Name: 一次運動とエレクトロポリ- L -乳酸ナノファイバー足場上で定義されているメディアの感覚ニューロンの文化 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-15T16:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 3 s
Description: 学ぶ 一次ラット感覚・運動ニューロンの電気紡糸ファイバー足場培養法。PLGA・PLLAナノファイバー上で神経突起伸長を誘導し、神経再生医療への応用可能性を示す。無血清培養と免疫細胞化学染色で形態変化を可視化する。

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NIH K08 EB003996

1。ソリューションをスピニングポリ- L -乳酸（PLLA） <ol><li>弱火で攪拌することにより9mLをクロロホルムで0.4グラムPLLAを溶かす。 </li><li> DMF 9:1（v / v）の：クロロホルム、4％PLLA（w / v）の溶液の最終濃度をもたらす、ソリューションに1 mLのジメチルホルムアミドを追加。 </li><li>鈍23ga先端に金属の付いたポリプロピレンまたはガラス製注射器内の溶液を置きます。 </li></ol> 2。基板の準備1スピニング <ol><li>弱火で撹拌することにより、クロロホルムの85:15 PLGA（ポリ乳酸 - コ - グリコール酸）の8％（w / v）溶液を加えます。 </li><li> PLGA溶液をそれぞれカバーガラスの表面を覆うことによりコートPLGAで清浄なガラスのカバースリップを。 PLGAは、薄膜（約30分）に乾燥することができます。 </li></ol> 3。エレクトロスピニング2 <ol><li>導電性カーボンテープでコレクタにPLGAコーティングされたガラスのカバースリップを固定します。整列繊維の場合、コレクタは、モータ駆動輪です。ランダム繊維の場合、コレクタは固定プレートです。 </li><li>コレクターの輪から先端部20 cmのポンプの場所の注射器。約2mL / hrにポンプを設定し、ホイールを使用して、300から400 RPMにモーターを設定した場合。可能であれば、コレクタと金属の先端〜+15 kVのに-2 kVのDCバイアスを印加。バイポーラ電源へのアクセスがない状態で、コレクタを接地してください。 </li><li>繊維は、シリンジの先端からジェット、回転する輪に収集します。繊維の所望の密度が得られるまで回転を続けます。スワイプ先端で目詰まりを防ぐために定期的に非導電性ロッドに固定されたペーパータオルで金属チップ。 </li></ol> 4。 1 Moating <ol><li>以下の紡績、カバースリップの周囲PLGAのラインをピペッティングにより"堀"エレクトロのサンプルを。 PLGAは乾燥することができます。これは、培養中の繊維の配向を維持します。 </li></ol> 5。タンパク質のコーティング<ol><li>エレクトロ繊維とガラスのコントロールは前の細胞培養へのタンパク質でコーティングする必要があります。少なくとも1時間のためのタンパク質溶液に基板をカバーし、過剰の溶液を吸引除去し、基質が乾燥しているまで、吸引続けます。可能なタンパク質溶液は、次のとおりです。PLL（ポリ- L -リジン）（100μg/ mL）を、ラミニン（25μg/ mLの）またはフィブロネクチン（50μg/ mL）を。 PLLが使用されている場合は、基材は滅菌水で洗浄し、初期コーティングに続く二回乾燥させる。 </li></ol> 6。 E15ラット胚3を入手する動物の使用や保管場所についてミシガン委員会の大学で承認されたとして、*全ての実験は、実験動物の管理と利用のためのNIHのガイドに従って行われた。 <ol><li>準備：動物が妊娠しているか確認してください。 3 mLのトリプシン、3 mLのFBSとL15の暖かいボトルを解凍。火災は、パスツールピペットを磨く。 30分間70％エタノールですべての手術器具を消毒する。 </li><li> （ 表1参照）メッキのメディアを準備して温める。 </li><li>安楽死：ケタミン/キシラジンのIP注入を実行します。 10〜15分待ってから、角膜とペダル撤退反射の欠如のために確認してください。反射神経が存在しないと、ペントバルビタール（FatalPlus）のIC注射を行います。 </li><li>テント腹部の皮膚。腹腔を露出する皮膚と筋肉の層を介してカット。子宮の位置を確認し、子宮頸部、卵巣でそれを切り離します。 </li><li>はさみで子宮から胚を取り出し、冷めないようにL15にすぐにそれらを置きます。 （次のすべての手順は、解剖顕微鏡および胚の下に完成されており、解剖コードは常に暖かいL15に浸漬する必要があります。）顎の周りと頭蓋骨の後頭骨下に鉗子を閉じることによって胚を斬る。 </li></ol> 7。解剖3 <ol><li>片側に胚を置きます。手足や腹部の臓器を離れて除去する他のセットを使用しながら鉗子の一組と脊髄を保護する。 </li><li>胚をオンにし、鉗子の一組とそれがそのままじっとしている。首から尾まで胚の長さに沿って切り取り、全体コードが露出するまで。 </li><li>慎重にコードの端をつかみ、削除するためにテールに向かって自分自身の上に引き出します。コー​​ドは、膜と接続された後根神経節（DRG）と無料のプルになります。 </li><li> DRGの外植片または解離性感覚ニューロンの文化が実行されることになっている場合、コードからDRGをチョキチョキと暖かいL15の新鮮な料理にそれらを転送する。 <ol><li>移植片培養をDRGの、25.9に進みます</li><li>解離性感覚ニューロンを培養するためには、手順9に進んでください</li><li>運動ニューロンの培養には、DRGは、ステップ7.5の膜で除去されます。 </li></ol></li><li>中敷の取り外しと同様、コードの先端にそれを把握し、それを剥がすことにより脊髄から膜を取り除く。すべての胚に対してこのステップを繰り返し、その後、小さな（2-3 mm）の部分にコード​​を切る。 </li></ol>5,6,7 <ol><li>ペレット片に2〜3分間1000 RPMで円錐とスピンに刻んだコードとL15を注ぐ。 </li><li>上清を捨て、ペレットコードにトリプシン3 mLを加える。 20分間37℃の水浴でインキュベートする。 </li><li>円錐と再ペレットに2〜3分間、1000rpmでスピンを3 mLのFBSを追加。 </li><li>上清と塗りFBSで火ポリッシュパスツールピペットを捨て。 </li><li>円錐形の一つパスツールL15のピペットフルを追加してから、解決策が目に見える塊と均一になるまで静かに砕いて粉末にする。泡を避けてください。 </li><li> L15でOptiprepの9％溶液を調製します。隔年胚（胚の数が奇数の場合は、切り上げ）のためにOptiprep液3mLでつのチューブを準備します。 </li><li>すべてのチューブの間で均等に分割し、Optiprep液に均質化ソリューションをドロップします。 15分間2000 rpmでチューブを回転させる。 </li><li>慎重に50 mLコニカルにおける各チューブとプールからの上位2 mLを収集する。 Optiprepの細胞をリンスして5分間1000rpmでL15とスピンで円錐形を塗りつぶします。 </li><li>上清を捨て、メッキのメディア（250〜500μl）を、少量の細胞を再懸濁します。生きている細胞を同定するためにトリパンブルー排除を用いて細胞を数える。 10.1に進みます</li></ol> 9。感覚ニューロン（SN）処理7 <ol><li>ペレットに2〜3分の作品のために1000 RPMでコニカルチューブに脊髄およびL15から削除DRGとスピンを注ぐ。 </li><li>上清を捨て、ペレットDRGにトリプシン3 mLを加える。 10分間37℃の水浴でインキュベートする。 </li><li>円錐と再ペレットに2〜3分間、1000rpmでスピンを3 mLのFBSを追加。 </li><li>上清と塗りFBSで火ポリッシュパスツールピペットを捨て。 </li><li>円錐形の一つパスツールL15のピペットフルを追加してから、解決策が目に見える塊と均一になるまで静かに砕いて粉末にする。泡を避けてください。 </li><li> 5分間1000rpmでホモジネートを回転させる。上清を捨て、Snめっきの小容量のリムーバブルメディア（250〜500μL）で細胞を懸濁します。生きている細胞を同定するためにトリパンブルー排除を用いて細胞を数える。 10.1に進みます</li></ol> 10。メッキと文化<ol><li>解離SNまたはMN文化のための： <ol><li>メディアの数滴を基板をカバーするとして細胞懸濁液の適切な量を追加します。解離細胞は低密度（25〜50細胞/ mm 2）で播種してください。細胞は培地をウェルの中にフラッディングする前に少なくとも1時間付着することができます。 </li></ol></li><li>移植片培養をDRGの： <ol><li>メディアの数滴を基板をカバーするには、メディアにDRGに追加します。それらが均等に（約4 DRGは、22x22 mmのカバースリップに収まる）基板上に分散されるようにDRGを手配する。 DRGは、メディアで井戸をフラッディングする前に少なくとも4時間のために付着することができます。 </li></ol></li><li>文化は、メディアを変更することなく、4日間まで維持することができます。長い文化のために、半分のメディアの変更は、フィードのメディアで行ってください。フィードメディアは、メッキのメディアマイナスL -グルタミンと同じ組成である。 </li></ol> 11。免疫細胞化学1,5,8 <ol><li>セルを修正する：吸引のメディアは、30分間のウォーム4％PFA（パラホルムアルデヒド）に置き換える。その後3X 5分1 × PBSで洗浄を行います。 </li><li>ブロッキング/透過化：ブロック/パーマ液（1 × PBSでウシ血清アルブミン1.25パーセント、0.05％トリトンX - 100、2.0％正常ヤギ血清）を準備します。吸引PBSと30分間のサンプルをブロック/パーマソリューションを適用する。その後1X 5分1X PBSの洗浄を行います。 </li><li>一次抗体：一次抗体希釈標準溶液調製（10％正常ヤギ血清、1.25％ウシ血清アルブミン、0.1％アジ化ナトリウム、0.05％トリトンX - 100をおよび1x PBSで10mLに）。一次抗体の適切な量を追加する（ 表2参照）。パラフィルムとの線、いくつかの料理。各基板のためパラフィルム上に一次抗体溶液の200μlのビーズを置きます。