げっ歯類のマラリア原虫の遺伝的交雑の生産のためのプロトコル

この手順の全体的な目標は、組換え子孫を生成するために、げっ歯類のマラリア原虫マラリア原虫の遺伝的交配を作成することです。これは、まず、交配する寄生虫の2つの親クローンを含む混合接種物をマウスのグループに注入することによって達成されます。次に、感染したマウスを使用して内部の蚊に餌を与え、この段階で各親株のガットが二倍体接合子筋分裂に融合すると、遺伝子組換えが起こり、それによって組換え子孫が生成されます。

次いで、得られたスポロゾイトを蚊の唾液腺から採取し、ナイーブレシピエントマウスに再注入して、血液期の寄生虫を得るためであり、その中には、限定的な希釈で単離できる個々の組換えクローンが含まれる。実験が成功すると、クローニングされた系統の5〜10%が組換え体となり、適切な遺伝子マーカーのジェノタイピングによって特徴付けることができます。この方法は、薬剤耐性アリの遺伝的決定要因やマラリアの感染性など、マラリア研究分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。

寄生虫 凍結血液ステージを含む2つのバイアルを室温で、マラリア原虫を交配します。この例では、使用されているげっ歯類のマラリア原虫株は、マラリア原虫yoi、oi、およびマラリア原虫の2つです。ヨイナイジェリア人は、22〜30ゲージの針で注射器を取り付け、同じ注射器を使用して400マイクロリットルのPBS pH 7.4を吸い上げます。

トールに感染した血液を100マイクロリットル採取し、内容物が均一に混合されるまでシリンジを上下に反転させます。このデモンストレーションでは、痛みやストレスを最小限に抑えるために、麻酔をかけた動物を使用します。麻酔は、82.5ミリグラム/キログラムのケタミンと7.5ミリグラム/キログラムのキシラジンを含む50マイクロリットルの麻酔薬カクテルをマウスの腹膜に注射することによって行われます。

マウスの麻酔の深さを監視し、死亡を防ぎます。この手順を使用して、マウスは20〜30分間麻酔下に置かれます。回復する前に、200マイクロリットルの寄生虫含有溶液をマウスの腹膜に直接注入します。

終了したら、シリンジを鋭く回転させて廃棄します。この方法を用いて、注射後3〜5日で交差する2つの寄生虫ドレーンのそれぞれを2匹のマウスに感染させます。血液期の寄生虫は、感染したマウスに発生します。

異なる寄生虫株に感染したドナーマウスのマウスの尾先を滅菌ハサミでクリップします。顕微鏡のスライドでマウスの尾の血液を一滴採取し、薄い塗抹標本を行います。薄い血液塗抹標本をギレム染色で染色します。

Guillem SA染料は、感染していない細胞のため、感染していない赤血球を染色しません。核の欠如 em SAI は、感染した赤血球寄生虫の寄生虫核を染色し、赤血球はリングステージの形で現れ、栄養型はスキーオンと破裂するマイトです。パラス貧血が両方のマウスで1〜5%に達すると、混合クローン感染のために血液期の寄生虫を採取できます。

さまざまな寄生虫に感染したドナーマウスのマウスの尾先をクリップします。前述のように滅菌ハサミで濾します。ガラス毛細血管を使用してマウス尾の血液1マイクロリットルを無菌PBSの1ミリリットルに収集し、血液懸濁液の20マイクロリットルを使用して、細胞オームで赤血球密度を分析します。

赤血球密度とパラ測定を使用して、血液サンプルを生理的クエン酸生理食塩水で希釈し、100マイクロリットルあたり100万の感染赤血球の濃度を取得します。2人のドナーからの感染した血液のサンプルを1対1の比率で組み合わせて、混合クローン接種物を取得します。次に、混合したサンプル100マイクロリットルを、感染させる各マウスの腹膜に注入します。

1つのクローン感染には2匹のマウスを使用して、各親株の感染が成功したことを確認してください。オスとメスの配偶子と呼ばれる寄生虫の性段階は、その時点で感染後約4日でマウスの血液中に現れ始めるはずです。配偶子細胞の出現についてマウスを毎日監視し始め、前述のように尾の血液を採取し、薄い血液の尾の塗抹標本を準備します。

男性と女性の細胞は、大きな顆粒または色素の存在により認識できます。男性のgato部位の細胞質はピンク色ですが、女性のTER部位の細胞質は青色です。成熟したガトーサイトのみが大きな液胞を示します。

雌雄の成熟細胞が検出されたら、マウスを使用して蚊に餌を与えることができます。50マイクロリットルのケタミン、キシラジン、麻酔薬溶液を各感染マウスの腹膜に注入します。マウスに麻酔をかけたら、24時間砂糖の供給が不足している50〜100匹のメスのアニス防御酵素蚊が入ったケージの上部に1つを下にして置き、蚊が中断することなく30分間餌を与えるようにします。

