マイクロインジェクションによる哺乳動物細胞におけるmRNA核外輸送の速度論の解析

この手順の全体的な目的は、哺乳類細胞におけるmRNAの核外輸送のキネティクスを測定することです。これは、まず哺乳類組織培養細胞の核内にmRNAまたはDNAをマイクロインジェクションすることによって達成されます。マイクロインジェクション後、さまざまな培養時間を経てサンプルを固定します。

次に、蛍光in situハイブリダイゼーション（FISH）によってmRNAを染色します。手順の最終ステップは、細胞を画像化し、細胞質および核内の蛍光量を定量することです。最終的に、マイクロインジェクションと蛍光顕微鏡法を組み合わせることで、mRNAの輸出速度を測定できます。

こんにちは。トロント大学生化学科のAlex Palazzo研究室のSRG AVです。同じくPalazzo研究室のStefan Toskiです。Palazzo研究室のAmyです。そして、Palazzo研究室のKhi Maha Davidです。

本日は、マイクロインジェクション法を用いて哺乳類培養細胞の核内にmRNAを導入する手順について解説します。また、蛍光in situハイブリダイゼーションによってmRNAを染色する方法についても実演します。当研究室では、これらの手法を用いて哺乳類細胞におけるmRNAの核外輸送のキネティクスを研究しています。

それでは開始しましょう。マイクロインジェクションを行う前に、あらかじめ調製したプラスミドDNAをインジェクションバッファーで50から200 µg/mLに調整します。次に、注入された細胞を識別できるように、Oregon Green 488（OG）が結合した70 kDaデキストランを混合液に加えます。

OG結合デクストランを用いることで、注入液のうちどれだけが核内に注入され、どれだけが細胞質へ漏出したかを判断できます。針先を塞ぐ可能性のある粒子状物質を沈殿させるため、サンプルを 13,000 G、4 °C で少なくとも 20 分間遠心分離します。書面によるプロトコルの基準に基づいて、マイクロインジェクションを行う哺乳類細胞株を選択してください。

このデモンストレーションシードでは、7つの細胞を使用します。マイクロインジェクションの少なくとも24時間前に、30 millimeterのペトリ皿に入った酸洗浄済みのカバーガラス上に細胞を播種します。インジェクション済みの細胞を容易に識別できるように、注入時の細胞単層は概ね70から90%のコンフルエント状態であることが理想的です。注入前に、200 microliterのプラスチック製ピペットチップを用いて細胞単層に傷をつけます。

カバースリップに十字の傷をつけ、注入前に組織培養インキュベーター内で少なくとも15分間細胞を回復させます。マイクロインジェクションには、マイクロインジェクション工程を妨げる振動を最小限に抑えるため、エアテーブル上に設置された倒立顕微鏡を使用してください。ペレットを乱さないよう、ワイドボアのゲルローダーチップを用いて、遠心分離後のサンプルの上層から約1 µLを除去します。

ピペットのチップを既製のマイクロインジェクション針の後端に挿入し、液体を吐出します。液体は毛細管現象によって針先へと吸い込まれます。5〜30秒以内に、針先付近にメニスカスが確認できるはずです。

液体が充填されたニードルをワンドに装着し、マイクロマニピュレーターで固定します。10倍の対物レンズを用いて、ニードルを45度の角度で視認し、焦点面付近の視野中心に配置します。粗動マイクロマニピュレーターのノブを使用して調整します。ワンドはチューブでガラス製シリンジに接続されており、このシリンジを用いてニードル先端から液体を放出させるために必要な圧力を発生させます。

一定の圧力を維持するため、シリンジをパイプクランプに固定します。2つのゴム栓と2つのメタルクランプを用いて、後続の工程での損傷を防ぐために針を数ミリメートル持ち上げ、その後、顕微鏡を後方に下げます。ピラーのシリンジプランジャーを押し下げて、圧力を高めます。

0.5から2 cubic centimeters。傷をつけた単層を含むカバーグラスを入れたペトリ皿を配置します。観察ステージ上で、顕微鏡を後方に引きます。

ピラーを直立位置まで前方に移動させ、コンデンサーを調整して、ニードルが液体に入るように合わせます。この際、カバーガラスでニードルが破損しないよう、慎重に行ってください。10倍対物レンズを使用して、交差傷の中心を確認し、注入する細胞の上にニードルを配置します。

対物レンズを40 xに切り替えて倍率を上げます。次に、ジョイスティックの微動調節ノブを使用して、針を下げて中心に合わせます。創傷の十字の角の一端から、針を下げて核に接触させ、注入を開始します。

注入されると、細胞の位相輝度に顕著な変化が現れます。傷跡の十字の端に沿って進めてください。可視化の際に注入された細胞を容易に識別するためには、各針に合わせて注入圧を適切に調整することが極めて重要です。

圧力は、細胞質膜および核膜を貫通させるのに十分な強さである必要がありますが、細胞を死滅させるほど高くしてはいけません。傷口の縁に沿って、一定時間、細胞をマイクロインジェクションします。習熟すれば、この時間内に数百個の細胞に注入することが可能です。

プラスミドDNAを注入した場合は、固定前に組織培養インキュベーター内でマイクロインジェクション済みの細胞を37 °Cで20分間インキュベートし、その後転写を停止させます。これは、増殖培地に溶解した1 µg/mLのα-amanitinで細胞を処理することで行います。この濃度により、マイクロインジェクションされたプラスミドからの転写を効果的に抑制できます。