基板反転、（部屋にエアコンが付けまたは特に乾燥の場合は、水飽和一枚の紙が正常に機能している溶液の蒸発を防ぐために、料理のコーナーに追加できる）一晩一次抗体希釈標準溶液にそれらの細胞の側を下に浮いて。 </li><li>二次抗体：（ワーキング溶液は4℃で保存し、Cを収集して再利用することができます）プライマリから基板を除去し、2X 5分1 × PBSで洗浄を行う。 4時間PBS（また、パラフィルムが並ぶ皿の上に反転）で1:200に希釈した200μlの二次抗体を適用します。 </li><li> 2X 5分1 × PBSで洗浄を行う、セカンダリから削除します。でスライド上にマウント基板には、DAPIまたは別の適切な核のカウンタが含まれているゴールドが染色長くしてください。 </li></ol> 12。代表的な結果： 配向とランダムエルの典型的な形態ectrospun繊維を図1に示されています。我々は通常、このプロトコルで&gt; 90％のニューロンのMNの純度7,8を取得し、我々は、重要な線維芽細胞成長なしに限り一週間などのための文化をDRGの維持している。図2は、文化と免疫染色の24時間後のガラスと繊維の典型的なMNの外観を示しています。ガラスおよび繊維の3つの日間培養した免疫染色DRGを図3に示されている。 <img src="/files/ftp_upload/2389/2389fig1.jpg" alt="図1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図1"> 図1。ファイバのアライメントは、コレクタの選択によって操作されます。 A.））回転する車輪のコレクタとB.に紡糸繊維を揃えるランダム繊維は、固定プレートのコレクタ上にスピン。スケールバー= 20μmの。 <img src="/files/ftp_upload/2389/2389fig2.jpg" alt="図2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図2"> 図2。）PLLコーティングされたAの文化の24時間後にTuJ1（緑）およびDAPI（青）のために繊維とBを染色した代表的な運動ニューロン）ガラス。スケールバー= 20μmの。 <img src="/files/ftp_upload/2389/2389fig3.jpg" alt="図3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図3"> 図3。PLLコーティングされたAの3日間培養した後、ニューロフィラメントのための代表的なDRGのステンドグラス（緑））ガラスとB）繊維。スケールバー= 200μmの。 <table border="1"><tbody><tr><td> ストック溶液： </td><td> MNメディア： </td><td> DRG / SNメディア： </td></tr><tr><td>アルブミン10 mgのmL -1の </td><td> 12.5μL </td><td> - </td></tr><tr><td> 10 mgのmL -1のアポトランスフェリン</td><td> 50μlの</td><td> 40μlの</td></tr><tr><td> 50μgのmL -1の β-エストラジオール</td><td> 2.7μL </td><td> 2.2μL </td></tr><tr><td>は0.1 mg mL -1のビオチン</td><td> 50μlの</td><td> - </td></tr><tr><td> 16mgのmL -1のカタラーゼ</td><td> μlの8 </td><td> - </td></tr><tr><td>の15 mg mL -1の D -ガラクトース</td><td> 50μlの</td><td> - </td></tr><tr><td> 50μgの溶解-1ヒドロコルチゾン</td><td> 3.7μL </td><td> 2.9μL </td></tr><tr><td> 0.63ミリグラムmL -1のプロゲステロン </td><td> 0.5μL </td><td> - </td></tr><tr><td> 16mgのmL -1のプトレシン</td><td> 50μlの</td><td> - </td></tr><tr><td> 50μgのmL -1のセレン</td><td> 3.4μL </td><td> 4.1μL </td></tr><tr><td> 2.5mgのmL -1のスーパーオキシドジスムターゼ</td><td> 50μlの</td><td> - </td></tr><tr><td> * 500 ngのmL -1の神経成長因子</td><td> - </td><td> 1 mLの</td></tr><tr><td> * 100X PSN </td><td> 0.5mLの</td><td> 0.5mLの</td></tr><tr><td> * B27 </td><td> 1 mLの</td><td> 1 mLの</td></tr><tr><td> * 2 mMのL -グルタミン</td><td> 35μlの</td><td> 35μlの</td></tr><tr><td> * Neurobasal </td><td> 50mlまで</td><td> 50mlまで</td></tr></tbody></table> 表1：使用直前にメディアに（*）星を獲得したコンポーネントを追加します。残りのコンポーネントは、原液として調製し、6,7を必要とするまで-20 ° Cに保つことができる。 <table border="1"><tbody><tr><td> 一次（濃度） </td><td> ニューロン： </td><td> グリア： </td><td> 線維芽細胞： </td></tr><tr><td>抗β-チューブリン（TuJ1）（1:1000） </td><td> ✓ </td><td> X </td><td> X </td></tr><tr><td>抗ニューロフィラメント（1:1000） </td><td> ✓ </td><td> X </td><td> X </td></tr><tr><td>抗S - 100（1:250） </td><td> X </td><td> ✓ </td><td> ✓ </td></tr><tr><td>抗NGFR P75（1:500） </td><td> ✓ </td><td> ✓ </td><td> X </td></tr></tbody></table> 表2：一次抗体の選択は、研究者の目標に依存しています。上記は、いくつかの抗体と我々の研究室で成功を収めて使用した濃度です。 S - 100は、シュワン細胞の同定および/または繊維芽細胞を汚染するかどうかを確認、しかしそれはグリア細胞とfibroblasts4を区別するNGFR p75のと組み合わせて使用​​する必要があることに注意することは特に便利です。我々はまた、目標は、個々の神経突起を可視化するかどうニューロフィラメントまたはTuJ1が優れた選択肢である一方NGFR p75の汚れが非常に軽く神経突起ことに気づいた。

<ol><li>Corey, J. M., Gertz, C. C., Wang, B. S., Birrell, L. K., Johnson, S. L., Martin, D. C., Feldman, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+design+of+electrospun+PLLA+nanofiber+scaffolds+compatible+with+serum-free+growth+of+primary+motor+and+sensory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Acta.+Biomater%22%5BJournal%5D)">The design of electrospun PLLA nanofiber scaffolds compatible with serum-free growth of primary motor and sensory neurons.</a> Acta. Biomater. 4, 863-875 (2008).</li>
<li>Lin, D. Y., Johnson, M. A., Vohden, R. A., Chen, D., Martin, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tailored+nanofiber+morphologies+using+modulated+electrospinning+for+biomedical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Mat.+Res.+Soc.+Symp.+Proc%22%5BJournal%5D)">Tailored nanofiber morphologies using modulated electrospinning for biomedical applications.</a> Mat. Res. Soc. Symp. Proc. 736, D3.8.1-D3.8.6 (2003).</li>
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<li>Tan, S. -H., Kotaki, M., Ramakrishna, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+parameter+study+for+ultra-fine+fiber+fabrication+via+electrospinning+process%5BTitle%5D)+AND+%22Polymer%22%5BJournal%5D)">Systematic parameter study for ultra-fine fiber fabrication via electrospinning process.</a> Polymer. 46, 6128-6134 (2005).</li>
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</ol>

利害の衝突は宣言されません。

