アルファウイルス形質導入システム：蚊で感染を可視化するためのツール
2010年11月24日
in vitroおよび成虫の蛍光レポーターを表現するアルファウイルス形質導入システムを使用するための方法が説明されています。このテクニックは、の代わりに、またはレポーターに加えて、関心の任意のタンパク質を発現するように適合させることができる。
アルファウイルスは、感受性のある蚊の細胞に最小限の細胞病理学的変化を伴いながら持続的に感染する、蚊媒介性のRNAウイルスです。本プロトコルでは、ベクターへの感染およびウイルスの伝播を検出するために蛍光レポーターを発現させる、感染性アルファウイルス導入システムの有用性を示します。まず、雌の蚊に目的のアルファウイルスを含む血液を吸血させ、次に蚊の感染効率を判定し、マーカー遺伝子を発現している蚊のみを選別します。
次に、感染した蚊から唾液を採取し、回収した唾液で培養蚊細胞を感染させることで伝播性を実証します。結果はエピ蛍光顕微鏡を用いて取得します。GFPのようなレポートタンパク質を可視化し、これにより、Aedes属またはCulex属の蚊によるベクター感染およびウイルス伝播を追跡します。
アルファウイルス発現システム（ATS）は、遺伝子発現およびウイルス媒介蚊の迅速な評価に使用でき、アルボウイルス研究だけでなく、蚊の形質転換のようなより困難な操作を行う前の事前検討にも有用です。これらの手順を実演するのは、Dr. Ken Olsonの研究室のDr. Irma Sanchez Vargas、Dr. Eric Mossel、およびAaron Phillipsです。Bhk 21細胞でTSウイルスを産生するために、in vitro転写後にGFPレポーターを発現するsymbis組換えウイルスを使用し、ゲノムアルファウイルス導入システムRNAをbhk 21細胞にエレクトロポレーションします。
その後、感染前にウイルスを回収し、増幅させます。人工給餌器から効率的に吸血させるため、飢餓状態にして蚊をプライミングします。給餌の24時間前に糖分を、12時間前に水を遮断してください。
蚊の中腸への効率的な感染を目的として、市販の除細動またはクエン酸処理済みの動物血に、調製した細胞培養由来のTSウイルス懸濁液を混合します。蚊が吸血するように、血液食のウイルス力価を10⁷ plaque forming units per milliliterに調整してください。さらに、TPを最終濃度0.02 molarになるように添加します。
ポアサイン腸管膜をウォータージャケット付きガラスフィーダーの口に被せます。次に、37 °Cの水を循環させてフィーダーをセットアップします。その後、チャンバーに餌をピペットで注入し、フィーダーをカートン上にしっかりと固定します。
蚊に10〜30分間吸血させた後、冷麻酔をかけた蚊の中から吸血個体を分取し、選別した蚊の中でTSウイルスの複製と拡散を促します。これらを28°C、相対湿度75%で8〜10日間インキュベートします。これは蚊を不動化させるためです。
紙製の保持用カートンを4 °Cで約15分間置きます。次に、蛍光顕微鏡での使用に適応させた冷却ステージに5〜10匹の蚊を移します。蛍光の有無に基づいて蚊を観察し、選別します。
選択した蚊を紙製カートンに戻し、必要に応じて使用します。この時点で、蛍光強度を指標として感染効率を決定します。最後に、中腸、SIV腺、脂肪体などの組織を解剖し、蛍光を確認します。
必要に応じて、これらの器官や組織をより早い段階で解剖することも可能です。給餌の24時間前から、蚊に糖源を与えない状態で飼育してください。加熱して延伸し、切断した50 µLのキャピラリーチューブに、3〜5 µLのCargillを準備します。
蚊が逃げ出さないよう、タイプBの浸漬油を注入します。脚と翅を取り除きます。次に、口吻をチューブに挿入します。
浸漬油の中に口吻から分泌される唾液の液滴を注意深く観察してください。必要に応じて、1%ピロカルピンを蚊の胸部に一滴滴下して唾液分泌を促進させ、60～90分後に蚊を取り出して、後のウイルス分離のために保存します。次に、キャピラリーチューブから溶液を回収するため、唾液と油の混合物を500 µLの20% F-B-S-P-B-S滅菌液が入ったチューブに排出します。
接種液を0.2 micronのシリンジフィルターでろ過し、この接種液を用いて蚊の培養細胞に感染させます。5 prime DS MRE 16 GFPウイルスの感染効率は、GFPの発現によって評価します。これらの細胞に、感染多重度0.01でウイルスを感染させ、経時的に観察しました。
落射蛍光顕微鏡を用いることで、感染から10日後の蚊におけるGFPの全身像および各部位の観察が可能です。GFPの臓器選択的な発現は、感染が全身に播種したことを示しています。通常、ウイルスを含む吸血直後の初期段階では、中腸に明確な感染巣が認められ、感染後の時間が経過するにつれて後方中腸全体へと広がります。
これらのイベントは、GFPおよびDS REDレポーターによってシグナル化されます。伝播アッセイにより、five prime DS MRE 16 GFPウイルスは、外因性潜伏期間を通じてGFPを安定して発現することが示されています。本実験の蚊では、感染後早ければ8日目でGFPおよび蚊の唾液が検出されます。
このビデオを視聴することで、蚊へのA TSウイルスの経口感染方法、蚊におけるウイルス感染の視覚的な評価方法、および蚊からのウイルス伝播の評価方法について、十分な理解を深めることができます。