給餌期間の直後にマウスを人道的に安楽死させます。伝染が成功すれば、摂食の9日後、蚊が取り込んだ配偶子は二倍体受精卵に融合し、それが成熟してオーシストになり、これは昆虫の中腸に見られます。検出されるオーシストが多ければ多いほど、組換え寄生虫が生成された可能性が高くなります。

吸引器を使用して、ケージから5〜10匹の感染した蚊を収集し、蚊を小さな容器に移します。二酸化炭素ガスを使用して蚊に麻酔をかけ、氷の上のガラスのペトリ皿に移します。触角がメスよりも著しくふさふさしているオスの蚊は捨てられます。

2つのシリンジにPBSを入れ、26ゲージのハーフインチ針を取り付けます。シリンジから約100マイクロリットルのPBSをスライドガラスに堆積させます。麻酔をかけた5〜10匹の雌の蚊をPBSの滴に移し、針を使用してスライドを解剖顕微鏡に置きます。

各蚊の翼と脚を取り除き、次に昆虫を胸部と後腹部に保持します。中腸が白い袋のような体が解放されるまで、体を引き離します。解剖を行いながら、中腸を切り離し、体の残りの部分を捨てます。

解剖針のPBSを使用して、中腸を湿らせておくようにしてください。解剖が完了したら、中腸にカバースリップをかぶせます。光学顕微鏡で100倍の倍率で中腸を調べます。

OOSは、中腸の外面にある厚い壁の円形構造として認識できます。各中腸のOOSの数を数えます。給餌から放出されたスポロゾイトは、システムから放出された蚊のSIV腺、マラリア原虫のスポロゾイトに移動しているはずです。

スポロゾイトを収穫するための細い紡錘形の細胞。まず、清潔なハサミを使って採取チューブを準備します。小さな500マイクロリットルのeinorチューブの蓋を切り取ります。

滅菌済みの19ゲージ針の先端を加熱し、チューブの底に穴を開けます。チューブの3分の1をガラス壁で満たしてフィルターを作成します。フィルターチューブをより大きな1.5ミリリットルのアイナーチューブの内側に挿入します。

フィルター装置の準備ができたら、前述のように蚊を集めて麻酔をかけます。以前と同様に昆虫をエアマウントして解剖し、蚊、頭、翼、脚、腹部を取り除きます。胸部だけが感染したsiv腺を含んでいます。

先端の細い鉗子を使用して、胸部を500マイクロリットルのPBSを含む1.5ミリリットルのホモジナイザーに移します。氷上で胸部をホモジナイズして唾液腺からスポロゾイトを放出し、ガラスピペットを使用してホモジネートをろ過装置に移します。フィルターチューブを毎分1000回転で10〜20秒間遠心分離します。

ホモジネートがスピンダウンされたら、22〜30ゲージの針を取り付けたシリンジを使用して流れを収集します。100〜500マイクロリットルのスポロゾイト懸濁液をマウスの腹膜に注入します。感染の3日後にマウスのパラ血球密度と赤血球密度のモニタリングを開始します。

0.1〜1%のパラを示し、感染した赤血球にほとんどが単一の寄生虫が含まれているマウスをクローニング手順のドナーとして選択します。PBSのPBSの血液の適切な量をマウスから希釈し、子牛、血清および哺乳類のリンガー溶液の冷たい1対1の溶液で100マイクロリットルあたり0.6から1つの感染した赤血球の濃度を達成するために採取し、接種物を氷上に保存してください。尾部の注射部位をエタノールで静脈内洗浄します。

100匹のマウスにそれぞれ100マイクロリットルの希釈感染血液を注入します。このようにして、個々のマウスは1つまたは0つの寄生虫を受け取る必要があります。成功した実験では、20〜50%のマウスが8日目に0.1〜0.5%のパラを示します。

5〜7日後、宝石が持続する薄い血液塗抹標本を調べることにより、マウスの血液段階寄生虫の存在をスクリーニングします。その後、交配からの子孫である寄生虫は、マイクロサテライトや一塩基多型などの異なる染色体上の遺伝マーカーを使用して尾血サンプルから抽出されたDNAのPCRによって遺伝子型決定することができます。独立した遺伝的遺伝子座が2つの親クローンに由来する寄生虫は、組換えクローンです。

組換え寄生虫に感染した動物の血液は、将来の使用のために凍結保存することができます。実験が成功すると、全マウスの5〜10%が独立した組換え子孫を持つことになります。このビデオを見れば、マラリアで遺伝的プロセスをどのように作り出すかについてよく理解できるはずです。

寄生虫とミディアムヨイ。この方法は、他の種類の寄生虫にも同様に適用できます。