このプロトコルは、いくつかの重要なステップがあります。最初はエレクトロ繊維基材の適切な生産を伴います。液体培地では、PLLA繊維、PLGAフィルムおよびPLGAの堀は、単一ユニットとしてガラス製カバースリップから分離されます。 PLGAが省略された場合、PLLA繊維は、平らなシートは残りません - 彼らが使用不能にもつれに丸くなっています。従って、PLGA膜は培養中に光ファイバのアライメントを維持するために適切な基質として含まれています。堀は、繊維がしっかりとPLGA膜に固定されており、フィルムに構造的な剛性を追加することを保証するために両方のスピンの後に追加されます。基板は、固定染色し、実装時に操作される際に堀にも便利なハンドルとして機能します。粉砕は2番目に重要なステップです。あらゆる努力が泡の形成を回避するためになされるべきである。さらに、我々は、ファイアーポリッシュピペットはこのステップに使用される非常に高い利回りを得ている。研磨発生させるには、ブンゼンバーナーを点灯し、ピペットに電球を取り付けます。継続的に絞ると電球を放出しながら炎を迅速に2-3回をピペットの先端を渡す - ピペットを通る空気の流れが完全に閉じてから先端を防ぐことができます。穴が開いたままとエッジは使用前に少し丸み表示されるようになるようにピペットの先端を調べます。 エレクトロスピニングは、非常に汎用性の高いプロセスです。エレクトロスピニングのパラメータは、形態の様々な繊維を製造するように変更することができます。タンはら （2005）詳細PLLAエレクトロ繊維の直径に影響を与えるパラメータの体系的研究を。 Wang ら （2009）エレクトロPLLA繊維のアラインメントに影響を与えるパラメータの詳細な調査を提示。

<table><tbody><tr><td>PLLA</td><td>Boehringer Ingeheim</td><td>Resomer L210</td><td></td></tr><tr><td>PLGA 85:15</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>43471</td><td></td></tr><tr><td>L15</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>11415</td><td></td></tr><tr><td>アルブミン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2289</td><td></td></tr><tr><td>アポトランスフェリン</td><td>Akorn Inc</td><td>AK8227</td><td></td></tr><tr><td>ビオチン</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC 23009-0010</td><td></td></tr><tr><td>ガラクトース</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G0625</td><td></td></tr><tr><td>プロゲステロン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7556</td><td></td></tr><tr><td>プトレシン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5780</td><td></td></tr><tr><td>セレン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9133</td><td></td></tr><tr><td>&amp;#946;-エストラジオール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E 1132</td><td></td></tr><tr><td>ヒドロコルチゾン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H0396</td><td></td></tr><tr><td>カタラーゼ</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C40</td><td></td></tr><tr><td>スーパーオキシドディスムターゼ</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S4636</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>PSN</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>15640</td><td></td></tr><tr><td>L-グルタミン</td><td>Nalge Nunc international</td><td>1680149</td><td></td></tr><tr><td>トリプシン</td><td>Nalge Nunc international</td><td>1689149</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>26140</td><td></td></tr><tr><td>Optiprep</td><td>Accurate Chemical &amp;amp; Scientific Corporation</td><td>2011</td><td></td></tr><tr><td>PLL</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4832</td><td></td></tr><tr><td>フィブロネクチン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F 