免疫学的シナプス形成を介したT細胞のin vitro細菌トランス感染

オボアルブミンペプチドまたはOVApに特異的な受容体を発現するCD4⁺ T細胞を含むウェルから始めます。

ネガティブコントロールウェルに、多孔質メンブレンインサートを配置します。

チューブ内で、細菌に感染し、表面提示のためにOVApをロードした樹状細胞を取ります。

樹状細胞をテストウェルに直接添加し、ネガティブコントロールウェルのインサートに添加します。

ウェルに培地を加えてインキュベートします。

テストウェルでは、細胞が相互作用して免疫学的シナプスを形成し、樹状細胞から T 細胞への細菌の移動、つまりトランス感染として知られるプロセスを促進します。

陰性対照ウェルでは、膜バリアが細胞間相互作用を防ぎ、それによってトランス感染を阻害します。

抗生物質ゲンタマイシンをウェルに加え、インキュベートします。

ゲンタマイシンは真核細胞に浸透できないため、内在化されていない細菌のみを殺し、内在化した細菌は生き残ります。

感染したT細胞を含む試験サンプルと、感染していないT細胞を含む対照サンプルは、T細胞の分離とトランス感染の定量の準備が整いました。

24ウェル培養プレートに、5つのウェルのそれぞれに0.5ミリリットルの容量で200万個のCD4⁺ T細胞を追加します。

次に、物理的接触を制御するために、3マイクロメートルの孔径を持つポリカーボネートトランスウェルバリアを3番目と4番目のウェルに配置します。最初のウェルに、感染した過負荷樹状細胞を0.1ミリリットル加えます。2番目のウェルに、感染した非負荷樹状細胞0.1ミリリットルを追加します。

感染した過負荷樹状細胞を1つのウェルに0.1ミリリットル、感染した非負荷樹状細胞0.1ミリリットルをもう一方のウェルに加えます。最後に、陰性対照として、MOI 10でCD4⁺ T細胞の5番目のウェルに直接感染します。次に、RPMI を使用してウェルの総容量を 0.6 ミリリットルまで上げます。

プレートを30分間インキュベートして、免疫シナプスを形成します。インキュベーション後、培地1ミリリットルあたり100マイクログラムのゲンタマイシンを各ウェルに加え、1時間インキュベートします。ゲンタマイシンは、真核細胞に浸透できないアミノグリコシド系抗生物質です。

したがって、このステップでは、アミノグリコシドは細胞外細菌を殺しますが、細胞内細菌は殺しません。