RNAi発現菌の培養と維持

まず、事前に増殖したRNA干渉またはRNAi発現細菌を含むプレートから始めます。

これらの細菌は、抗生物質耐性遺伝子を含むプラスミドと、宿主の特定の遺伝子発現を阻害する二本鎖RNAまたはdsRNAを産生する標的遺伝子インサートを運びます。

滅菌ピンを使用して、コロニーを抗生物質を添加した培地を含むディープウェルプレートに移します。

プレートを振とうしながらインキュベートし、細菌の均一な増殖を実現し、深いウェルが通気を提供します。

抗生物質はプラスミドを欠く細菌を排除し、プラスミドを保有する細菌のみが生き残るようにします。

プレートを遠心分離して細菌を分離し、上清を廃棄します。

細菌を緩衝生理食塩水に再懸濁して安定させます。

再懸濁した細菌を、抗生物質と誘導剤の両方を添加した栄養豊富な培地を含むマルチウェルプレートに分注します。

抗生物質はプラスミド含有細菌を選択し、誘導剤はdsRNA発現を引き起こします。

RNAi発現細菌を播種したプレートは、さらなるアッセイの準備が整いました。

24ウェルのディープウェルプレートの単一ウェルで複数のRNAi細菌株を並行して試験するには、以前に調製した細菌を含むRNAiの各クローンから1つのコロニーを4ミリリットルのカルベニシリン添加LBに接種します。プレートを摂氏37度および950rpmでマルチウェルプレートに最適化された振とうインキュベーターに16時間入れ、 次に、2,000 gで5分間遠心分離して細菌を収集します。プレートを反転させ、激しく振って上清をデカントします。

100マイクロリットルのSベースを使用して、RNAi細菌を再懸濁します。再懸濁した細菌を、IPTGとカルベニシリンを添加したマルチウェルNGMプレートの適切な数のウェルにピペットで移し、プレートを乾燥させます。