4759</td><td></td></tr><tr><td>ラミニン</td><td>Invitrogen</td><td>23017-015</td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>Anti-TuJ1抗体</td><td>BD Biosciences</td><td>556321</td><td></td></tr><tr><td>Anti-neurofilament抗体</td><td>EMD Millipore</td><td>AB1987</td><td></td></tr><tr><td>Anti-S100抗体</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2532</td><td></td></tr><tr><td>Anti-NGFR p75抗体</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N3908</td><td></td></tr><tr><td>正常ヤギ血清</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G6767</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>アジ化ナトリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8032</td><td></td></tr><tr><td>カーボンテープ</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>13073-1</td><td></td></tr><tr><td>Prolong Gold +DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>P36931</td><td></td></tr></tbody></table>

一次運動とエレクトロポリ- l -乳酸ナノファイバー足場上で定義されているメディアの感覚ニューロンの文化

The Culture of Primary Motor and Sensory Neurons in Defined Media on Electrospun Poly-L-lactide Nanofiber Scaffolds

エレクトロスピニングは、ナノスケールの繊維のマイクロに生成するためのテクニックです。繊維は非常に完全にランダムに整列から、アライメントの程度の差でエレクトロスピニングすることができます。さらに、繊維は、ポリ- L -乳酸（PLLA）のような生分解性ポリマーを含む様々な材料、から紡糸することができます。これらの特性は、組織工学における足場の様々なアプリケーションに適したエレクトロスピニングの繊維を作る。我々の焦点は、神経再生のための整列エレクトロ繊維の使用になります。我々は以前にアラインエレクトロPLLA繊維は、in vitroの両方の一次感覚と運動ニューロンの突起伸長を指示することを示している。我々はできるかぎり生体に見られるモデル実際の神経細胞への生体材料を評価する際に、初代培養細胞系の使用が不可欠であることを維持する。ここで、我々は、エレクトロスピニングの足場に、繊維状の足場と文化背根神経節の外植片だけでなく、解離性感覚および運動ニューロンをelectrospinする我々の研究室で使用される技術について説明します。しかし、エレクトロスピニングおよび/または文化ここに示す手法は、容易に他のアプリケーションでの使用に適合している。

整列エレクトロスピニングの繊維は、in vitroで神経細胞の成長を指示し、神経再生の足場の潜在的なコンポーネントです。我々は、エレクトロスピニングの繊維基材と初代ラットE15感覚（DRG）と運動ニューロンの無血清培養を調製するための手順を説明します。免疫細胞による神経細胞の可視化も含まれています。

一次運動とエレクトロポリ- L -乳酸ナノファイバー足場上で定義されているメディアの感覚ニューロンの文化

エレクトロスピン法は、マイクロからナノスケールの繊維を作製するための技術である。繊維は、高度に配向した状態から……まで、さまざまな配向度でエレクトロスピンすることが可能である。

配向した電紡BUN繊維は、in vitroにおいてニューロンの成長を誘導するため、神経再生スキャフォールドの潜在的な構成要素となります。本手法では、電紡BUN繊維スキャフォールドを作製し、その上でラット一次感覚ニューロンおよび運動ニューロンを培養します。まず、ガラスカバースリップ上に繊維状スキャフォールドを電紡法で作製します。その後、胎生15日目のラットから初代ニューロンを抽出し、電界紡糸（エレクトロスパン）ファイバースキャフォールド上で培養します。ニューロンを接着・増殖させた後、免疫細胞化学的手法を用いて固定および染色を行います。イメージングの結果、電界紡糸ファイバー上で培養されたニューロンの形態に変化が見られ、電界紡糸ファイバーのナノトポグラフィーが神経突起の伸展を誘導できることが示されました。形質転換細胞株の使用などの既存の方法に対するこの手法の主な利点は、初代ニューロンをin vitroで用いることで、形質転換細胞よりもin vivoにおけるニューロンの挙動をより密接に模倣できることです。