げっ歯類のマラリア原虫の遺伝的交雑の生産のためのプロトコル

本手順の全体的な目的は、齧歯類マラリア原虫であるPlasmodium yoeliiの遺伝的交雑を行い、組換え子を生成することです。これは、まず、交雑させる2つの親クローンの原虫を含む混合接種物をマウス群に注射することで達成されます。その後、感染したマウスを蚊に吸血させ、蚊の体内において各親系統の配偶体が融合して二倍体の接合子を形成させます。この段階での減数分裂により遺伝的組換えが起こり、組換え子が生成されます。

得られたスポロゾイトを蚊の唾液腺から回収し、ナイーブなレシピエントマウスに再接種することで血中期の原虫を得ます。この中に、限界希釈法によって単離可能な個々の組換えクローンが含まれています。実験が成功すれば、クローン化された株の5～10%が組換え体となり、適切な遺伝マーカーのジェノタイピングによって特性を評価できます。この手法は、薬剤耐性原虫の遺伝的決定要因やマラリアの伝播能とは何かといった、マラリア研究分野における重要な疑問への回答に寄与します。

寄生虫を、凍結保存された血液期のマラリア寄生虫を含む2本のバイアルとともに室温に置きます。本例では、交雑させる2つのげっ歯類マラリア寄生虫株として、plasmodium yoi、oi、およびplasmodiumを使用します。Yoi Nigeriansは、22〜30ゲージの針を装着したシリンジを用い、同じシリンジで400 µLのPBS pH 7.4を吸い上げます。

Thor感染血を100 µL吸い上げ、内容物が均一に混ざるまでシリンジを上下に反転させます。本デモンストレーションでは、痛みとストレスを最小限に抑えるため、麻酔を施した動物を使用します。麻酔は、ケタミン 82.5 mg/kg およびキシラジン 7.5 mg/kg を含む麻酔薬カクテル 50 µL をマウスの腹腔内に注射することで行います。

麻酔の深さをモニタリングし、マウスの死亡を防止します。本手順では、マウスは20〜30分間麻酔状態に維持されます。回復させる前に、寄生虫を含む溶液200 µLをマウスの腹腔内に直接注入します。

終了後、シリンジをシャープスコンテナに廃棄します。この方法を用いて、注射から3〜5日後に、交雑させる2種類の寄生虫それぞれの株を2匹ずつのマウスに感染させます。感染したマウス内で血液ステージの寄生虫が増殖します。

滅菌した鋏を用いて、異なる寄生虫株に感染させたドナーマウスの尾端を切り取ります。マウスの尾血を1滴顕微鏡スライドガラスに採取し、薄層塗抹標本を作成します。この薄層血液塗抹標本をギエム染色液で染色します。

Guillem SA染料は、非感染赤血球には核がないため、それらを染色することはありません。SAIは感染赤血球内の寄生虫の核を染色し、赤血球内にはリングステージ、トロフォゾイト（栄養体）、シゾント（分裂体）、および破裂直前のメロゾイトの形態で寄生虫が現れます。両方のマウスにおいて寄生率が1%から5%に達すると、混合クローン感染用の血中ステージ寄生虫を回収することができます。

異なる寄生虫に感染させたドナーマウスの尾端を、前述の通り滅菌済みのハサミで切除します。ガラスキャピラリーを用いて、1 mLの滅菌PBSにマウスの尾血を1 µL採取します。この血液懸濁液 20 µLを用いて、cellomeで赤血球密度を分析します。

赤血球密度およびパラサイト測定値を用いて、感染赤血球濃度が100 µLあたり100万個になるように、生理的クエン酸食塩水で血液サンプルを希釈します。2人のドナーから得た感染血サンプルを1:1の比率で混合し、混合クローン接種液を作成します。次に、感染させる各マウスの腹腔内に、この混合サンプル100 µLを注入します。

各親株の伝播が成功したことを確認するため、単一クローンの感染には2匹のマウスを使用します。雄および雌のガメトサイトと呼ばれる寄生虫の有性世代は、感染から約4日後にマウスの血液中に現れ始めます。前述の方法で尾血を採取し、薄い血液塗抹標本を作成することで、ガメトサイトの出現を毎日モニタリングし始めてください。

雄と雌のcytesは、大きな顆粒または色素の存在によって識別可能です。雄のgato sitesの細胞質はピンク色であり、一方で雌のTER sitesの細胞質は青色です。成熟したgato sitesのみに大きな液胞が見られます。

雌雄両性の成熟した細胞が検出されたら、そのマウスを蚊に吸血させることができます。感染した各マウスの腹腔内に、ケタミン、キシラジンおよび麻酔薬溶液を50 µL注入します。マウスが麻酔状態になったら、糖分を24時間絶食させた50から100匹の雌のAnis defense enzyme蚊が入ったケージの上に、マウスを腹側が下になるように配置し、30分間中断することなく蚊に吸血させます。