細胞をインキュベーターに戻し、新しく合成されたmRNAを細胞外へ排出させます。1本の針を使用して、複数のカバーガラスに注入することが可能です。ただし、マイクロインジェクションに使用するDNAまたはRNAの種類を変更する場合は、針を交換する必要があります。

さらに、mRNAの核外輸送キネティクスを正確に測定するため、ニードルをワンドから外した後は廃棄してください。0分、15分、30分、60分、120分で個別のサンプルを固定します。適切な時間にalpha manin処理を行った後、培地を吸引し、2 mLのPBS溶液で細胞を2回洗浄します。

カバーガラスが液体に浸っていない時間を最小限に抑え、湿った状態を維持することが重要です。2 mLのPBS希釈4%アルデヒドを加え、室温で少なくとも15分間インキュベートして細胞を固定します。固定したサンプルをさらに2回洗浄した後、2 mLのPBS希釈0.1%Triton X 100を用いて細胞を透過処理し、同様に室温で少なくとも15分間インキュベートします。

最後に、ハイブリダイゼーションの準備として、サンプルをさらに2回洗浄します。25～60% formamideを含む1X SSC溶液の洗浄バッファーで、細胞を2回洗浄してください。次に、150 mmのペトリ皿の底を水で満たし、その上にパラフィルムを浮かべて、ハイブリダイゼーション用の染色チャンバーを準備します。

ディッシュを逆さまにして水を取り除き、パラフォームをディッシュの底に密着させます。染色する各カバーガラスから気泡を手動で取り除きます。ハイブリダイゼーション溶液を100 µLずつ、パラフォーム上にピペットで滴下します。

使用する魚類標本に合わせて、フォルマージュの量を最適化してください。ピンセットを用いて、固定細胞が載ったカバーガラスを30 mmのペトリ皿から取り出します。ワトマン濾紙を用いてカバーガラスの裏面を拭き取り、細胞を乾燥させないように注意しながら、表面の余分なバッファーを吸い取ります。

次に、カバーガラスを魚溶液の上に伏せて置きます。この工程を各カバーガラスに対して繰り返します。染色チャンバーの蓋を再び閉めた後、サンプルを37°Cで5〜18時間インキュベートします。

染色チャンバーと同様の方法で、洗浄チャンバーを数個準備します。各カバーガラスにつき、1 mLの洗浄バッファーを洗浄チャンバーのパラフィルム上にピペッティングします。インキュベーション後、1 mLの洗浄バッファーをピペッティングして、染色チャンバーからカバーガラスを取り出します。次に、カバーガラスの横に液体を置くことで、毛細管現象によって各サンプルの下に液体が引き込まれるようにします。

次に、ピンセットでカバーガラスを取り除き、室温で5分間インキュベートした洗浄バッファーの液滴の上にそれぞれ置きます。各カバーガラスをさらに2回洗浄し、計3回の洗浄を行います。あらかじめ洗浄したスライドガラス上に、DAPIを含む封入剤を10〜30 µLピペッティングします。1枚のスライドガラスに、ピンセットとワットマンろ紙を使用して2枚のカバーガラスを載せることができます。

カバースリップの裏面を乾燥させ、サンプルを乾燥させないように注意しながら、表面の過剰な液体を吸い取ります。各カバースリップを、封入剤の液滴の上に裏返して載せます。封入したサンプルは4 °Cで保存できます。

ここでは、さまざまな濃度のalpha mantinで前処理したNIH 3T3線維芽細胞における、注入されたプラスミドDNAの転写に対するalpha mantinの効果を示しています。これらの細胞にTFL s delta iプラスミドDNAおよびOG結合70 kDaデキストランを注入しました。各行は、OG 70 kDaデキストランおよびT uts delta I mRNAについて撮影された単一の視野に対応しています。

薬剤の高濃度ではT UTS delta I転写物の産生が完全に抑制された一方で、低濃度ではそのような現象は見られなかったことは明らかである。ここに、mRNA核外輸送のタイムコースを示す。7つの細胞にT UTS delta iプラスミドDNAとOG接合70 kilodaltonデキストランを注入した。

細胞を注入して30分後、α-マンチンで処理し、37 °Cで0分、60分、120分間インキュベートした。その後、細胞を固定し、T UTS delta I mRNAに対するプローブおよびERマーカーであるtrap alphaに対する抗体を用いて染色した。各行は、単一の細胞視野に対応している。

mRNA輸出の定量方法については、こちらのオンラインテキストをご参照ください。120分のタイムポイントを拡大して表示しています。ERにおけるTFS delta I mRNAの共局在を示すため、緑色のT UTS delta I mRNAと赤色のtrap alphaのオーバーレイを表示しています。mRNAとタンパク質を共染色する方法についての情報は、オンラインテキストでご確認いただけます。

マイクロインジェクションによるmRNAの核外輸送速度の測定方法について説明しました。この手順を行う際は、マイクロインジェクションを成功させるために適切な準備が不可欠であることを忘れないでください。DNAおよびRNAの調製、サンプルの調製、ニードルの抽出、光学機器の調整、およびマイクロインジェクションのトラブルシューティングなどの重要なステップについては、記述プロトコルに記載されています。

マイクロインジェクションしたmRNAのイメージングおよび解析を行う際は、注入液の90%以上が核内に導入された細胞のみを定量対象とすることが重要です。核への注入が成功したかどうかは、核および細胞質におけるorgan green dextranの分布を可視化することで評価できます。魚類用プローブの設計および、核および細胞質におけるmRNA分布の解析のための画像解析ソフトウェアの使用方法についての詳細は、オンラインプロトコルをご参照ください。

以上です。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りいたします。