これらの手法により、視聴者は電気生理学的ファイバーを他の細胞型に適用することが可能になります。あるいは、他の研究目的で培養した運動ニューロンや感覚ニューロンを使用したい場合もあるでしょう。一般的に、この手法に不慣れな方は、エレクトロスピンニングが非常に繊細な工程であるため苦労することがありますが、詳細は付属のビデオ記事で解説しています。エレクトロスピン繊維基板を準備するために、まず、クロロホルムを用いて、85:15のポリ乳酸-グリコール酸共重合体（PLGA）の8%溶液と、ポリ-L-乳酸（PLLA）の4%溶液を低熱で攪拌して作製します。次に、きれいなガラスカバースリップの表面をPLGA溶液でコーティングします。PLGAを薄膜になるまで乾燥させますが、これには約30分かかります。PLGAが乾燥したら、導電性カーボンテープを使用して、配向繊維を生成するためのモーター駆動ホイールまたはランダム繊維用の固定プレートに、PLGをコーティングしたカバーガラスを固定します。4% PLLA溶液を入れたシリンジを、コレクターから20 cm離れた位置にチップを向けた状態でポンプにセットします。ポンプを約0.22 milliliters per hourに設定します。ホイールモーターを300から400 rotations per minuteに設定します。コレクターに-2 kilovoltのDCバイアスを、金属チップに接触している導電板に+15 kilovoltsを印加します。バイポーラ電源のアースにアクセスできない場合は、コレクターを設置します。シリンジポンプを開始すると、ファイバーがシリンジの先端から噴射され、回転ホイール上に収集されます。目的のファイバー密度が得られるまで回転を継続してください。金属チップの詰まりを防ぐため、定期的に非導電性ロッドに取り付けたペーパータオルでワイプしてください。スピン後、カバースリップの周囲にPLGAラインをピペッティングします。これにより、実質的にエレクトロスピニング領域の周囲に「堀」を作ることになります。サンプルのPLGAを乾燥させます。これにより、培養中の繊維の配向性が維持されます。電界紡糸した繊維およびガラスコントロールは、細胞培養の前にタンパク質でコーティングする必要があります。これを行うには、基材をポリオール、リジン、ラミニン、またはフィブロネクチンで少なくとも1時間被覆します。その後、基材が乾くまで過剰な溶液を吸引除去します。ポリオールリジンを使用する場合は、最初のコーティングの後、基材を滅菌水で洗浄し、2回乾燥させる必要があります。乾燥後、基材を6ウェル組織培養プレートに配置し、電紡ファイバー上で育成させる細胞培養の準備を行います。安楽死させた妊娠ラットからE 15胚を採取します。まず、70% ethanolで患部を滅菌し、その後、腹部の皮膚を牽引して固定します。皮膚および筋肉層を切開し、腹腔を露出させます。子宮を確認し、子宮頸部と卵巣の部分で切り離します。子宮を滅菌ディッシュに移します。その後、ハサミで子宮から胚を取り出し、すぐに温めたL 15に移します。胚を斬首した後、一方のピンセットで脊髄を保護しながら、胚を横向きに固定します。もう一方のピンセットを使用して、四肢と腹部臓器を取り除きます。次に、胚を回転させ、片方のピンセットで固定します。頸部から尾部にかけて胚の長さに沿って切開し、脊髄全体を露出させます。脊髄の端を慎重に掴み、尾側に向かって折り曲げるように引き出します。これを取り出すには、コードを引っ張ると、膜と後根神経節が付着した状態で外れます。後根神経節の切片作成や、解離感覚ニューロン培養を行う場合は、コードから後根神経節を切り取り、温めたL 15が入った新しいディッシュに移してください。運動ニューロン培養の場合は、脊髄の前端にある膜をつかみ、下方に向かって剥がします。長い靴下を脱がせるようにして、すべての胚に対してこの操作を繰り返し、その後ピンセットを用いて脊髄を細かく切断し、運動ニューロン培養物を得ます。切断した脊髄とL 15をコニカルチューブに注ぎ、180 ×gで2〜3分間遠心分離します。上清を除去して断片をペレット化し、ペレット化した脊髄に3 mLのトリプシンを加えます。チューブを37 °Cのウォーターバスに入れ、20分間インキュベートします。インキュベーション後、円錐チューブに3 mLのFBSを添加します。次に、180 ×gで2～3分間遠心分離し、それを除去します。その間に、FBSをピペットで吸い込み、吐き出すことで、火炎滅菌したパステールピペットをFBSでコーティングします。これにより、トリチュレーション（分注）中に組織片がガラスに付着するのを防ぎます。遠心後、上清を除去します。次に、コニカルチューブにL 15をパステールピペット1杯分加え、溶液が均一になり、目に見える塊がなくなるまで、FBSコーティングしたピペットを用いて穏やかにトリチュレーションします。気泡が入らないように注意してください。胚2個につき、L 15で調製した9%opreを3 mL入れたチューブを1本用意します。胚の数が奇数の場合は、1滴追加してください。ホモジナイズした溶液をOptiPrep溶液の上に載せ、ホモジネートをすべてのチューブに均等に分注します。ホモジネートはOptiPrep溶液の上に、目に見える混濁した層を形成します。チューブを700 ×gで15分間遠心分離します。各チューブの上層 2 mLを慎重に回収し、50 mLコニカルチューブに移します。コニカルチューブにL 15を満たし、180 ×gで5分間遠心分離して、細胞からopreを洗浄します。