給餌期間の直後に、マウスを人道的に安楽死させます。伝播が成功していれば、給餌の9日後には、蚊に取り込まれたガメトサイトが融合して二倍体の接合子となり、それが成熟してオーシストになります。これは昆虫の中腸で観察可能です。検出されるオーシストの数が多いほど、組換え寄生虫が生成された可能性が高くなります。

アスピレーターを使用して、ケージから感染した蚊を5〜10匹回収し、小さな容器に移します。二酸化炭素ガスを用いて蚊を麻酔し、氷上のガラス製シャーレに移します。触角が雌よりも明らかに房状になっている雄の蚊は除外してください。

2本の注射器にPBSを満たし、26ゲージの1/2インチ針を取り付けます。注射器からガラススライド上にPBSを約100 µL滴下します。麻酔をかけた5〜10匹の雌の蚊を針を用いてPBSの滴上に移し、スライドを解剖顕微鏡に設置します。

各蚊の翅と脚を取り除き、胸部と後腹部を持って固定します。中腸（白い袋状の組織）が露出するまで、体を切り離します。中腸を切り出し、解剖しながら体の残りの部分は廃棄します。

解剖用針にあるPBSを用いて、中腸を常に湿った状態に保ってください。解剖が完了したら、中腸の上にカバーガラスを被せます。光学顕微鏡を用い、100倍の倍率で中腸を観察してください。

OOSは、中腸の外表面に位置する厚壁の円形構造として識別されます。各中腸内のOOSの数をカウントしてください。スポロゾイトを摂取してから17日後には、放出されたマラリア原虫のスポロゾイトが蚊の唾液腺に移行しているはずです。

スポロゾイトを回収するための、細い紡錘形の細胞です。まず、清潔なハサミを使用して回収チューブを準備します。500 µLの小型エプンドルフチューブの蓋を切り取ります。

滅菌済みの19ゲージ針の先端を加熱し、チューブの底に穴を開けます。チューブの3分の1をガラスウォールで満たし、フィルターを作成します。このフィルターチューブを、より大きな1.5 milliliterのエッペンチューブの中に挿入します。

ろ過装置の準備が整ったら、前述の手順に従って蚊を採集し、麻酔をかけます。前述と同様に解剖用に昆虫をエアマウントし、頭部、翅、脚、腹部を取り除きます。感染した唾液腺が含まれているのは胸部のみです。

先端の細いピンセットを使用して、胸部を500 µLのPBSを含む1.5 mLホモジナイザーに移します。胸部を氷上でホモジナイズして唾液腺からスポロゾイトを遊離させ、ガラスピペットを用いてホモジナイズ物をろ過装置に移します。フィルターチューブを1000 rpmで10～20秒間遠心分離します。

ホモジネートの遠心分離後、22〜30ゲージの針を装着したシリンジを用いて上清を回収します。スポロゾイト懸濁液を100〜500 µL、マウスの腹腔内に注入します。感染から3日後に、マウスのパラサイトおよび赤血球密度のモニタリングを開始してください。

クローニング操作のドナーとして、0.1〜1%の寄生率を示し、かつ感染赤血球に主に単一の寄生虫が含まれているマウスを選択します。冷やした1:1の牛血清と哺乳類リンゲル液の混合溶液を用いて、マウスの尾血をPBSで希釈し、感染赤血球の濃度が100 µLあたり0.6〜1個になるように適切な量の血液を採取し、接種液を氷上で保存します。尾部の注射部位をエタノールで清拭し、静脈内に投与します。

希釈した感染血100 µLを、マウス100匹のそれぞれに注入します。これにより、各個体あたりの寄生虫数は0または1匹となります。実験が成功した場合、8日目に20～50%のマウスで0.1～0.5%の寄生率が認められます。

5〜7日後、塗抹した薄い血液塗抹標本を検査し、マウスに血液期原虫が存在するかどうかをスクリーニングします。交配によって生じた子原虫は、マイクロサテライトや一塩基多型（SNP）などの異なる染色体上の遺伝的マーカーを用い、尾血サンプルから抽出したDNAのPCRによってジェノタイプを判定できます。独立した遺伝子座が2つの親クローンに由来する原虫が、組換えクローンです。

組換え寄生虫に感染した動物からの血液は、将来の使用のために凍結保存することが可能です。実験が成功すれば、マウス全体の5〜10%に独立した組換え子が生じます。このビデオを視聴することで、マラリアにおける遺伝的プロセスの構築方法について十分に理解できるはずです。

寄生虫と培地の準備。この手法は、他の種の寄生虫にも同様に適用可能です。