高濃縮ニューロン培養の世代のための皮質組織ブロックの凍結保存

こんにちは、私の名前はアランで、カリフォルニア大学アーバイン校の神経生物学および行動学部のホーニー・ルー博士の研究室です。そして、私はボブです。今日、Dr.Haroは、高品質の初代ニューロン培養のその後の変性のための皮質組織ブロックの日常的な凍結保存のための迅速、効率的、かつ信頼性の高いプロトコルを紹介します。

それでは始めましょう。洗浄して刻んだ組織を、10%TMSOを含むクライオバイアルにロードします。凍結媒体。

クライオバイアルを冷凍容器に入れ、マイナス80°Cで少なくとも4時間置きます。その後、凍結したクライオバイアルを液体窒素に入れて長期保存します。ACクライオバイアルを培養するために、温水浴で溶かし、温かいHBSSですすいで残りのDMSOを除去します。

新しいHBSSを解離のためのtryin d nsとともに添加し、その後、10%EBSのDMMを添加します。解離性酵素活性を止めるために、細胞をスピンダウンし、ペレットを新鮮なDMMと10%EBSに再懸濁し、プレコートされたポリリジン皿に播種します。24時間後、DMMはサプリメント化された神経基礎培地に変化し、10日間成長しました。

このプロトコルでは、使用前に皮質組織を刻むために鋼製のカミソリの刃を使用します。かみそりは、70%エタノールで少なくとも2時間滅菌する必要があります。One x Hankの緩衝塩溶液HBSSは、滅菌水で10倍のストック溶液を希釈することによって作成され、1つのX-H-B-S-Sはその後、氷上または組織処理まで摂氏4度で保持されます。

ジメチルスルフオキシドまたはDMSOは、凍結媒体で保護されたクライオとして使用されます。このプロトコルでは、1つのX-H-B-S-S-D-M-S-OでDMSOの10%容量と容量希釈を使用し、摂氏4度で保存する前に完全に混合する必要があります。Nalgene と凍結容器は、サンプルの凍結速度を制御するために使用されます。

冷凍容器には、事前にラベルが貼られた2.5ミリリットルのクライオバイアルが装填されています。また、凍結容器が複数ある場合は、凍結容器自体にラベルを付け、胆汁の対応する容器に注意することもお勧めします。以前に冷やされた10%DMSOの凍結媒体、および凍結容器は、無菌の生物学的安全キャビネットに持ち込まれます。

ここでは、1ミリリットルの凍結培地を各クライオバイアルにゆっくりと加えます キャップが固定されていることを確認した後、組織処理の直前に少なくとも2時間、バイアルと一緒に凍結容器を摂氏4度に置きます。以前に滅菌したかみそりの刃は、十分にすすぐ必要があります。3、3分洗う。

滅菌水を使用すると、残っているエタノールを取り除くのに十分です。カミソリは長時間の水没や滅菌水によって酸化しやすいため、この洗浄手順は迅速である必要があります。清掃する前に、ティッシュペーパーをアイスパックの上に置く必要があります。

冷たいX-H-B-S-Sで少しすすぎ、浮遊している破片を取り除きます。滅菌された針は、残っている膜や血管の組織片を洗浄するために使用されます。クリーニング中は、組織の構造的完全性を維持するように注意する必要があります。

これが増加すると、きれいな組織を刻む効率は生の組織とは明らかに異なり、ほとんどの膜または血管が除去されるはずです。ティッシュを洗浄してすすいだら、チョッピングを開始できます。ティッシュをきれいに切り取り、約1mmの立方体のサイズのブロックを作成することが重要です。

大きすぎるブロックは、解凍時のセル収量が低くなります。ただし、小さいブロックでは、過剰処理も避ける必要があります。刻んだティッシュは、オートピペットとX-H-B-S-Sの冷たいピペットを使って集めることができます。

集めたティッシュをすべて回収するために、必ずHBSSで皿をすすいでください。次に、組織を1つのX-H-B-S-Sを大量に加え、底に落下させて、ゆるくパックされたペレットを作成します。これにより、組織がHBSSに沈殿する際に存在する可能性のある残留物が除去され、組織を割り当てる前に以前に冷却された凍結容器とクライオバイアルを回収します。

ティッシュの充填プロセスを早めるために、必ずすべてのバイアルのキャップを外してください。室温でのDMSOへの曝露は、10分以内に制限する必要があります。すべての組織が使用されるまで、一度に1つの凍結容器で作業することをお勧めします。

ゆるい組織の上層部を吸引し始め、トウモロコシをペレットにできるだけ近づけて、邪魔をせずにペレットにします。次に、幅200マイクロリットルのオリフィスチップをピペットに取り付けます。小さな先端オリフィスは、ティッシュブロックペレットの底に向かうブロックの構造を損なうため、使用しないでください。

ゆっくりと200マイクロリットルの組織を集めます。この組織をクライオバイアルに加え、すべてのバイアルが満たされるまで次の組織に進みます。10 分ルールが必要な場合があります。

凍結容器をマイナス80°Cの冷凍庫であるクライオバイアルに少なくとも4時間、または時間が限られている場合は一晩すばやく置きます。十分な時間が経過したら、冷凍容器を冷凍庫から取り出し、できるだけ早くクライオバイアルをクライオボックスに割り当てます。クライオボックスを液体窒素ボックスラックに入れて長期保存します。

液体窒素からクライオバイルをできるだけ早く取り除き、クライオボックスを制限します 室温への曝露は、摂氏37度の水浴に浸すことによりサンプルを急速に溶かします。常にキャップを水の上に保ちます。頻繁にチェックし、小さな氷Pが観察されるまで解凍し続けます。

安全キャビネットに持ち込む前に、クライオバイルを70%エタノールで滅菌してください。組織がクライオバイルの壁に残っている場合は、大量の温かいX-H-B-S-Sに解凍組織を追加します。HBSSでやさしく収集します。

すべての組織が収集されたら。チューブを3〜4回反転させ、組織が底に沈殿するのを待ちます。このステップにより、DMSOの十分な希釈が保証されます。

組織が落ち着いたら、できるだけ多くのスーパーナチンを吸引します。次に、これに10ミリリットルの温かい新鮮なX-H-B-S-Sを追加します。300マイクロリットルの0.25%トリプシンと50マイクロリットルのDNAを追加します。.

穏やかに攪拌しながら組織を解離させ、組織が解離した後に曇った細胞懸濁液を作成します。温かいDMと10%濃縮ウシ血清EPS遠心融合細胞懸濁液を1200Gで5分間添加することにより、酵素活性を停止します。細胞ペレットを新鮮なDMEMと10%EBSに再懸濁し、ポリリジンコーティングされたプレートにプレートします。

細胞を皿に30分間付着させます。次に、メディアを新しいDMと10%EBSと交換します。24時間後、DM含有培地をN 2およびB 27を補充した神経基礎培地に交換し、10日間増殖させる。

私たちは、皮質組織ブロックの日常的な泣き声の保存を備えた、広大で効率的で信頼性の高いプロトコルを詳しく説明しました。だから頑張ってください。