transmission studies.
- Operational Value: Standardizes infection and transmission assays for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions for vector-targeted interventions.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of vector-borne disease programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in molecular virology and mosquito vector handling.
- Needs access to fluorescence microscopy and cell culture infrastructure.
- Demands cross-team standardization of infection and readout protocols.
- Adaptable to various alphavirus backbones and reporter genes as supported by the system.
- Limited to laboratory mosquito species and controlled infection conditions as described.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:38
per os Infection of Mosquitoes
3:28
Monitoring Infection of Mosquitoes
4:18
Transmission Assay (Forced salivation to demonstrate virus transmission)
5:30
Alphavirus Infection of Mosquito Cell Culture and the Adult Female Mosquito
6:48
Conclusion
