遺伝的に標識された網膜神経節細胞からの光は応答を記録するために隔離された網膜の準備

本手順の全体的な目的は、分離したマウス網膜において、遺伝的に標識された神経節細胞からの光誘発反応を記録することです。これはまず、マウスの眼から網膜を解剖して取り出すことで行われます。手順の第2ステップでは、残存する硝子体を除去するために、網膜を酵素で処理します。

手順の第3ステップでは、網膜の神経節細胞側を上にして記録チャンバーに固定し、チャンバーを顕微鏡ステージに設置して、遺伝学的にラベル化された神経節細胞を特定します。手順の最終ステップでは、特定した神経節細胞のホールセル記録を行い、光誘発反応を記録します。最終的に、単一細胞パッチクランプ記録を通じて、マウス網膜における特定の神経節細胞タイプの機能的特性を明らかにし、その細胞が脳に伝達する信号を定義した結果を得ることができます。

こんにちは。私はミネソタ大学のPaulo Ka Fuji博士の研究室で神経科学を専攻している大学院生のTiffany Schmidtです。本手法を用いることで、遺伝学的にラベル付けされた特定の神経節細胞集団の同定および記録が可能となり、その後の形態学的解析を行うことができます。この手法は、異なる神経節細胞のサブタイプが視覚刺激の主要な特徴をどのように処理するかといった、視覚分野における重要な疑問の解明に役立ちます。手術を行う前に、

網膜を摘出するために、まず実験に必要な8種類の溶液を調製します。本実験で使用するすべての溶液の成分は、付随するテキストに記載されています。細胞外液 200 milliliters を、網膜保存用の 250 milliliter ビーカーに移します。

記録中の重力灌流に使用するため、残りの細胞外液を分液漏斗に入れます。これら両方の溶液は、常に95% oxygen、5% carbon dioxideで飽和させておく必要があります。実験中に樹状突起を可視化するため、LOR 5 94などの蛍光トレーサーを細胞内液に添加してください。

全細胞記録の後に免疫組織化学染色を行う予定がある場合は、細胞内液に0.3% neuro biotinを添加します。必要な溶液の準備が整ったら、二酸化炭素による安楽死でマウスを処置し、角度のついた2番ピンセットを眼球の後方に慎重に挿入して眼球を持ち上げ、摘出します。眼科用剪刀を用いて外眼筋を除去し、視神経を切断します。

眼球を細胞外液で満たした35 millimeterのペトリ皿に入れます。眼科用剪刀で角膜を切り取り、5番ピンセットを用いて水晶体を摘出します。5番ピンセットで強膜を裂き、網膜と強膜の接合部にある残存する視神経を切断します。

ピンセットを網膜と強膜の間の隙間に滑らせ、網膜をアイカップからそっと引き離します。時間を短縮するため、次のステップに進む前に、両方の網膜に対して各操作を行ってください。重要な手順として、網膜に付着している硝子体を除去します。まず、ピンセットを使用して網膜の上にある透明な硝子体をつかみます。

硝子体が正常に除去されると、ピンセットの先に小さく透明なゼラチン状の物質が付着しているのが見えます。利用可能な組織量を最大化し、記録室への網膜の設置を容易にするため、各網膜を半分に切断します。網膜を室温の酸素飽和細胞外液に入れ、コンピュータの画面からの光などの最小限の間接光のみに制限して光への曝露を最小限に抑えれば、網膜は約6時間生存します。

解剖後、網膜を浸漬している細胞外溶液から500 µLを分取します。そこにコラゲナーゼ・ヒアルロニダーゼ酵素溶液の分注量を加え、希釈してください。

酵素溶液を35 mmのペトリ皿に入れ、切出した網膜の1つをペトリ皿に移します。溶液に95%酸素および5%二酸化炭素を常に緩やかに供給しながら、ペトリ皿を15分間回転させます。酵素溶液によって残っている硝子体を完全に除去することで、神経節細胞層へのアクセスが容易になります。硝子体の少ない若い動物の網膜を使用する場合や、悪影響が見られる場合は、消化時間を5分に短縮することができます。

先端を切断したプラスチック製転送ピペットを使用します。酵素含有培地から網膜を取り出します。網膜を細胞外液で十分に洗浄します。

網膜を記録室に移動させます。光受容体層を下に向けた状態で、ピペットまたはティッシュを用いて残っている液体を吸い取り、網膜の端を広げて組織を平坦にします。この際、網膜の端のみに触れるようにし、神経節細胞層には触れないよう注意してください。

網膜を固定するために、ナイロンメッシュ付きの白金リングを網膜の上に配置し、直ちにチャンバーを細胞外液で満たします。記録チャンバーを顕微鏡ステージに取り付け、続いて細胞外液の重力灌流用チューブ、真空吸引チューブ、および接地線を接続します。重力を調整し、1 mL/min以上の速度で滴下するように設定します。

灌流速度が遅すぎると、組織に十分な酸素が行き渡らず、シナプス伝達が妨げられる可能性があります。次のステップは、ホールセルパッチ記録用の電極を準備することです。抵抗値が3～5 MΩの範囲にあるピペットを選択してください。

