マウス海馬スライス培養における単一細胞エレクトロポレーションによる遺伝子発現

皿の培養インサートで培養したマウス脳の海馬スライスから始めます。

スライスを含むインサートを切断し、顕微鏡下のエレクトロポレーションチャンバーに固定します。

過興奮を抑制し、細胞毒性を防ぐために、電位依存性ナトリウムチャネルブロッカーを含むバッファーでチャンバーを灌流します。

目的の遺伝子を持つプラスミドを含むピペットをスライスの近くに配置します。

膜のくぼみが形成されるまで、標的海馬ニューロンに近づいている間、ピペットの目詰まりを防ぐために陽圧を維持します。

負圧に切り替えて、メンブレンとのシールを作成します。

細胞の損傷を最小限に抑えるために、陽圧と負圧を交互に使用します。

エレクトロポレーションパルスを印加して膜を一時的に透過し、プラスミドの侵入を促進します。

陽圧を維持しながらピペットを引き出し、隣接する標的ニューロンに対してエレクトロポレーションを繰り返します。

エレクトロポレーションされたスライスを新鮮なインサートに移し、インキュベートして目的の遺伝子を発現させます。

エレクトロポレーション用のスライス培養物を調製するには、目的の培養インサートを900マイクロリットルの培地を充填した個々の3センチメートルのシャーレに移し、培養物を卓上二酸化炭素インキュベーターに入れます。次に、新鮮な培養インサートをインサートあたり1ミリリットルのスライス培地とともに3.5センチメートルのシャーレで少なくとも30分間プレインキュベートし、エレクトロポレーションリグのラインを10%漂白剤で5分間滅菌します。

灌流の最後に、イオン化オートクレーブ水でラインを少なくとも30分間すすぎ、0.001ミリモルのテトロドトキシンを含むフィルター滅菌aCSFで灌流します。エレクトロポレーターパルスをマイナス5ボルトの振幅、方形パルス、500ミリ秒の列、50ヘルツの周波数、500マイクロ秒のパルス幅に設定します。ガラスピペットに5マイクロリットルのプラスミド含有内部溶液を入れ、チップを数回軽くフリックして軽くたたいて、閉じ込められた気泡を取り除きます。

解剖顕微鏡を使用してチップが損傷していないことを確認し、ピペットチップを電極にしっかりと取り付けます。チップがaCSFに接触したら、エレクトロポレーターのピペット抵抗の読み出しを記録します。スライス培養物を単離するには、鋭利な刃で培養インサート膜を切断し、鋭角の鉗子を使用してスライス培養物をエレクトロポレーションチャンバーに慎重に移します。

次に、スライスアンカーで培養位置を固定します。目的の細胞のエレクトロポレーションでは、ピペットに口から陽圧を加え、3次元ノブコントロールを使用してピペットチップをスライス培養の表面近くまで操作します。顕微鏡で培養物を観察し、細胞表面にディンプルが形成されるまで陽圧を加えたまま、先端で標的細胞に近づきます。

ディンプルが見えるようにしたら、ピペットチップと原形質膜の間に緩いシールが形成されるように、口から軽度の負圧をすばやく適用します。メンブレンがピペットにわずかに入ります。スピーカーからのトーンの増加によって示されるように、ピペットの初期抵抗が約2.5倍増加することが観察されるはずです。

ンプルが再形成するように、素早く陽圧を再適用します。次に、一時停止せずに、先ほど示したように、少なくともさらに2つの圧力サイクルをすぐに完了します。最後の圧力パルスの後、負圧を1秒間保持します。

スピーカーからのトーンが安定したピッチの頂点に達したら、フットペダルを使用してエレクトロポレーターをすばやくパルスします。エレクトロポレーション後、圧力をかけずにピペットをセルから約100ミクロンほど静かに引っ込め、正圧を再適用して、抵抗がベースラインの読み出しと類似していることを確認してから、次のセルに近づきます。目的の細胞をすべてエレクトロポレーションしたら、スライス培養物を準備した新鮮な培養インサートの1つに移し、インサートを摂氏35度で最大3日間置きます。