高濃縮ニューロン培養の世代のための皮質組織ブロックの凍結保存
2010年11月11日
ここで、我々は、効率的な凍結保存方法を説明し、高濃縮ニューロン培養を生成するために皮質脳組織ブロックの解凍。この単純なプロトコルでは、神経細胞のアストロサイト、および神経前駆細胞培養の後の世代のための柔軟性を提供します。
こんにちは、私の名前はアランで、カリフォルニア大学アーバイン校の神経生物学および行動学部のホーニー・ルー博士の研究室です。そして、私はボブです。今日、Dr.Haroは、高品質の初代ニューロン培養のその後の変性のための皮質組織ブロックの日常的な凍結保存のための迅速、効率的、かつ信頼性の高いプロトコルを紹介します。
それでは始めましょう。洗浄して刻んだ組織を、10%TMSOを含むクライオバイアルにロードします。凍結媒体。
クライオバイアルを冷凍容器に入れ、マイナス80°Cで少なくとも4時間置きます。その後、凍結したクライオバイアルを液体窒素に入れて長期保存します。ACクライオバイアルを培養するために、温水浴で溶かし、温かいHBSSですすいで残りのDMSOを除去します。
新しいHBSSを解離のためのtryin d nsとともに添加し、その後、10%EBSのDMMを添加します。解離性酵素活性を止めるために、細胞をスピンダウンし、ペレットを新鮮なDMMと10%EBSに再懸濁し、プレコートされたポリリジン皿に播種します。24時間後、DMMはサプリメント化された神経基礎培地に変化し、10日間成長しました。
このプロトコルでは、使用前に皮質組織を刻むために鋼製のカミソリの刃を使用します。かみそりは、70%エタノールで少なくとも2時間滅菌する必要があります。One x Hankの緩衝塩溶液HBSSは、滅菌水で10倍のストック溶液を希釈することによって作成され、1つのX-H-B-S-Sはその後、氷上または組織処理まで摂氏4度で保持されます。
ジメチルスルフオキシドまたはDMSOは、凍結媒体で保護されたクライオとして使用されます。このプロトコルでは、1つのX-H-B-S-S-D-M-S-OでDMSOの10%容量と容量希釈を使用し、摂氏4度で保存する前に完全に混合する必要があります。Nalgene と凍結容器は、サンプルの凍結速度を制御するために使用されます。
冷凍容器には、事前にラベルが貼られた2.5ミリリットルのクライオバイアルが装填されています。また、凍結容器が複数ある場合は、凍結容器自体にラベルを付け、胆汁の対応する容器に注意することもお勧めします。以前に冷やされた10%DMSOの凍結媒体、および凍結容器は、無菌の生物学的安全キャビネットに持ち込まれます。
ここでは、1ミリリットルの凍結培地を各クライオバイアルにゆっくりと加えます キャップが固定されていることを確認した後、組織処理の直前に少なくとも2時間、バイアルと一緒に凍結容器を摂氏4度に置きます。以前に滅菌したかみそりの刃は、十分にすすぐ必要があります。3、3分洗う。
滅菌水を使用すると、残っているエタノールを取り除くのに十分です。カミソリは長時間の水没や滅菌水によって酸化しやすいため、この洗浄手順は迅速である必要があります。清掃する前に、ティッシュペーパーをアイスパックの上に置く必要があります。
冷たいX-H-B-S-Sで少しすすぎ、浮遊している破片を取り除きます。滅菌された針は、残っている膜や血管の組織片を洗浄するために使用されます。クリーニング中は、組織の構造的完全性を維持するように注意する必要があります。
これが増加すると、きれいな組織を刻む効率は生の組織とは明らかに異なり、ほとんどの膜または血管が除去されるはずです。ティッシュを洗浄してすすいだら、チョッピングを開始できます。ティッシュをきれいに切り取り、約1mmの立方体のサイズのブロックを作成することが重要です。
大きすぎるブロックは、解凍時のセル収量が低くなります。ただし、小さいブロックでは、過剰処理も避ける必要があります。刻んだティッシュは、オートピペットとX-H-B-S-Sの冷たいピペットを使って集めることができます。
集めたティッシュをすべて回収するために、必ずHBSSで皿をすすいでください。次に、組織を1つのX-H-B-S-Sを大量に加え、底に落下させて、ゆるくパックされたペレットを作成します。これにより、組織がHBSSに沈殿する際に存在する可能性のある残留物が除去され、組織を割り当てる前に以前に冷却された凍結容器とクライオバイアルを回収します。
ティッシュの充填プロセスを早めるために、必ずすべてのバイアルのキャップを外してください。室温でのDMSOへの曝露は、10分以内に制限する必要があります。すべての組織が使用されるまで、一度に1つの凍結容器で作業することをお勧めします。
ゆるい組織の上層部を吸引し始め、トウモロコシをペレットにできるだけ近づけて、邪魔をせずにペレットにします。次に、幅200マイクロリットルのオリフィスチップをピペットに取り付けます。小さな先端オリフィスは、ティッシュブロックペレットの底に向かうブロックの構造を損なうため、使用しないでください。
ゆっくりと200マイクロリットルの組織を集めます。この組織をクライオバイアルに加え、すべてのバイアルが満たされるまで次の組織に進みます。10 分ルールが必要な場合があります。
凍結容器をマイナス80°Cの冷凍庫であるクライオバイアルに少なくとも4時間、または時間が限られている場合は一晩すばやく置きます。十分な時間が経過したら、冷凍容器を冷凍庫から取り出し、できるだけ早くクライオバイアルをクライオボックスに割り当てます。クライオボックスを液体窒素ボックスラックに入れて長期保存します。
液体窒素からクライオバイルをできるだけ早く取り除き、クライオボックスを制限します 室温への曝露は、摂氏37度の水浴に浸すことによりサンプルを急速に溶かします。常にキャップを水の上に保ちます。頻繁にチェックし、小さな氷Pが観察されるまで解凍し続けます。
安全キャビネットに持ち込む前に、クライオバイルを70%エタノールで滅菌してください。組織がクライオバイルの壁に残っている場合は、大量の温かいX-H-B-S-Sに解凍組織を追加します。HBSSでやさしく収集します。
すべての組織が収集されたら。チューブを3〜4回反転させ、組織が底に沈殿するのを待ちます。このステップにより、DMSOの十分な希釈が保証されます。
組織が落ち着いたら、できるだけ多くのスーパーナチンを吸引します。次に、これに10ミリリットルの温かい新鮮なX-H-B-S-Sを追加します。300マイクロリットルの0.25%トリプシンと50マイクロリットルのDNAを追加します。.