解凍した細胞内溶液の分注液を記録用ピペットに満たし、赤外線照明および微分干渉コントラスト（DIC）光学系を用いて、10倍対物レンズ下でピペットホルダーに挿入します。網膜と記録用ピペットを可視化します。赤外線光は、網膜の可視光への曝露と明順応を最小限に抑えるために使用されます。40倍対物レンズに切り替え、組織の直上で電極が視界に入るように調整します。

本研究で使用したマウス系統は、神経節細胞でEGFPを発現しているため、落射蛍光下で神経節細胞を観察することができます。顕微鏡を用いて、480 nanometersの落射蛍光で網膜を照射します。網膜が健全であれば、個々の神経節細胞が視認できるはずです。

顆粒状の大きな核を持つ不健康な網膜は廃棄してください。記録に使用する蛍光標識された神経節細胞を1つ選択し、コンピューターモニター上の選択した細胞にラボテープで印を付けます。赤外線光学系に切り替え、選択した神経節細胞体が見えるようにします。

記録電極を標的となる神経節細胞の近くに配置します。記録電極で緩やかに正圧をかけることにより、細胞を直接覆っている領域を洗浄します。電極への加圧は、アンプのゼロ状態で、ポリエチレンチューブを用いてピペットホルダーに接続した12 ccプラスチックシリンジを介して行います。

電圧オフセットを調整します。電極を選択した神経節細胞の上に置き、細胞表面にディンプルが現れるまで押し付けます。アンプをボルテージクランプモードにし、テストパルスを印加してピペットを流れる電流をモニターします。

陰圧をかけて、電極と細胞の間にシールを形成します。シールが形成され始めたら陰圧を解除し、保持電流が細胞膜とピペットの間でギガシールが形成されたことを示すまで待ちます。容量性過渡現象が現れ、ホールセル記録モードに移行したことが確認できるまで、緩やかに陰圧パルスを加えた後、すべての圧力を解除します。

アクセス抵抗が30 MΩを超える場合は、非常に緩やかな陰圧パルスをさらに数回加えることで改善できることが多いです。ホールセルモードに移行した後、赤外線を消灯し、顕微鏡を黒い布で覆います。細胞を5分間暗順応させてください。

5分後、記録の準備が整います。カレントクランプモードで全視野白光刺激を行い、神経節細胞の応答を記録します。神経節細胞を複数回刺激する場合は、刺激の合間に必要に応じて網膜を暗順応させてください。

この時点で、記録後の神経節細胞の応答特性を評価するために、光刺激をパターン刺激や色刺激に変更することも可能です。細胞内溶液中の蛍光トレーサーは、エピ蛍光光学系とDIC赤外光学系を切り替えることで樹状突起まで拡散します。トレーサーは594 nanometersのエピ蛍光下で可視化でき、樹状突起を調べることで、その神経節細胞がON型かOFF型か、あるいは層状構造を持っているかを確認できます。細胞内溶液に添加したニューロビオチンが神経節細胞内に拡散しているため、次のステップでは網膜の免疫組織化学染色の準備を行います。

細胞膜への影響を最小限に抑えるため、ピペットをゆっくりと引き抜きます。1つの標本につき1個の網膜神経節細胞のみを記録し充填させた場合、記録した神経節細胞とその詳細な形態との間に特定の相関を持たせることができる点に注意してください。次に、網膜をパラホルムアルデヒド溶液に入れ、4°Cで一晩固定します。

固定した網膜をPBSで洗浄し、2時間以上にわたってPBS溶液を少なくとも6回交換します。洗浄後、網膜をブロッキング溶液を含むプレートに移し、プレートをシェーカーに乗せて2時間静置します。室温でブロッキング溶液をstrep evidence溶液に交換し、網膜を再びシェーカーに戻して4°Cで2日間インキュベートします。

2日後、網膜をPBSで20分間ずつ6回洗浄し、網膜を封入します。Vector Shieldを用いて、網膜の神経節細胞側を上にしてガラススライドに配置します。封入剤で覆った後、カバーガラスを被せ、マニキュアで密封します。これで、ラベル化された神経節細胞を共焦点顕微鏡で観察することができます。

この図は、左側に40倍のエピ蛍光照明下で、右側にDIC照明下で可視化したGFP陽性の網膜神経節細胞を示しています。網膜が健全で解剖が成功していれば、DICの高倍率観察において個々の神経節細胞が確認できます。不健全な網膜では核に大きな顆粒が見られるため、それらは廃棄してください。

この図は、層状的に固有の光感受性を持つM2型の網膜神経節細胞に典型的な光応答を示しています。所定の標本で遺伝学的に標識された網膜神経節細胞のタイプによって、応答特性は異なります。特定の神経節細胞のシナプス応答が正常であれば、光のオンセットまたはオフセット時に活動電位で応答するはずです。

内因性光感受性神経節細胞の場合、持続的な脱分極が起こります。ニューロビオチンで充填されたこの神経節細胞の図は、典型的なM1 off層状内因性光感受性網膜神経節細胞の形態を示しています。ホールセル記録後、免疫組織化学染色を行うことで、樹状突起の形態と網膜神経節細胞の電気生理学的応答との相関を明らかにできます。この手順を行う際は、シナプス応答を維持するために、網膜ウェルに酸素を供給し、組織に迅速に灌流させることが重要です。

このデモンストレーションをご視聴いただきありがとうございました。