上清を除去します。ペレットは目視ではほとんど確認できません。この段階で、Reeseは少量の播種用培地で細胞を懸濁してください。トリパンブルー排除法を用いて細胞数を算出し、生存細胞を特定します。これで細胞をプレートに播種する準備が整いました。感覚ニューロンの培養を得るには、90%以上のニューロン純度が期待されます。まず、脊髄から摘出した後根神経節をL 15と共にコニカルチューブに移します。遠心分離後、180 ×gで2～3分間遠心し、破片をペレット化します。上清を捨て、ペレット化したDRGに3 mLのtrypsinを加え、37 °Cのウォーターバスでインキュベートします。10分後、チューブをウォーターバスから取り出し、3 mLのFBSを加えて、180 ×gで2～3分間遠心し、再ペレット化します。その間に、火炎処理したパステールピペットをFBSでコーティングします。前と同様に、FBSコーティングしたピペットを用いてL 15を1ピペット分ペレットに加え、溶液が均一になり、目に見える凝集塊がなくなるまで穏やかにトリチュレーション（ピペッティング）します。均質化物を180 ×gで5分間遠心分離した後、気泡が入らないように注意してください。スーパーナタントを除去し、少量の感覚神経細胞用播種培地で細胞を再懸濁します。トリパンブルー排除法を用いて細胞数をカウントし、生存細胞を特定します。これで、感覚神経細胞または運動神経細胞の播種準備が整いました。まず、タンパク質コーティングされた電紡糸ファイバー基質に培地を数滴滴下して覆います。次に、適切な量の細胞懸濁液を添加します。解離した細胞は低密度で播種してください。ウェルに培地を満たしてインキュベーターに戻し培養を開始する前に、細胞をインキュベーター内で少なくとも1時間静置して接着させます。背根神経節（DRG）用には、タンパク質コートした電界紡糸ファイバー基質に培地を数滴滴下して覆います。その後、培地に背根神経節を添加します。背根神経節が基板上に均等に分布するように配置します。22 by 22 mmのカバーガラスには、約4個の背根神経節が収まります。背根神経節の培養物を37 °Cのインキュベーターに入れ、インキュベーション後、少なくとも4時間かけて接着させます。ウェルに培地を満たし、インキュベーターに戻します。培養物は、培地交換なしで最大4日間維持できます。より長期間培養する場合は、フィード培地を用いて培地を半分交換してください。培地は、L-glutamineを除いた播種用培地と同じ組成です。細胞が目的の時間点に達したら、付属の書面プロトコルの指示に従って免疫細胞化学染色を行うことができます。このSEM画像は、配向した電界紡糸繊維とランダムな電界紡糸繊維の典型的な形態を示しています。繊維の配向性は、コレクターの選択によって制御されます。回転ホイールコレクター上に紡糸された繊維は均一に配向することに留意してください。対照的に、静止コレクター上に紡糸された繊維はランダムな形態となります。これらの画像は、緑色で示されたβ-tubulinの運動ニューロン染色と、青色で示されたDPI核染色を示しています。PLLコーティングされたファイバーおよびファイバー上のガラスで24時間培養した後、運動ニューロンは通常、細胞体からファイバーの配向方向（この画像では左から右）に平行に伸びる少数の突起を有します。ファイバー上で培養された細胞の主要な突起は、同時間でガラス上で培養された細胞の主要な突起よりも大幅に長くなります。ガラス上の運動ニューロンは、通常24時間後に、細胞体から放射状に伸びるより多くの突起を有します。線維上で培養されたニューロンについては、これらの画像において、主要な突起はガラス上のものよりも長くなっています。背根神経節は、緑色で示されるニューロフィラメントで染色されています。PLLコートされたガラスおよびガラス上のファイバーで3日間培養した後、背根神経節から神経突起が放射状に伸びています。また、ファイバー上では隣接する神経突起の顕著な重なりも見られます。神経突起は神経節から放射状に伸びます。しかし、その後、方向を変えて配向した繊維の方向に沿って走行します。これらの手順を習得すれば、隣接する神経突起の重なりを大幅に減らすことができます。エレクトロスパンニングは約30分で完了し、運動ニューロンおよび感覚ニューロンは約2時間で得られます。この手順を行う際は、無菌操作を徹底することが重要です。ニューロンの生存率を最大化するため、移し替えのステップでは火炎滅菌したピペットを使用する必要があります。さらに、接着分子と電界紡糸繊維を適切な時間インキュベートすることが重要です。例えば、繊維をポリリシンで1時間未満しかコーティングしなかった場合、細胞接着を維持するためのコーティングが不十分になります。しかし、オーバーナイトなどポリリシンを放置しすぎると、繊維が分解する可能性があります。また、ほとんどの顕微鏡では、培養中のファイバー上のニューロンを可視化できないことを覚えておくことが重要です。これは、ファイバーとニューロンの突起が非常に似ているためです。このビデオを視聴することで、胚齢15日のラットから、電界紡糸ファイバー基板上に運動ニューロンおよび感覚ニューロンの一次培養を行う方法について、十分に理解できるはずです。高電圧を取り扱うことは非常に危険であるため、適切な注意が必要です。オペレーターが電界紡糸装置から隔離されるよう、常に十分な予防措置を講じてください。

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