穏やかに攪拌しながら組織を解離させ、組織が解離した後に曇った細胞懸濁液を作成します。温かいDMと10%濃縮ウシ血清EPS遠心融合細胞懸濁液を1200Gで5分間添加することにより、酵素活性を停止します。細胞ペレットを新鮮なDMEMと10%EBSに再懸濁し、ポリリジンコーティングされたプレートにプレートします。
細胞を皿に30分間付着させます。次に、メディアを新しいDMと10%EBSと交換します。24時間後、DM含有培地をN 2およびB 27を補充した神経基礎培地に交換し、10日間増殖させる。
私たちは、皮質組織ブロックの日常的な泣き声の保存を備えた、広大で効率的で信頼性の高いプロトコルを詳しく説明しました。だから頑張ってください。
概要
この記事では、皮質脳組織ブロックの効率的な凍結保存と解凍の方法を提示し、豊富な神経細胞培養の生成を容易にします。このプロトコルは、神経細胞、アストロサイト、神経前駆細胞培養のその後の培養を可能にします。
主要な研究構成要素
科学の分野
- 神経科学
- 細胞生物学
- 組織保存
背景
- 凍結保存は脳組織の生存性を維持するために不可欠です。
- 高品質な細胞培養には効率的な解凍技術が重要です。
- 神経細胞培養は様々な神経生物学的研究に不可欠です。
- 処理中の組織完全性へのダメージを最小限に抑えるプロトコルが必要です。
研究目的
- 皮質組織のための信頼性の高い凍結保存方法を開発すること。
- 一次神経細胞培養の収率を向上させること。
- 保存された組織から様々な細胞タイプを生成するための柔軟なプロトコルを提供すること。
使用された方法
- 滅菌したカミソリ刃を使用した皮質組織ブロックの準備。
- 凍結保存のための凍結培地に10%のDMSOの使用。
- 氷晶形成を最小限に抑えるための温水浴での組織の解凍。
- 細胞培養のためのトリプシンとDNaseを使用した解凍組織の解離。
主な結果
- このプロトコルは皮質組織の生存性を成功裏に保存します。
- 解凍後の高品質な神経細胞培養が得られました。
- 異なる細胞タイプを生成する柔軟性が実証されました。
- 組織処理の効率的な方法が確立されました。
結論
- 記述された凍結保存方法は皮質脳組織に効果的です。
- このプロトコルは様々な神経細胞培養応用に適応可能です。
- 将来の研究は、この方法を用いてより高度な神経生物学的研究を構築できます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Standardized cryopreservation of cortical tissue blocks enables reliable generation of highly enriched neuronal cultures, supporting consistent early discovery and assay development in neurobiology-focused R&D. This protocol increases operational flexibility and resource efficiency by decoupling tissue collection from downstream culture initiation, reducing biological variability and supporting scalable, reproducible workflows. The approach is directly relevant for biopharma teams seeking robust, bankable sources of primary neuronal and glial cells for target validation and screening.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables consistent access to high-quality neuronal and astrocyte cultures for mechanistic studies.
- Supports functional target validation by providing reproducible primary cell systems.
- Facilitates biological de-risking through standardized tissue processing and storage.
- Improves predictive confidence in early-stage neurobiology research.
Screening & Assay Development
- Provides validated, reproducible cell sources for assay standardization and optimization.
- Enables scalable preparation of neuronal cultures for compound screening workflows.
- Supports quantitative readouts and reproducibility across experimental batches.
- Reduces batch-to-batch variability by allowing synchronized culture initiation.
Translational & Preclinical Research
- Facilitates generation of neural precursor cell cultures for disease-relevant modeling.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation by enabling flexible timing of culture generation.
- Aligns with translational biomarker studies requiring consistent primary cell sources.
- Reduces risk of biological drift in long-term research programs.
Pipeline & Workflow Integration
This cryopreservation protocol positions tissue banking as a foundational capability from early discovery through preclinical research, enabling on-demand generation of neuronal and glial cultures for diverse R&D needs.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway analysis with standardized primary cultures.
- Screening: Provides assay-ready cells for reproducible compound evaluation and quantitative analysis.
- Analytics: Enables consistent measurement of neuritic growth and network expansion across experiments.
- Translational Research: Facilitates alignment with disease models and biomarker studies using neural precursor-derived cultures.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable tissue resource for multiple projects and cross-functional teams.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in neuronal assays.
- Operational Value: Standardizes tissue processing, enhances reproducibility, and supports scalable workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality and capital efficiency by reducing biological risk.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of neurobiology programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in sterile tissue handling and primary cell culture techniques.
- Needs access to controlled-rate freezing equipment and liquid nitrogen storage.
- Demands cross-team standardization of tissue processing and labeling protocols.
- Adaptation may be needed for different brain regions or species.
- Cell yield and viability depend on precise block sizing and handling as described.