概要
本記事では、アルファウイルス形質導入システムを用いて、in vitroおよび成虫の蚊において蛍光レポーターを発現させる方法について説明します。この技術により、任意の目的タンパク質の発現が可能となり、ベクターへの感染およびウイルスの伝播に関する研究が促進されます。
研究の主要構成要素
科学分野
- 神経科学
- ウイルス学
- 分子生物学
背景
- アルファウイルスは蚊によって媒介されるRNAウイルスである。
- これらのウイルスは、細胞病理学的変化を最小限に抑えて蚊の細胞に感染することができる。
- 蛍光レポーターは、媒介動物への感染検出に有用である。
- ウイルスの伝播を理解することは、アルボウイルスの拡散を制御する上で極めて重要である。
研究目的
- 感染性アルファウイルス導入システムの有用性を実証すること。
- 蛍光マーカーを用いて、ベクターの感染およびウイルスの伝播を追跡すること。
- 蚊における遺伝子発現を評価するためのプロトコルを提供すること。
使用した手法
- アルファウイルスを含む血餌を雌蚊に吸血させる。
- 感染した蚊から唾液を採取し、伝播性を評価する。
- エピ蛍光顕微鏡を用いてタンパク質発現を可視化する。
- 組織を解剖し、蛍光および感染効率を確認する。
主な結果
- 感染効率は蛍光強度によって決定できる。
- GFPの発現は、感染および伝播が成功したことを示す。
- 伝播アッセイにより、培養期間を通じてGFPが安定して発現していることが示される。
- 吸血後の中腸において、明確な感染フォーカスが観察された。
結論
- 本プロトコルは、蚊におけるウイルスの感染および伝播を効果的に追跡することができます。
- アルファウイルス発現系は、アルボウイルスの研究において有用です。
- この手法は、さまざまな目的タンパク質に適応させることが可能です。
よくある質問
業界における重要性
アルファウイルス導入システム（ATS）は、蚊などの媒介動物における遺伝子発現およびウイルス感染ダイナミクスの迅速かつ視覚的な評価を可能にし、媒介動物と病原体の初期段階の研究を支援します。蛍光レポーターを用いることで、感染効率や伝播の直接的かつ定量的な読み取りが可能となり、媒介能力研究における予測の信頼性が向上します。これらの機能は、媒介物媒介性疾患モデルのリスクを低減し、感染症の研究開発におけるポートフォリオの意思決定に不可欠です。
バイオ医薬品R&Dにおける戦略的応用
初期探索およびターゲットバリデーション
- 感染のリアルタイム可視化により、媒介動物と病原体の相互作用の解析を容易にする。
- 蚊モデルにおける遺伝子発現およびウイルス複製における機能的検証を可能にする。
- 媒介能力および伝播能に関する予測的な信頼性を裏付ける。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- 蛍光または生物発光レポーターを用いた、標準化され再現性のある感染アッセイを提供します。
- 媒介生物集団における感染率および拡散の定量的測定を可能にします。
- 蚊のシステムにおける遺伝子構築物または抗ウイルス介入のスケールアップ可能なスクリーニングをサポートします。
トランスレーショナル・前臨床研究
- ベクター感染モデルを、疾患に関連する伝播エンドポイントに整合させます。
- ベクターと病原体のメカニズムの解明から、介入策の前臨床検証までの連続性を可能にします。
- リスクを調整したベクター標的戦略の推進を支援します。
パイプラインおよびワークフローの統合
ATSベースの感染およびレポーターアッセイは、初期探索から前臨床に至る連続的なプロセスの中に位置付けられており、媒介生物媒介性疾患研究における仮説検証、アッセイ開発、およびトランスレーショナルな妥当性確認を可能にします。
- 探索生物学：ウイルスの複製、遺伝子発現、およびベクター能のメカニズム研究を支援します。
- スクリーニング：遺伝学的または化学的介入を評価するための、再現性と定量性の高い感染アッセイを提供します。
- 分析：感染効率および伝播評価のための直接的な蛍光読み取りを可能にします。
- トランスレーショナルリサーチ：研究室レベルの感染モデルと、フィールドに関連する伝播結果を橋渡しします。
- 企業的な再利用：多様な標的遺伝子やレポーターシステムに適応可能なモジュール式プラットフォームを提供します。
運用の影響および企業への影響
- 科学的価値： ベクター能力および伝播研究における予測の信頼性を向上させる。
- 運用的価値： 感染および伝播アッセイを標準化し、再現性と拡張性を確保する。
- 戦略的価値： ベクターを標的とした介入策における、根拠に基づいた実行可否（go/no-go）の判断を可能にする。
- ポートフォリオへの影響： ベクター媒介性疾患プログラムのリスク調整済み優先順位付けを支援する。
実施上の検討事項
- 分子ウイルス学および蚊の媒介動物の取り扱いに関する専門知識が必要です。
- 蛍光顕微鏡および細胞培養インフラへのアクセスが必要です。
- 感染および読み出しプロトコルのチーム間での標準化が求められます。
- システムがサポートしているさまざまなアルファウイルスバックボーンおよびレポーター遺伝子に適応可能です。
- 記述された通り、実験室用の蚊の種および制御された感染条件に限定されます。
